GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS Nº 6

Transcripción

1 Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia Universidad Nacional de Tucumán GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS Nº 6 Inmunohematología

2 2 SISTEMAS DE GRUPOS SANGUÍNEOS La expresión sistema de grupos sanguíneos se asocia históricamente a los sistemas de antígenos y anticuerpos eritrocitarios; sin embargo, el término es igualmente válido cuando se aplica a los sistemas de antígenos y anticuerpos leucocitarios y plaquetarios. Existen antígenos específicos, comprometidos con una única línea celular, como los sistemas Rh y Kidd, localizados únicamente en la membrana de los glóbulos rojos (GR), y antígenos pluritisulares, presentes en células sanguíneas, fluidos (saliva, leche, liquido amniótico) y tejidos, como los sistemas ABO, Lewis (Le), Kell, Lutheran (Lu), CD55, entre otros. ANTÍGENOS ERITROCITARIOS Se definen como antígenos (Ag) eritrocitarios a estructuras moleculares, localizadas en la membrana del glóbulo rojo, capaces de ser reconocidas por el sistema inmune de individuos que carezcan de ellos, produciendo anticuerpos (Ac) específicos. Estas moléculas tienen distintas composiciones bioquímicas. Antígenos glucídicos. Se forman por la adición de glúcidos sobre precursores específicos (cadenas cortas de carbohidratos), como los grupos ABO, Hh, Lewis, Ii. En otros, los oligosacáridos se asocian a lípidos como el Ag P (glicoproteínas), o a proteínas como el Ag Lu o Ag del sistema Kell (glicoproteínas). Antígenos proteicos. Hay Ag que forman parte de las proteínas integrales de membrana del eritrocito, la glucoforina A y B, y la banda 3, dando lugar a los Ag del sistema MN, SsU y Diego respectivamente. Otros forman parte de proteínas estructurales como la proteína Rh, Colton, Duffy (que atraviesan varias veces la membrana del GR), o participan en el transporte de urea como los Ag del sistema Kidd. Hay proteínas que se encuentran ancladas a la membrana por lípidos como el glicosilfosfatidilinositol (GPI), como los Ag Cromer, que son proteínas reguladoras de la activación del complemento, denominadas factores de la aceleración de la declinación (FAD, CD55). Hay Ag que se expresan débilmente en sangre de cordón, como los Ag del sistema ABO (presenta un tercio de la expresión del adulto), Le, P1, Lu; otros tienen expresión normal (como en el adulto), Ag de los sistemas Rh, Kell, Kidd, Duffy, MNS; y Ag que tienen una expresión intensa como el i del sistema Ii. Según la clasificación del comité de nomenclatura de la International Society Blood Transfusion (ISBT), actualmente se definieron 308 Ag eritrocitarios que se distribuyen en 30 sistemas, 3 colecciones y 2 series. Sistemas de grupo sanguíneo: sistema formado por uno o más Ag controlados por un único locus o por un complejo de genes homólogos estrechamente ligados que no recombinan durante la meiosis. A esta categoría pertenecen 272 Ag. Por ejemplo el sistema Rh está formado por 48 Ag. Colecciones: grupo de Ag relacionados serológica, bioquímica o genéticamente, que al momento de la clasificación no pueden adquirir el rango de sistema. Por ejemplo Cost, ER, Le c y Le d. A esta categoría pertenecen 6 Ag. Series 700: son Ag de baja incidencia (<1%, Ag privados) que no pueden ser incluidos en las categorías anteriores. A esta categoría pertenecen 19 Ag. Series 900: Son Ag de muy alta incidencia (>90%, Ag públicos), los que no pertenecen a algún sistema o colección. A esta categoría pertenecen 11 Ag. Con el fin de estandarizar la terminología de los grupos sanguíneos, la ISBT denomina actualmente con letras mayúsculas el sistema al que pertenece, y se

