Experiencia chilena de diagnóstico de laboratorio de sífilis. Dra. Patricia García Laboratorio de Microbiología Departamento de Laboratorios Clínicos

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1 Experiencia chilena de diagnóstico de laboratorio de sífilis Dra. Patricia García Laboratorio de Microbiología Departamento de Laboratorios Clínicos

2 DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO Larsen SA; Pope V; Johnson RE;Kennedy EJ. Manual of tests for Syphilis 1998 Detección de Treponema pallidum en tejidos * Diagnóstico definitivo a) Microscopía de campo oscuro* b) Detección con anticuerpos fluorescentes* c) Test de infectividad en conejo* d) Reacción en cadena de la polimerasa Pruebas Serológicas Diagnóstico presuntivo a) Detección de anticuerpos anti- cardiolipinas b) Detección de anticuerpos anti- Treponema pallidum c) Detección de DNA en sangre/lcr por PCR

3 Composición antigénica de Treponema pallidum Blanco et al. EID 1997; 3: Difosfatidil-glicerol (cardiolipinas): Componentes del tejido del hospedero (mitocondrias) incorporado a la bacteria. 2. Antígenos treponémicos: Lipoproteínas de OMP inmunodominantes: 47, 37, 35, 33, 17 y 15kD Proteínas de transmembrana PG PF=Flagelo periplásmico OS=membrana externa PG= péptidoglicano

4 DIAGNOSTICO DE SIFILIS: Dificultades Enfermedad que cursa en etapas Bacteria no crece in vitro Sifilis congénita Neurosífilis (1, 2 y 3 )- VIH Primaria Secundaria Terciaria Sintomática Asintomática Latencia Semanas Años

5 Detección de Treponema pallidum en tejidos y exudados MICROSCOPIA DE CAMPO OSCURO Método de diagnóstico definitivo. Test de elección cuando hay lesiones activas. Muestra fresca (<20 minutos): observar motilidad Raspado de lesiones sólo con suero fisiológico. sensibilidad analítica: 10 5 Tp/mL: Test (-) no descarta la enfermedad. Microscopio de campo oscuro y personal entrenado. No diferencia T. pallidum de otras especies no patógenas: No realizar en muestras orales o rectales

6 Serología: CONSIDERACIONES SIFILIS 1 : Respuesta humoral se inicia 1-3 semanas del desarrollo del chancro SIFILIS 2 : Altos títulos de anticuerpos Serología es complementaria a la observación directa. SIFILIS 3 : Títulos de anticuerpos disminuyen Serología es la única forma de diagnóstico Limitaciones: Baja sensibilidad en sífilis primaria y terciaria Baja sensibilidad en neurosífilis Difícil interpretación en el recién nacido Difícil interpretación en pacientes que han tenido sífilis

7 Serología: TEST NO TREPONEMICOS Microscópica: Macroscópica: VDRL ( Veneral Disease Research Laboratories) Requiere preparación diaria del antígeno Test validado el LCR: Baja sensibilidad (50%) RPR (Rapid Plasma Reagins) con carbón Disponible comercialmente

8 VDRL y RPR pueden ser usados cuantitativos Niveles de anticuerpos en suero de pacientes seguidos por 18 meses posttratamiento. Títulos varían entre VDRL y RPR por lo que la terapia debe ser evaluada con el mismo test inicial. Usualmente los títulos son mayores en test macroscópicos que en microscópicos.

9 Serología: RPR CUANTITATIVO Análisis comparativo UC-ISP SHIELD BEC_DICK VDRL Títulos varían entre VDRL y RPR: la terapia debe ser evaluada con el mismo test inicial. Usualmente los títulos son mayores en test macroscópicos que en microscópicos.

10 Serología: TEST TREPONEMICOS Test confirmatorios de no treponémicos: 1% Falsos (+) Antígenos: - De membrana externa de T. pallidum - Antígenos recombinantes No sirven para monitoreo de terapia: Ac persisiten No sirven para re-infección Sólo cualitativo No sirven en Neurosífilis?: FTA-Abs sería de utilidad 1. FTA- Abs ( Abs. Ac Treponémicos Fluorescentes) 2. MHA-TP ( Microhemaglutinación TP) 3. ELISA para Ig G, Ig M 4. Test rápidos (Latex inmunocromatográficos) 5. Inmunoensayos en línea (LIA) 6. Western blot

