HEMOGRAMA AUTOMATIZADO. BQCO. GONZALO OJEDA HEMATOLOGÍA CLÍNICA FaCENA UNNE 2013

Transcripción

1 HEMOGRAMA AUTOMATIZADO BQCO. GONZALO OJEDA HEMATOLOGÍA CLÍNICA FaCENA UNNE 2013

2 AUTOMATIZACIÓN EN HEMATOLOGÍA Exactitud Precisión Rapidez Standarización Screening

3 TOMA DE MUESTRA Y PROCESAMIENTO Sangre entera(edta-k3) Volumen requerido Procesamiento dentro de las 8 h Conservar refrigerada Temperatura ambiente

4 PRINCIPIOS DE MEDICION Impedancia Eléctrica Espectrometría de Absorción Citometría de Flujo Dispersión óptica Fluorescencia Citoquímica: Peroxidasa

5 EQUIPOS IMPEDANCIA + ESPECTROMETRÍA ABSORCIÓN : COULTER (RBC-INDICE HEMATIMÉTRICOS PLT WBC HB) IMPEDANCIA + RADIOFRECUENCIA + ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN: 3 DIFF IMPEDANCIA + RADIOFRECUENCIA + ESPECTROMETRÍA + DISPERCIÓN DE LUZ/FLUORESCENCIA/ OTRA : EQUIPOS 5 DIFF

6 PRINCIPIO COULTER Wallace Coulter ( )

7 IMPEDANCIA ELECTRÓNICA Y RADIOFRECUENCIA Impedancia electrónica o la resistencia a la corriente continua (cc) de bajo voltaje fue desarrollada por Wallace Coulter en la década de 1950 y es la metodología utilizada con mayor frecuencia La radiofrecuencia (RF) o la resistencia a la corriente electromagnética de alto voltaje a veces se utiliza junto con la impedancia electrónica de la CC.

8 IMPEDANCIA ELECTRÓNICA El principio de impedancia en el recuento de células se basa en la detección y medición de cambios en la resistencia eléctrica producida por las células cuando atraviesan una apertura pequeña Las células suspendidas en un diluyente conductor de la electricidad,se arrastran a través de una apertura (orificio) en un tubo de vidrio

9 RECUENTO DE PLT Y RBCs

10 Impedancia Volumétrica N Pulsos :proporcional al N de células Amplitud del pulso :proporcional al tamaño de la célula

11 El numero de pulsos es proporcional al numero de células contadas El tamaño del pulso de voltaje es proporcional al tamaño de la célula (volumen) Lo que permite la discriminación y el conteo de células de tamaño especifico

12 INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS SANGUINEOS.

13 CLASIFICACION DE LOS IMPULSOS ELECTRICOS GENERADOS POR RBC Y PLT. RBC`s Plaquetas.

14 Los pulsos se reúnen y ordenan (canalizan) según su amplitud mediante analizadores de la altura de pulsos Los datos se trazan en un grafico de distribución de frecuencias o histograma de distribución de tamaño con el numero relativo en el eje de las y el tamaño ( numero del canal equivalente al tamaño especifico) en el eje de las x El histograma producido representa la distribución del volumen de las células contadas

15 Histograma de Eritrocitos

30 INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS SANGUINEOS.

31 INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS SANGUINEOS. Limite flotante para división de PLQ/RBC Media MCV Ancho de Distribución

32 Conteo por impedancia: RBC y PLT PLQ's MCV Zona Microcitica. Zona Macrocitica. Linfocitos

33 Conteo por impedancia: RBC y PLT. PLQ's Ancho de Distribución Eritrocítica

34 ADE RDW INDICE DE ANISOCITOSIS La amplitud de distribución eritrocitaria (RDW) se calcula a partir del histograma como el coeficiente de variación de la distribución del volumen eritrocitario. Con valores de referencia de % El RDW es un índice de anisocitocis, que en realidad refleja la relación entre la desviación estándar y el VCM El VCM es un promedio tomado de los datos de distribución eritrocitaria de tamaño.

35 Qué significa RDW? RDW Ancho de la distribución de la curva de los eritrocitos Dos fórmulas matemáticas usadas para describir la variación de tamaño de los eritrocitos (Anisocitosis).