3 3 enumera secuencialmente cada Ag por orden de descubrimiento. Por ejemplo, el sistema KELL: KEL1, KEL2 (antes cellano o k), KEL3, KEL4, KEL5. Existen Ag que pueden ser usados como marcadores antropológicos porque son privativos de poblaciones de determinado origen étnico, por ejemplo el Ag Diego, de poblaciones indígenas asiáticas y sudamericanas. ANTÍGENOS Y ANTICUERPOS PLAQUETARIOS Existen varios Ag en la membrana plaquetaria, algunos se comparten con otros tipos celulares. Los más significativos se clasifican en tres grupos: Ag del sistema ABO y asociados: H, I, i y P Ag HLA de clase I Ag plaquetoespecíficos A menudo se transfunden plaquetas sin tener en cuenta la compatibilidad ABO, en algunos casos los Ac ABO de tipo IgG de título elevado del receptor (generalmente del grupo O) podrían reaccionar con las plaquetas del donante por el Ag ABO, reduciendo la sobrevida. Los Ac antiplaquetarios más destacados son los dirigidos contra los Ag HLA de clase I, compartidos por plaquetas y leucocitos, pues son los más relevantes en la refractariedad plaquetaria postransfusional. El papel de los Ac antiplaquetarios se asemeja al de los Ac antieritrocitarios, ya que pueden provocar trombocitopenia aloinmune neonatal, púrpura trombocitopénica autoinmune, trombocitopenias inmunes inducidas por droga y púrpura postransfusional tardía. ANTÍGENOS Y ANTICUERPOS GRANULOCITARIOS/NEUTROFÍLICOS Los Ag granulocitarios específicos, expresados en la membrana de los neutrófilos, se denominan HNA (Human Neutrophil Alloantigens). Las reacciones transfusionales febriles, no hemolíticas, a menudo se asocian a Ac contra el Ag HLA1 presente en granulocitos y común a varias células nucleadas. DETECCIÓN DE REACCIONES ANTÍGENO-ANTICUERPO ERITROCITARIAS Las determinaciones de Ag del GR y el estudio de Ac en suero se basan principalmente en pruebas que tienen como punto final la aglutinación de los GR. La hemoaglutinación es la agregación visible de GR mediada por Ac. En ocasiones, la unión Ag-Ac activa la vía clásica del sistema del complemento, y el resultado final es una hemólisis in vitro, lo cual se considera un resultado positivo. ANTICUERPOS DE LOS GRUPOS SANGUÍNEOS La formación de Ac en respuesta a un estímulo antigénico se denomina sensibilización. Esta puede ser aloinmune si el Ag proviene de otro individuo (por embarazo, transfusión, transplante de médula ósea), o bien autoinmune si se trata de una sensibilización contra un Ag propio, sin evento inmunizante previo. Según el tipo de reacción en que están involucrados, de hemoaglutinación o hemólisis, se habla de Ac aglutinantes o hemolíticos. Los primeros son aquellos capaces de producir una reacción visible de hemoaglutinación en medio salino. ANTICUERPOS AGLUTINANTES Y NO AGLUTINANTES Un factor muy importante es el tipo de inmunoglobulina a la que pertenecen los Ac reaccionantes. Se dice que un Ac es aglutinante cuando aglutina GR en solución de