11 60 binomios madre /RN 43 Madres con sífilis en embarazo 43 RN con riesgo de sífilis congénita 17 madres VDRL F(+)/Serología residual 17 RN sin riesgo de SC 17 RN Sífilis congénita presuntiva 26 RN Sífilis congénita descartada 13 RN sólo serología (+) sin clínica sugerente 4 RN con serología (+) con clínica/alt Rx, alt LCR Madres adecuadamente tratadas MADRES RN MADRES RN MADRES RN 13/13 IgG (+) 13/13 IgG (+) 4/4 IgG (+) 4/4 IgG (+) 26/26 IgG (+) 26/26 IgG (+) 10/13 IgM (+) 0/13 IgM (+) 4/4 IgM (+) 3/4 IgM (+) 16/26 IgM (+) 0/26 IgM (-) Ig G permite descartar falsos positivos de test no treponémicos IgM materna no permite diferenciar a los RN que presentaran mayor riesgo de SC IgM RN (+) permite realizar diagnóstico precoz de SC Un resultado negativo no descarta la enfermedad.

12 Evaluación de métodos de diagnóstico para sífilis congénita 60 binomios madre/rn 120 muestras para análisis Captura Captura Ag sonicado Ag sonicado Ag recombinantes Inmunocromatográfico

13 Evaluación de métodos de diagnóstico para sífilis congénita Concordancia Test IgG= 90% 12 discordancias sólo para MHA-Tp: falsos (-) Concordancia Test IgM= 88% 3 discordancias absolutas: el (+) pathozyme y (-) Captia era SC sintomática Los 3 ELISA y el test inmunocromatográfico mostraron mejor sensibilidad que MHA-Tp Pathozyme M presenta mejor sensibilidad que Captia IgM en SC

14 Diagnóstico de sífilis congénita al momento del parto: Suero materno o sangre de cordón? Fernando Abarzúa, Cristián Belmar J, Alonso Rioseco R, Jacqueline Parada B, Teresa Quiroga G, Patricia García C. Departamento de Obstetricia y Ginecología Departamento de Laboratorios Clínicos Facultad de Medicina. Pontificia Universidad Católica de Chile En Prensa, Rev Chil Infectol

15 Descripción de los pacientes que ingresaron al estudio Junio Agosto 2000 Muestras suero materno y sangre de cordón Binomios atendidos Maternidad UC Screening con RPR Suero materno o Sangre de Cordón (+) Test Treponémicos confirmatorios MHA-Tp ELISA Captia IgG ELISA Captia IgM Visita por el especialista 37 reactivos (1.3%) Grupo I 11 binomios Grupo II 9 binomios Grupo III 17 binomios

16 Resultados de los test no treponémicos y treponémicos en los binomios partos Muestra en el binomio: (83%) Sólo muestra de cordon: 573 (17%) no reactivos (98.7%) 37 reactivos (1.3%) Grupo I 11 binomios Grupo II 9 binomios Grupo III 17 binomios 7/11 (64%) verdaderos (+) Sífilis materna 4/11(36%) falsos (+) RPR 9/9 (100%) falsos (+) RPR 11/17 (65%) falsos (+) RPR suero Madre 6/17 (35%) verdaderos (+) Sífilis materna 6 RN recibieron tratamiento 3 RN recibieron tratamiento

17 Resultados de los test no treponémicos según el tipo de muestra en que se realiza la pesquisa en los 9 casos catalogados como sífilis congénita 9 RN catalogados como sífilis congénita 9 SC / 2741 partos Tasa SC = 3.3/1000 RN vivos 6/9 (67%) RPR sangre materna R RPR sangre cordón R 3/9 (33%) RPR sangre materna R RPR sangre cordón NR

18 Detección de Treponema pallidum en sangre y LCR REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Varios PCR dirigidos hacia distintas regiones: a) Año 1991: Grupo de la Universidad de Texas PCR que amplifica el gen que codifica para la OMP de 47 kd. Sensibilidad analítica de microorganismos (no mejor que RIT) b) Año 1997: Grupo de la Universidad de Washington PCR transcriptasa reversa (TR-PCR): de la sensibilidad (10-3 Tp) pero PCR a partir de RNA son laboriosos y riesgo de contaminación. c) Año 2001: Grupo del CDC PCR dirigido contra el gen de DNA polimerasa I: alta sensibilidad y especificidad.

