11 knúmero de publicación: kint. Cl. 7 : A61K 31/12

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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 7 : A61K 31/12 A61P 3/00 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 knúmero de solicitud europea: k Fecha de presentación: k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Chalconas y sus éteres con actividad antiproliferativa en los tumores de útero, ovario y mama. kprioridad: IT MI k Titular/es: INDENA S.p.A. Viale Ortles, Milano, IT k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Bombardelli, Ezio; Mancuso, Salvatore y Delle Monache, Franco k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Carpintero López, Francisco ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 DESCRIPCION Chalconas y sus éteres con actividad antiproliferativa en los tumores de útero, ovario y mama. 1 2 La presente invención se refiere a los ésteres de chalconas con ácido acético, butírico, palmítico y ximenínico o a los complejos de chalconas con fosfolípidos, relacionados con el tratamiento y prevención de los tumores de útero, ovario y mama, así como a las formulaciones que los contienen. Recientemente, se ha demostrado que algunos flavonoides tienen actividad anticancerosa (Cancer Research 48, 74, 1988) y actividad quimiopreventiva en algunos tumores (J Nat Prod 3, 23; 1990). En particular, se ha demostrado que la quercetina, un flavonoide casi ubicuo en las plantas, tiene una cierta actividad inhibitoria sobre la proliferación de las células de leucemia humana (Br J of Haematology 7, 489, 1990) y de otras líneas celulares (Br J of Cancer 62, 942, 1990; Int J Cancer 46, 1112, 1990; Cancer Chemother Pharmacol 28, 2, 1991; Gynecologic Oncology 4, 13, 1991, 1992), además de una acción sinérgica con los productos quimioterápicos convencionales. Aunque se desconoce el mecanismo de esta acción inhibidora sobre la proliferación, es probable que esté relacionado con la interacción de este flavonoide con los receptores de estrógenos de tipo II (J Steroid Biochem, 71, 1988). Clark describió estos loci por primera vez (J Biol. Chem 23, 76, 1978) en 1978 en el útero de rata, y demostró que,sibien muestran la misma especificidad por los esteroides y tejidos, son distintos de los receptores de estrógenos (RE) verdaderos, ya que se encuentran en una concentración mayor que éstos y tienen una constante de afinidad-disociación aparente más baja para el estradiol (KD: - mm frente a 0,2-1,0 nm para los RE). Los compuestos con estructura chalcona isocordoína, 4-hidroxiderricina, 2-hidroxiderricina, 3- hidroxiderricina, 2 4 -dihidroxichalcona, 4,2,4 -trihidroxichalcona y cordoína tienen una afinidad notable por los receptores estrogénicos de tipo II, junto a una importante actividad antiproliferativa sobre las líneas tumorales de útero, ovario y mama. Las estructuras de los compuestos citados anteriormente son las siguientes: 3 4 R1 R2 R3 R4 R S1 Isocordoína H H Prenilo H H 0 S2 4-hidroxiderricina Me OH Prenilo H H S3 2-hidroxiderricina Me H Prenilo OH H S4 3-hidroxiderricina Me H Prenilo H OH S 2,4 -dihidroxichalcona H H H H H S6 4,2,4 -trihidroxichalcona H OH H H H S7 cordoína Prenilo H H H H 2

3 Otras chalconas estrictamente relacionadas con las primeras, en lo que se refiere a la estructura química, como 4-hidroxicordoína y dihidroxordoína, cuyas estructuras se exponen más adelante, no muestran afinidad por los receptores mencionados anteriormente. 1 Chalconas R1 R2 R3 S8 4-hidroxicordoína Prenilo OH H 2 3 S9 dihidrocordoína Prenilo H H Los compuestos (I) se pueden preparar según los métodos convencionales descritos en Il Fármaco, 449-, 197; Il Fármaco 32, , 1977; Il Fármaco, , 197. La afinidad de los compuestos I por los receptores estrogénicos de tipo II y la actividad antiproliferativa sobre las células de tumor ovárico se resume en la Tabla siguiente. TABLA Afinidad de unión a los receptores estrogénicos de tipo II y actividad antiproliferativa sobre células de cáncer OVCA 433 in vitro Chalconas CI oo 0 (µm) CI ooo 0 (µm) S S S S S S S oo Concentración que consigue una inhibición del 0 % de la proliferación celular ooo Concentración que consigue un desplazamiento del 0 % del estradiol marcado ( nm) del receptor. 3