4 4 NaCl 0,15 M (solución fisiológica). Si los Ac son del tipo IgM la aglutinación se produce directamente. Por su tamaño molecular y la distribución de los lugares de reacción con los Ag, pueden unirse fácilmente con varios hematíes y producir su aglutinación (Figura N 1). FIGURA N 1: Hemoaglutinación con Ac IgM Molécula IgM Hematíes aglutinados por una IgM Los Ac no aglutinantes se fijan a la superficie de los GR sin llegar a la formación de los grumos (aglutinados) que hacen visible la reacción. La sensibilización de GR por Ac de tipo IgG, generalmente no produce aglutinación (Figura N 2). Existen excepciones que están relacionadas al número y al grado de exposición de los determinantes antigénicos como las aglutininas del ABO, el anti-d frente a GR con fenotipos - - D - -, ccdee. FIGURA N 2: Sensibilización de eritrocitos con Ac IgG Molécula IgG Hematíes sensibilizados por moléculas de IgG La molécula de IgG es demasiado pequeña para unirse a más de un GR a no ser que se introduzca alguna modificación técnica. REACCIONES DE HEMOAGLUTINACIÓN La especificidad y la reversibilidad son las características principales de la reacción Ag-Ac y las bases sobre las cuales reposan las técnicas de inmunohematología. Especificidad: a cada determinante antigénico le corresponde un Ac específico, lo que implica una estrecha complementariedad entre las estructuras reactivas del Ag y del Ac. Reversibilidad: se produce una reacción bimolecular en equilibrio químico, en la cual es posible disociar el complejo Ag-Ac, suministrándole la energía necesaria. La separación de los Ac se conoce como elución. La reacción de hemoaglutinación tiene 2 etapas: sensibilización y aglutinación. 1-Sensibilización: El Ac se une al Ag eritrocitario superficial, quedando el GR cubierto de Ac. Ag +Ac Ag-Ac Esta etapa está influenciada por las siguientes variables:

5 5 Temperatura: cada sistema Ag/Ac tiene una temperatura óptima. Las IgM reaccionan mejor a 4ºC y las IgG, a 37ºC. Afinidad entre Ag y Ac. ph: el óptimo es entre 6.5 y 7.6. Concentración relativa del Ag y del Ac: Puede ocurrir ausencia o disminución de aglutinación con grandes cantidades de Ac o Ag; situación denominada fenómeno de prozona y postzona respectivamente y que puede llevar falsos negativos o reacciones débiles (Figura N 3). FIGURA N 3: Fenómeno de prozona y postzona Con grandes concentraciones de Ac existe mayor probabilidad de que los dos sitios de unión al Ag se unan a determinantes en una misma célula. Ante el exceso de Ag la situación es similar. Fuerza iónica del medio: Al disminuir la fuerza iónica del medio, disminuye la nube de iones que rodea a los GR favoreciendo la unión Ag-Ac. Tiempo de incubación: es el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio de reacción entre Ag y Ac. 2- Aglutinación: ocurre cuando una molécula de Ac enlaza GR adyacentes formando una red, haciendo visible macroscópicamente la reacción. Este fenómeno depende: Proximidad de los GR: La superficie de los GR tiene cargas eléctricas negativas debidas a los carboxilos del ácido siálico unido a la glicoproteína de la membrana. Si los GR están en suspensión en un medio que contiene iones libres, los cationes forman una envoltura de cargas positivas alrededor de aquellos convirtiéndolos en partículas cargadas de electricidad del mismo signo, que experimentan una fuerza de repulsión entre ellas. Esta fuerza de repulsión se denomina potencial Zeta. Se forma entonces una doble capa compuesta por las cargas superficiales del GR y la nube de cationes (Figura N 4). FIGURA N 4: Potencial Z de los eritrocitos