19 Detección de Treponema pallidum en LCR y suero por PCR en el diagnóstico de Sífilis congénita y neurosífilis Gen de T. Pallidum 47 kd pb Producto de PCR pb Sonda interna Target: Fragmento de 658 pb del gen que codifica para la Lp de 47kD. Muestra: sangre, LCR; LA y orina Lisis: alcalina Extracción: Fenol-cloroformo c/ppt Detección producto PCR: EGA y Dot blot (Especificidad) Límite de detección: Menor que RIT. Problemas con inhibidores en la muestra Sanchez PJ; Wendwl GD; Grimprel E, et al.. JID 1993 ;167:

20 Detección de Treponema pallidum en LCR por PCR y WB en el diagnóstico de neurosífilis García P, Araya L. Soto J, Poggi H, Lagos M, Vásquez P, Urra L, León P, Pérez C. Depto. Laboratorios Clínicos, Depto. Medicina Interna, Pontificia Universidad Católica de Chile. Neurología, Infectología, Hospital San Juan de Dios. Laboratorio Espiroquetas, ISP

21 Detección de Treponema pallidum en LCR por PCR y WB en el diagnóstico de neurosífilis 32 pacientes con infecciones del SNC LCR claro 17 pacientes con sospecha de neurosífilis 5 m.herpética, 5 m. tuberculosa y 5 m. criptocococica VDRL (+) en LCR 15 WB (-) IgM por WB para 4 proteínas recombinantes de Tp rtpn47, rtpn17, rtpn15 y rtmpa 3 niños con sospecha de sífilis congénita 14 adultos 3 WB (+) 12 WB (+) 2 WB (-) VDRL R 1:8

22 Diagnóstico de la infección por T. pallidum en pacientes con sífilis mucocutánea y pacientes con neurosífilis mediante reacción en cadena de la polimerasa. Resultados Preliminares García P, Grassi B, Fich F, Araya L, Salvo A. Soto J, Poggi H, Lagos M, Vásquez P, Urra L, León P, Pérez C. Depto. Laboratorios Clínicos, Depto. Dermatología, Depto. Medicina Interna, Pontificia Universidad Católica de Chile. Neurología, Infectología, Hospital San Juan de Dios. ETS Hospital Sótero del Río Laboratorio Espiroquetas, ISP Junio 2007 Presentado en el XXIII Congreso Chileno de Infectología

23 Antecedentes: La Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) permite detección directa de ADN bacteriano alternativa para diagnóstico de sífilis mucocutánea (SMC) y neurosífilis (NS) 2 parejas de partidores para genes tpn47 y pola Sensibilidad descrita para úlceras >95% para LCR 31 65% Objetivo: Implementar la reacción en cadena de la polimerasa de Treponema pallidum para el diagnóstico de sífilis mucocutánea y neurosífilis.

24 Junio 05 Julio 07 SMC NS Muestras: úlceras de piel y mucosas Diagnóstico: clínica, RPR en suero y MCO Muestras: LCR Diagnóstico: clínica, VDRL en LCR, respuesta a tratamiento y ausencia de otra enfermedad. PCR 3 parejas de partidores: 1 tpn47 y 2 pola Sensibilidad analítica: cepa de Referencia (Nichols) Sensibilidad clínica: muestras de pacientes

25 Resultados Evaluación Sensibilidad Analítica: Partidores para tpn47 1,75 espiroquetas/tubo 10 veces superior que una pareja de partidores para pola 100 veces superior a la otra pareja de partidores para pola K03-K04: partidores 47kDa F1-R1: partidores pola

26 Resultados neurosífilis 30 pacientes con Sospecha NS 7 Diagnóstico NS = 86% VIH(+) = 57% Cel. = = 29% VDRL = 1/2 a 1/8 23 otras enfermedades = 78% VIH(+) = 70% Cel. = 4% VDRL = NR NS (+) NS (-) Total PCR (+) PCR (-) Total Sensibilidad = 3/7 = 43% Especificidad = 0/23 = 100%

27 Resultados sífilis mucocutánea PCR (+) PCR (-) Total *1 PCR inhibido SMC (+) 13 2* 15 SMC (-) Total : PM 2: CN 3: LCR paciente 4: LCR paciente 5: Lesión plantar 6: CN 7: CP (1/1000) 1: PM 2: CN 3: Ulcera glande 4: Ulcera perianal 5: CP (1/1000) 6: CP (1/1000) 12/15 tenían microscopía de campo oscuro (MCO): 5/12 fue positiva. Sensibilidad:42% Fue negativa en las 2 muestras negativas por PCR Sensibilidad = 13/15 = 87%% Especificidad = 0/5 = 100%

28 DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO Conclusión Test no treponémicos cuantitativos permiten el seguimiento del tratamiento (con el mismo test). Están disponibles comercialmente Test treponémicos con excelente rendimiento para confirmación y sífilis 3 o latente. En sífilis congénita IgM (ELISA) puede ser de gran utilidad en suero. El screening al momento del parto debe ser realizado en sangre materna y no con sangre de condón. PCR ni WB no ha mostrado ser mejor que VDRL para el diagnóstico de neurosífilis en LCR. PCR excelente test para diagnóstico de sífilis mucocutánea, donde la MCO sólo tiene una sensibilidad < 50%

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