4 La evaluación de la unión al receptor estrogénico se ha realizado con células tumorales de ovario y otros órganos. Las células se hicieron crecer en un cultivo monocapa con el medio esencial mínimo al que se añadió suero bovino y 0 unidades/ml de penicilina para mantener el medio estéril. Para hacer que las pruebas fueran reproducibles, se añadió tripsinaalascélulas cada semana y se colocaron en placas con una densidad de 8 x 4 y se incubaron a 37 C con una atmósfera que contenía un % de CO 2 y humedad. Para evaluar la actividad de los compuestos, las células se colocaron en pocillos (Falcon 46, Becton Dickinson NY) en una concentración de 1 x /ml en la cantidad mínima de sustrato. Después de 24 horas se cambió el sustrato por sustrato reciente y se añadieron las chalconas disueltas en etanol absoluto. Los controles se trataron de igual modo con el vehículo en ausencia del principio activo que se estudiaba. El tratamiento descrito se repitió a intervalos de 24 horas durante las 72 que duró la prueba. Después de 24 horas se incubaron las células con cantidades proporcionales de estradiol marcado ( 3 H-E2, Ci/mmol, Amersham, Reino Unido) solo o en presencia de una cantidad 0 veces mayor de dietiletilbestrol a 4 C durante 2, horas. Al final del periodo de incubación, las células se lavaron rápidamente con sustrato fresco y se incubaron durante minutos con NaOH 1 M. La radiactividad se midió con un contador de centelleo y la especificidad de la unión se calculó como la diferencia entre los preparados que contenían o no el dietiletilbestrol. Los resultados se expresan como el número de loci de unión por célula, según los métodos convencionales. La inhibición de la proliferación celular se evaluó por recuento directo de las células, comparando el crecimiento de los controles frente al de las células tratadas. Se ha encontrado que los ésteres de los compuestos de la fórmula (I) con ácido acético, butírico, palmítico o ximenínico, así como con los complejos de los compuestos (I) con fosfolípidos, poseen una importante actividad antitumoral y son objeto de la presente invención. Además, la invención proporciona el uso de los ésteres de los compuestos de la fórmula (I), como se especifica anteriormente, o los complejos de compuestos (I) con fosfolípidos, para preparar medicamentos con actividad anticancerosa, en particular para el tratamiento de tumores que expresan receptores estrogénicos de tipo II. Los compuestos de la invención inhibían in vivo la proliferación celular, como se demostró por la medición del tamaño de los tumores implantados en ratón atímico desnudo, de acuerdo con las condiciones convencionales recogidas en la literatura. El tratamiento de los animales con dosis que oscilaron entre 1 y 0 mg/kg evidenció una importante regresión de los tumores estudiados hasta su desaparición en un porcentaje alto de los animales en estudio. En el hombre, los compuestos de la invención mostraron una actividad sobre los tumores de ovario, mama y útero que fue mayor que la de los medicamentos conocidos, como el tamoxifeno. En las pruebas citadas anteriormente, los ésteres de isocordoína, cordoína y 2,4 -dihidroxichalcona, mostraron una actividad particularmente importante. De acuerdo con otro aspecto más, la invención proporciona preparados farmacéuticos que contienen los ésteres o complejos de la invención como principios activos, en una mezcla con los excipientes adecuados. Los ésteres de la invención se pueden administrar favorablemente por vía oral o por infusión. Para la administración oral, se demostró que son particularmente útiles los complejos de los compuestos (I) con fosfolípidos naturales o sintéticos, ya que forman complejos liposolubles estables con las chalconas; los triglicéridos de cadena media y los excipientes relacionados también demostraron su utilidad. La posología de los compuestos de la invención puede ser muy amplia, por ejemplo, entre y 0 mg/día, administrada principalmente por vía oral. Los siguientes ejemplos ilustran mejor la invención. Ejemplo I Preparación de ximeninato de cordoína Se hace reaccionar 7 g de 4-O-prenil-2-hidroxiacetofenona con 7 g de benzaldehído en g de piperidina y 70 ml de etanol a -70 C. Después de 36 horas, el disolvente se elimina bajo vacío y el residuo se suspende con 0 ml de benceno que se había lavado abundantemente con HCl 2N. Después de eliminar el benceno, se purifica el residuo en una columna de gel de sílice obteniéndose 3, g de cordoína. La cordoína resultante se hace reaccionar en ml de piridina anhidra con 3 g de cloruro de ácido ximenínico. La mezcla de reacción se viere en agua y el producto se extrae con cloruro de metileno. Después de la cristalización en metanol, se obtienen 4,2 g de ximeninato de cordoína con un punto de fusión de C. 4