6 6 Ecuación de Pollack Z = f q D Concentración de puntos antigénicos o densidad del Ag: Es decir de la cantidad de Ag por GR. Naturaleza del Ac interviniente: Se refiere a la clase de inmunoglobulina involucrada. En condiciones isotónicas, los GR no pueden aproximarse a menos de Ǻ. En el caso de las lgm, el tamaño de estas moléculas permite la aglutinación directa, en medio salino isotónico. Las moléculas de IgG, de menor tamaño, no llegan a cubrir esa distancia y sensibilizan sin formación de la malla. En este caso, se hace necesaria la utilización de distintas metodologías que disminuyan la distancia entre los GR favoreciendo la aglutinación. IgM (SF) n Ag-Ac Z: potencial zeta q: densidad de carga superficial del eritrocito D: constante dieléctrica del medio : fuerza iónica del medio. ANTÍGENO COPIAS POR GR A D E Kell Fy (Ag-Ac)n IgG (Albúmina, enzimas, Coombs) MÉTODOS PARA DETECTAR AC NO AGLUTINANTES Para potenciar las reacciones de aglutinación y facilitar así la lectura e interpretación de los resultados se emplean diversos métodos, que pueden consistir simplemente en una centrifugación controlada en cuanto a tiempo y velocidad, para favorecer la formación de aglutinados visibles en el momento de efectuar las lecturas. Los métodos a los que se puede apelar para observar aglutinación con Ac no aglutinantes son: a) - Métodos basados en modificaciones físico - químicas. Afectan principalmente el potencial zeta disminuyéndolo de tal forma que sea factible la aproximación de los GR para formar el aglutinado. Son los siguientes: Aumento de la constante dieléctrica del medio Esto se logra agregando macromoléculas como albúmina, la cual se polariza en el campo eléctrico creado por los GR disminuyendo las fuerzas de repulsión entre los mismos y alterando la tensión superficial intercelular. Todo esto favorece la aglutinación de GR recubiertos de Ac. Tiene escasa participación en la etapa de sensibilización. Tratamiento enzimático de los GR Las enzimas proteolíticas bromelina, ficina, papaína y tripsina disminuyen la carga superficial negativa de los GR por clivaje de las moléculas de ácido siálico de las cadenas polisacáridas, con lo que disminuye q (densidad de carga superficial), y decrece el potencial zeta. La menor repulsión entre las células favorece entonces su aglutinación. También produce el clivaje de proteínas que incrementan la tensión

7 7 superficial de las células. Aunque estas enzimas exaltan la aglutinación mediada por algunos Ac (anti-rh, anti-k, anti- Kidd), desnaturalizan ciertos Ag eritrocitarios, en especial los M, N, S, Fy a, Fy b. Es decir que las enzimas cambian la estructura bioquímica de un Ag y su localización en la membrana eritrocitaria. Algunos Ag son destruidos y otros se exaltan en la membrana eritrocitaria. Esta propiedad se utiliza para identificar mezclas complejas de Ac y para caracterizar la especificidad del Ac cuando su identificación no es evidente en las pruebas serológicas comunes. Polietilenglicol (PEG) Es un polímero lineal hidrosoluble usado como aditivo para aumentar la captación de Ac; concentra los Ac promoviendo su incorporación y potenciando la reacción. Polybrene Es un policatión de amonio cuaternario (bromuro de exadimetrina) que neutraliza la carga negativa de los GR produciendo una agregación reversible. Este acercamiento de GR favorece la unión de Ac tipo IgG. Si se adiciona citrato (polianión) se restablece la carga del GR: si el aglutinado se disocia la prueba es negativa, pero si persiste la prueba es positiva. Reactivos de baja fuerza iónica La fuerza iónica es uno de los factores más importantes que determinan la tasa y la cantidad de captación de Ac por parte de los GR. El uso soluciones de baja fuerza iónica, como SOSBI (solución salina de baja fuerza iónica) o LISS, disminuye el tiempo de incubación (de 60 minutos a minutos) pues aumentan hasta en 1000 veces la afinidad entre Ag y Ac, y potencian las reacciones de los Ac sin incrementar las reacciones inespecíficas. b) - Métodos inmunológicos. Utilizan suero antiglobulina humana (SAGH), conocido también como suero de Coombs o reactivo de Coombs, el cual reconoce la fracción Fc de inmunoglobulinas humanas. Si en una reacción hubo correspondencia entre Ag eritrocitarios y Ac no aglutinantes (sensibilización de GR), el agregado de la antiglobulina humana reconocerá los Ac fijados a la superficie eritrocitaria formando puentes entre células adyacentes, permitiendo visualizar la aglutinación. El suero de Coombs se obtiene por inmunización de animales (generalmente conejos) con suero humano. Este reactivo puede ser: --- Poliespecífico: el que se emplea de rutina contiene dos Ac, anti-igg y anti-c3d (componente del complemento). --- Monoespecífico: presenta los Ac por separado anti-igg, anti-c3d, anti-c3b. Cuando se tiene una reacción positiva con el reactivo poliespecífico, luego debe investigarse mediante los reactivos monoespecíficos, el tipo de Ac y/ o fracción de complemento unido a los GR. CONTROL DE CALIDAD DE REACTIVOS REACTIVOS HEMOCLASIFICADORES Llamados también antisueros, permiten determinar el grupo sanguíneo. Los reactivos a los que nos vamos a referir son los más utilizados en las técnicas de rutina del Banco de Sangre como por ejemplo anti-a, anti-b, anti-ab, anti-d, etc. Pueden ser: Policlonales: mezcla de Ac contra distintos epitopes de una misma molécula que se obtiene por inmunización de animales o de personas sensibilizadas por transfusiones o embarazos.