36 RDW-CV Definición: Es el coeficiente de variación alrededor de la media (X) correspondiente a la curva de distribución del volumen de los glóbulos rojos VR: %

37 RDW-SD Definición: Medida directa (en fl) del ancho de la curva de los glóbulos rojos (RBC) Tomada 20% arriba de la línea base El ancho es medido al 20% de la altura relativa. A esta altura es donde se encuentra la mayor variación de tamaños de las células

38 RDW-SD Altura relativa Histograma de Eritrocitos La curva más ancha Representa a la población Con mayor anisocitosis 20% Tamaño de los Eritrocitos en fl

39 Conteo por impedancia: RBC y PLQ. Macrocitosis

40 Conteo por impedancia: RBC y PLQ. Macrocitosis. MCV aprox. de 102 fl

41 Conteo por impedancia: RBC y PLQ. Microcitosis

42 Conteo por impedancia: RBC y PLQ. Microcitosis. MCV Aprox de 70 fl

43 FACTORES QUE PRODUCEN INTERFERENCIA FACTORES PARÁMETRO AFECTADO Crioaglutinina GR,VCM,CHCM Aglutinaciòn de GR Lipemia,ictericia,quilomicrones Hb HbCM La turbidez afecta la lectura espectrofotomètrica

44 Hemólisis GR, Hto Gr lisados y no contados GR resistentes a la lisis con Hb anormales Microcitosis o esquistocitos GR nucleados,fragmento de Megacariocitos GB, Hb GR GB Gr (Hb : S,C,F) no pueden lisarse y se cuentan como GB El tamaño eritrocitario < que el umbral Se cuentan como GB

45 Histograma de plaquetas.

46 Histograma de plaquetas. Límite para la zona de plaquetas. Zona para cálculo del. VPM Límite flotante para división de PLQ/RBC 2 fl Plaquetas 35 fl

47 Histograma normal de plaquetas

48 INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS SANGUINEOS. Histograma normal de plaquetas. El punto de partida debe ser 2 fl en la base del histograma

49 INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS SANGUINEOS. Histograma normal de plaquetas. El VPM es la media aritmética de la población de plaquetas. No será calculado en presencia de alertas de plaquetas

50 INTERPRETACION DE HISTOGRAMAS SANGUINEOS. Histograma normal de plaquetas. El histograma debe hacerse asintótico con la horizontal hacia los fl

51 ALARMAS PARA RBC Y PLT RBC/MORPH LRI URI LURI

52 PSEUDOAGLUTINACIÓN CON EDTA IMPORTANCIA DEL FROTIS DE PUNTA DE AGUJA RECUENTO VS ESTIMACIÓN

53 RECUENTO POR IMPEDANCIA DE WBC

54 RECUENTO DE LEUCOCITOS El conteo se realiza en un transductor de Von Behrens. Los impulsos eléctricos detectados son clasificados y almacenados en un histograma con canales de 1 fl de ancho

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56 SOBREESTIMACIÓN POR PRESENCIA DE ERITROBLASTOS Ej: WBC /mm3 200 eritroblastos por cada 100 GB 300 (WBC+EB) x= Gb corregidos= Gb contador (Gb contador x 100) (EB+100)

57 Conteo por impedancia: WBC. Histograma Normal de Leucocitos por Impedancia

58 Conteo por impedancia: WBC. Histograma Normal de Leucocitos por Impedancia. LIM MID GRAN

59 Conteo por impedancia: WBC. Histograma Normal de Leucocitos por Impedancia. Ubicación Normal del pico LIM es entre fl

60 Conteo por impedancia: WBC. Histograma Normal de Leucocitos por Impedancia. MID La región MID debe ser un valle entre las regiones LIM y GRAN

61 ALARMAS

62 DOSAJE DE HEMOGLOBINA Se utiliza el sobrante de la dilución con que se realizó el conteo de WBC. Método de la Cianmetahemoglobina Se realiza la lectura en la celda de hemoglobina a 540 nm con un blanco para cada muestra. El valor de absorbancia obtenido se interpola en la curva de calibración almacenada en el instrumento.

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64 DISPERSIÓN ÓPTICA

65 Una corriente de muestra centrada en forma hidrodinámica se dirige a través de un cuarzo para flujo celular por el que pasa una fuente de luz centrada (un láser de helio neón polarizado en sentido vertical). La luz dispersada se divide en varios ángulos Se utilizan varias combinaciones de estas mediciones para diferenciar y cuantificar las cinco subpoblaciones leucocitaria principales :neutrófilos,linfocitos,monocitos, eosinófilos y basófilos

66 Enfoque hidrodinámico Minimiza la acumulación de proteínas Elimina la circulación retrograda Reduce la irregularidad de la altura de pulso Reduce la perdida por pasaje coincidente

67 Enfoque analítico Iluminado por medio de un laser helio neón Enfocado hidrodinámicamente a traves de una celda de flujo de diseño especial Medición de las carácteristicas de dispersión óptica de la luz para las celdas individuales

68 Separación por dispersión polarizada con múltiples ángulos (M.A.P.S.S). -La dispersión frontal de luz 0 :se usa para determinar el TAMAÑO CELULAR (FORWARD SCATTER) -La dispersión ortogonal de 90 : para determinar la LOBULARIDAD CELULAR. (SIDE SCATTER) -La dispersión de la luz en ángulo estrecho de 10 :se correlaciona con COMPLEJIDAD CELULAR (SIDE SCATTER) -La dispersión de luz despolarizada de 90 (90D) para evaluar la GRANULARIDAD CELULAR.