5 Ejemplo II 1 Preparación de palmitato de cordoína Se disuelven g de 3-C-prenilresacetofenona y g de p-hidroxibenzaldehído en 1 g de piperidina y 0 ml de etanol absoluto y se mantienen durante 4 horas a C. Después de eliminar el disolvente, el residuo se suspende en 0 ml de HCl 2N y el producto se extrae con cloruro de metileno. Después de eliminar el disolvente clorado, el residuo se purifica en gel de sílice obteniéndose 4,1 g de isocordoína con un punto de fusión de C. Este producto se hace reaccionar con 8 g de cloruro de palmitoilo en ml de piridina anhidra. Después de diluir la mezcla de reacción con agua y posterior purificación en gel de sílice, se obtienen 6,2 g de dipalmitoilisocordoína, con un punto de fusión de C. Ejemplo III Preparación de acetatos y butiratos de cordoína e isocordoína Estos productos se prepararon de acuerdo con los ejemplos I y II, usando respectivamente los cloruros oanhídridos de los ácidos correspondientes (punto de fusión: acetato de cordoína, C; butirato de cordoína, C. Ejemplo IV 2 Preparación del complejo de isocordoína con dipalmitoilfosfatidilcolina Se suspenden 3,08 g de isocordoína en ml de cloruro de metileno y se añaden 7,9 g de dipalmitoilfosfatidilcolina, y se deja reaccionar 1 hora con agitación. Cuando los reactivos se han disuelto completamente, la mezcla de reacción se concentra hasta un pequeño volumen y el concentrado se vierte en 0 ml de n-hexano. El material sólido que precipita se filtra y se seca a C durante toda la noche al vacío, obteniéndose 7,2 g del complejo fosfolípido-isocordoína con un punto de fusión de 70 C

6 REIVINDICACIONES 1 1. Los ésteres de isocordoína, cordoína, 4-hidroxiderricina, 2-hidroxiderricina, 3-hidroxiderricina, 2,4 - dihidroxichalcona, 4,2,4 -trihidroxichalcona con ácido acético, butírico, palmítico y ximenínico. 2. Los ésteres de cordoína o isocordoína de acuerdo con la reivindicación Complejos de isocordoína, cordoína, 4-hidroxiderricina, 2-hidroxiderricina, 3-hidroxiderricina, 2,4 - dihidroxichalcona, 4,2,4 -trihidroxichalcona con fosfolípidos naturales o sintéticos. 4. Composiciones farmacéuticas que contienen como principios activos los ésteres de las reivindicaciones 1-2 o los complejos de la reivindicación 3 en una mezcla con los excipientes adecuados.. El uso de los ésteres de la reivindicación 1 o de los complejos de la reivindicación 3 para la preparación de medicamentos con actividades anticancerosas y antagonistas sobre los receptores de los estrógenos de tipo II NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté onoincluída en la mencionada reserva. 6