8 8 Monoclonales: Ac dirigido contra un único epitope que se obtienen a partir de hibridomas. Actualmente los reactivos hemoclasificadores que se emplean para determinar el grupo sanguíneo del sistema ABO son de origen monoclonal y son los siguientes: anti-a, anti-b, anti-ab. El reactivo hemoclasificador monoclonal para detectar el Ag D del sistema Rh es el anti-d, y puede ser monoespecífico, conteniendo Ac tipo IgM, o poliespecífico, conteniendo mezcla de IgM más IgG (llamado blend). Antes de emplear estos antisueros hay que realizar la valoración de los reactivos mediante métodos que son semicuantitativos y que consisten en determinar los siguientes parámetros: Titulo y score. Avidez Especificidad. a)- TÍTULO: es la inversa de la máxima dilución en la que se observa aglutinación macroscópicamente. Al titular un Ac se puede saber hasta qué dilución mantiene actividad inmunológica. b)- SCORE o PUNTAJE: es la sumatoria de los valores asignados a la aglutinación de cada tubo de la titulación, mide la intensidad de reacción. c)- AVIDEZ: es el tiempo en el cual se observa aglutinación al reaccionar un Ac con su correspondiente Ag. d)- ESPECIFICIDAD: es la capacidad que tiene un Ac de reaccionar solamente con su correspondiente Ag. El título, el score y la avidez pueden variar por las condiciones de almacenamiento, contaminación, ruptura de cadena de frío, etc. Preparación de las suspensiones de GR Centrifugar 5 minutos a 3000 rpm una muestra de sangre anticoagulada con EDTA. Eliminar el sobrenadante. Lavar los GR 3 veces con solución fisiológica o hasta que el sobrenadante quede límpido. Para una suspensión de: GR al 5% mezclar 50 μl de GR lavados + 1 ml de solución fisiológica. GR al 10% mezclar 100 μl de GR lavados + 1 ml de solución fisiológica. MÉTODO DE TITULACIÓN Y SCORE DE REACTIVOS PARA EL SISTEMA ABO Tubos Dilución final 1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 Sol. Fisiol μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL Antisuero a titular (anti-a, anti-b ó anti-ab) 100μL 100μL GR 5% 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL

9 9 Se hacen diluciones dobles progresivas en solución fisiológica del antisuero a titular. A cada tubo se agrega una suspensión de GR al 5% que presenten la especificidad antigénica correspondiente al antisuero a ensayar. Es decir que si se titula: - antisuero anti-a se usa una suspensión de GR A al 5% - antisuero anti-b se usa una suspensión de GR B al 5% - antisuero anti-ab se usa una suspensión de GR A ó GR B ó GR AB al 5% Centrifugar los tubos 1 minuto a 1000 rpm. Finalmente, se realiza la lectura siendo el título la inversa de la dilución del último tubo que presenta aglutinación. Resultados: Según normas internacionales los antisueros para el sistema ABO deben tener un Título 128. Este dato, aunque tiene valor indiscutido, es muy vago: dos reactivos pueden tener un mismo título pero aglutinar con intensidad diferente. Entonces es importante considerar el score, que se calcula como la sumatoria de los valores asignados a cada tubo de la titulación de acuerdo a la intensidad de aglutinación. Aglutinado grumo único ++++ : 10 Aglutinado 2-3 grumos +++ : 8 Aglutinado hasta 10 grumos ++ : 5 Aglutinación fina + : 2 Si dos o más reactivos de diferente marca, presentan el mismo título, tiene mayor sensibilidad el que presente mayor score. Según normas internacionales los antisueros para el sistema ABO debe tener un Score 50. MÉTODO DE TITULACIÓN Y SCORE DE REACTIVOS PARA EL SISTEMA Rh Como fue indicado antes, es fundamental conocer la naturaleza del reactivo a titular de tal forma de respetar las condiciones en que éste produce aglutinación. Las técnicas que se describen a continuación se utilizan en la evaluación del anti-d blend. Investigación de IgM (en medio salino): Tubos Dilución final 1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 Sol. Fisiol μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL Anti-D 100μL 100μL GR 5% 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL Se hacen diluciones dobles progresivas en solución fisiológica del antisuero a titular. A cada tubo se agrega una suspensión de GR O Rh (D) positivo al 5%. Centrifugar los tubos 1 minuto a 1000 rpm. Finalmente, se realiza la lectura siendo el título la inversa de la dilución del último tubo que presenta aglutinación.

10 10 Investigación de IgM más IgG Se procede en forma idéntica al caso anterior, pero luego del agregado de los GR se adiciona a cada tubo una gota de solución de bromelina o albúmina al 6%. Se incuba 10 minutos a temperatura ambiente, luego se centrifuga 1 minuto a 1000 rpm y se lee la aglutinación. Investigación de IgG Es necesario hacer un tratamiento previo del anti-d a titular con 2-Mercaptoetanol, reactivo capaz de disociar las moléculas de IgM en fracciones que no tienen actividad inmunológica. Para ello, en un tubo de hemóiisis se colocan 2 gotas de anti-d más 2 gotas de 2-Mercaptoetanol, se incuba 15 minutos a 37 ºC. Se procede a titular realizando las diluciones doble progresivas del anti-d tratado y se continúa en forma idéntica al caso anterior. Si no se dispone de bromelina se puede hacer una prueba de Coombs indirecta. Resultados: Según normas internacionales los antisueros para el sistema Rh deben tener un Título 32, y un Score 50, que se determina como fue explicado para el sistema ABO. AVIDEZ DE LOS REACTIVOS PARA LOS SISTEMAS ABO Y Rh En una placa de vidrio colocar 1 gota de antisuero y a 1 cm de distancia colocar 50µL de una suspensión de GR al 10% que presenten la especificidad antigénica correspondiente al antisuero a ensayar. Es decir: - antisuero anti-a se usa una suspensión de GR A al 10% - antisuero anti-b se usa una suspensión de GR B al 10% - antisuero anti-ab se usa una suspensión de GR A ó GR B ó GR AB al 10% - antisuero anti-d se usa una suspensión de GR O Rh (D) positivo al 50% Mezclar con una varilla y disparar simultáneamente el cronómetro. Medir el tiempo de aglutinación. Resultados: Según normas internacionales los antisueros para el sistema ABO deben tener una Avidez 8 segundos, y para el sistema Rh, 30 segundos. ESPECIFICIDAD DE LOS REACTIVOS PARA EL SISTEMA ABO En tres tubos de hemólisis se enfrentan 100μL de anti-a con 100μL de suspensiones de GR A, GR B y GR O al 5%, respectivamente. Mezclar suavemente. Centrifugar 1 minuto a 1000 rpm y leer. Se procede a repetir de igual manera para los antisueros anti-b y anti-ab. Resultados: Si el antisuero aglutina sólo los GR del grupo para el que presenta especificidad, el resultado es el adecuado. Por ejemplo el anti-a solo debe aglutinar GR A. Tubo Anti-A Anti-B Anti-AB GR A 5% GR B 5% GR O 5% - - -