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70 El citograma MAPSS final muestra los eventos de celdas individuales los cuales se definen por medio del uso del color

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72 TECNOLOGIA CVS

73 La muestra una vez tratada es dirigida a una celda de flujo (Flow cell) en la cual por el diseño hidrodinámico, los leucocitos se alinean y pasan formados uno a uno y en donde se realizan las siguientes mediciones

74 Volumen Mediante impedancia de baja frecuencia se determina el volumen de la célula Impedancia (resistencia a la cc de bajo voltaje)

75 Conductividad La densidad interna de la célula es proporcional al tamaño del pulso o al cambio de la señal de Radiofrecuencia RF(ola resistencia a la corriente magnética de alta voltaje)

76 Scatter La dispersión (scatter) de luz láser indica la estructura y forma de la célula

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78 Los cambios de voltaje de CC y RF pueden detectarse en forma simultánea Pueden graficarse en forma comparativa la impedancia y la conductividad :se forma Un citograma de distribución bidimensional,este trazado de dispersión muestra poblaciones celulares como cúmulos <por análisis computarizado se determinan los recuentos celulares

79 DF1: Volumen vs. Scatter El trazado de dispersión de la función de discriminación DF1 del volumen vs dispersión de la luz muestra. una separación clara de Nt,L y, Mo, Eo

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82 Sysmex XS-1000i

83 Descripción del Cell Dyn 3200 Tecnología óptica :PLT,WBC;RBC Tecnología diferencial MAPSS Reticulocitos

84 OTRAS TECNOLOGÍAS

85 Tecnología para Hemoglobina Reactivo libre de cianuro Grupo hidrofóbico del SLS que se une a la molécula de la globina Ocurre un cambio de configuración Oxidación de Fe 2+ --> Fe 3+ Grupos Hidrofílicos de SLS se unen a Fe --> SLS-Hb Fe 2+ Fe 3+ Fe 3+ SLS

86 Sysmex XS-1000i Tecnología En los Xs el Hto se mide electrónicamente, basado en el principio de que el pulso producido cuando un Gr pasa a través de la apertura es proporcional al volumen de la célula El Hto se determina comparando el volumen total o acumulado de Gr con el volumen de sangre completa en la dilución

87 Por Citometría de Flujo se obtiene información acerca de la composición y madurez celular Fluorescencia Información del contenido de RNA y DNA Dispersión lateral Láser Información de la estructura interna Dispersión frontal Tamaño de la célula

88 Sysmex XS-1000i Tecnología

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90 Cuantificación de Gránulos Inmaduros Información útil sobre el diferencial extendido de leucocitos IG: promielocitos mielocitos metamielocitos Maduración de neutrófilos Blastos promielo mielo metamielo bandas segmentos IG

91 Cuantificación de Gránulos Inmaduros IG Master Canal del diferencial Normal IG %, # Dispersión lateral

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93 Detección de los RBC resistentes a la hemólisis

94 Conteo óptico nucleado NOC

95 Análisis óptico de las plaquetas Por medio del uso de un enfoque de dispersión óptica de la luz con ángulo dual se logra una buena separación de los GR y las plq Ademas, la presencia de los cúmulos de plq se puede detectar en forma confiable

96 Medida de los eritroblastos Los EB son contados y separados de los WBC basados en su tamaño y cantidad de fluorescencia

97 Recuentos de Reticulocitos Método de Referencia: Azul de Metileno Variación entre observadores Altos coeficientes de variación Laboriosos Métodos automatizados Azul de metileno Fluorescentes

98 Canal reticulocitos - Fluorescente RETSEARCH II (Diluyente + Colorante) WBC Tinción: Polimetino: ARN Oxazina: ADN Fl muy alta RET Fl alta RBC Fl baja

99 Canal de los reticulocitos

100 Utilidad Clínica - FIR.Confirmación de Anemia Aplástica.Permite la clasificación de anemias por su capacidad eritropoyética.talasemia vs. deficiencia de Hierro.Anemia de los procesos crónicos.hipoproducción vs. respuesta eritroide temprana.detección de implante correcto luego de transplante

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102 Contenido de Hb de los reticulocitos Ret-He Reticulocitos con contenido de Hb <28pg Hipocrómicos Son identificados con colorantes fluorescentes por la posición en el dispersograma de acuerdo con la fluorescencia y la luz dispersada frontalmente

103 Contenido de Hb de los reticulocitos Ret-He

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