11 11 ESPECIFICIDAD DE REACTIVOS PARA EL SISTEMA Rh En un tubo de hemólisis se enfrentan 100μL de anti-d con 100μL suspensión de GR O Rh (D) positivo al 5% (Genotipo Fisher-Race: DCe/dce, Nomenclatura Wiener: R1r). En otro tubo de hemólisis se enfrentan 100μL de anti-d con 100μL suspensión de GR O Rh (D) negativo al 5% (Genotipo Fisher-Race: dce/dce, Nomenclatura Wiener: rr). Mezclar suavemente. Centrifugar 1 minuto a 1000 rpm y leer. Resultados: El antisuero debe aglutinar sólo los GR O Rh (D) positivo. DETERMINACIÓN DE GRUPOS SANGUÍNEOS Las reacciones de hemoaglutinación pueden ser realizadas en tubo o en placa. Ambas técnicas son de igual naturaleza, aunque la reacción en tubo es más sensible ya que la centrifugación a bajas revoluciones por minuto de los tubos favorece la aproximación de GR sensibilizados y su aglutinación. TIPIFICACIÓN DEL SISTEMA ABO Consideraciones del Sistema ABO Debido a que el sistema ABO involucra la presencia de Ag en GR (aglutinógenos) y de Ac naturales en plasma (aglutininas) (Figura N 5), la tipificación del mismo se realiza mediante un método directo que detecta los aglutinógenos, y un método indirecto o inverso que identifica las aglutininas plasmáticas. FIGURA N 5: Sistema ABO Plasma Ac Prueba directa en placa o portaobjeto Técnica menos precisa que en tubo, pero es de utilidad cuando se desea conocer con urgencia el grupo sanguíneo.

12 12 Muestra: sangre entera anticoagulada con EDTA o suspensión de GR al 40% en solución fisiológica. Reactivos: Anti-A, Anti-B, Anti-AB Técnica: 1. Colocar 1 gota de cada uno de los antisueros en un portaobjeto limpio y seco. 2. Colocar 50uL de la suspensión de GR a 1 cm de distancia. 3. Mezclar utilizando una varilla diferente para cada reactivo, extender y balancear la placa suavemente en forma circular durante 2 minutos observando presencia o ausencia de aglutinación. Prueba directa en tubo Muestra: suspensión de GR 5% Reactivos: Anti-A, Anti-B, Anti-AB Técnica: Marcar 3 tubos: A, B y AB 1- Agregar 1 gota de cada antisuero en el tubo correspondiente. 2- Colocar 50μL de la suspensión de GR 5% en estudio a cada tubo. 3- Mezclar suavemente. Centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. 4- Resuspender suavemente el botón celular observando la presencia o ausencia de aglutinación. Interpretación de la prueba directa GR vs. Antisuero Anti-A Anti-B Anti-AB Grupo sanguíneo O A B AB Prueba inversa Como las aglutininas a investigar no tienen gran avidez, la técnica no se realiza en placa sino en tubo, pues tiene mayor sensibilidad. Muestra: suero del paciente. Reactivos: suspensión de GR A, B y O al 3-5%, comerciales o preparados en el laboratorio. El uso de GR O tiene por objeto controlar la especificidad de la aglutinación, al carecer de Ag para el sistema ABO, estos GR no deben aglutinar (control negativo). Si hubiera aglutinación, la reacción no es válida. Técnica: 1. Rotular tres tubos como A, B y O. 2. Colocar 100 μl de suero del paciente en cada tubo. 3. Agregar 50 μl de la suspensión de GR A en el tubo A, 50 μl de GR B en el tubo B y 50 μl de GR O en el tubo O. 4. Mezclar suavemente y centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. 5. Resuspender suavemente los GR observando la presencia o ausencia de aglutinación. En algunos casos se observa hemólisis, lo cual se interpreta como un resultado positivo.

13 13 Interpretación de la prueba inversa Suero del paciente vs. GR A GR B GR O Grupo sanguíneo O A B AB La importancia de realizar ambas pruebas para cada paciente tiene por objeto obtener un dato confiable 100%. Si existe una discordancia entre los resultados obtenidos en ambas pruebas, puede considerarse: empleo de material sucio, contaminación de los reactivos, uso de una concentración inadecuada de GR. En estos casos hay que repetir ambas pruebas, y si persiste la discordancia, verificar el control de calidad de los reactivos; de ser necesario tomar una nueva muestra al paciente. Otra causa de discordancia puede deberse a la presencia de subgrupos. Entre los individuos de grupo A, se encuentran varios subgrupos, de todos ellos se distinguen 2 categorías: A1 (80%) y A2 (18-20%), que pueden diferenciarse usando lectinas específicas de grupo sanguíneo: Dolichos biflorus (anti-a1) y Ulex europaeus (anti-h). En las anemias hemoliticas autoinmunes, la prueba inversa puede dar positivo tubo que contiene GR O por la presencia de anticuerpos anti-i en el suero del paciente, el cual reacciona con el Ag I, presente en la mayoría de los GR. En este caso hay que preincubar a 37 C el suero y los GR y realizar la prueba a 37 C. En pacientes con quimioterapia, donde se daña la membrana del GR, pueden no coincidir la prueba directa con la inversa. TIPIFICACIÓN DEL SISTEMA Rh Consideraciones del Sistema Rh El Sistema Rh está formado por 49 Ag, no todos con la misma distribución y frecuencia; los más importantes son D, C, E, c y e. En la práctica de rutina, el estudio del sistema Rh queda limitado a la investigación del Ag D, por ser el más frecuente y el más inmunogénico. El Ag D está compuesto por aproximadamente 37 epitopes o mosaicos antigénicos, y puede presentar variaciones cuantitativas y cualitativas (Figura N 6). ----Variaciones cuantitativas del Ag D: la calidad antigénica es normal pero la densidad antigénica está disminuida, es decir que no todos los individuos tienen la misma cantidad de Ag D y no todos ellos reaccionan con la misma potencia frente al anti-d. Antiguamente se lo conocía como Ag D débil (D u ). Hoy se prefiere el término Ag D debilitado. ----Variaciones cualitativas del Ag D: en este caso existe una variante o faltan partes de ese mosaico, es decir, faltan determinantes antigénicos. Los individuos sin algún epitope y expuestos a un Ag D completo pueden producir un aloanticuerpo anti-d dirigido contra la parcela ausente. Este Ag se conoce como Ag D Parcial (variante D) que puede presentarse con o sin variaciones cuantitativas asociadas, o sea que podemos encontrar: Ag D Parcial Ag D Parcial Débil

14 14 FIGURA N 6: Variaciones cuantitativas y cualitativas del AgD común Existen 41 tipos de D parcial, distribuidos en 7 categorías y designados con números romanos (II, IIIa, IIIc, IVa, IVb, Va, VI), donde la VI es la más importante de detectar por ser la más inmunogénica. Para detectar los Ag D parciales y los Ag D debilitados se requieren modificaciones metodológicas en las técnicas de laboratorio, ya que no son Ag lo suficientemente intensos para producir aglutinación en presencia de cualquier antisuero anti-d. Se considerará detección de Ag D débiles al estudio de Ag D parciales y D debilitado, ya que con la metodología a emplear no se los puede diferenciar. Prueba directa en placa o portaobjeto Técnica menos precisa que en tubo, pero es de utilidad cuando se desea conocer con urgencia el grupo sanguíneo. Muestra: sangre entera anticoagulada con EDTA o suspensión de GR al 40% en solución fisiológica. Reactivos: Anti-D. Se recomienda el uso de dos reactivos distintos para ampliar el espectro de detección y brindar seguridad. Técnica: 1. Colocar 1 gota del antisuero en un portaobjeto limpio y seco. 2. Agregar 50 μl de sangre entera a 1 cm de distancia. 3. Mezclar utilizando una varilla, extender y balancear la placa suavemente en forma circular durante 2 minutos observando presencia o ausencia de aglutinación. Interpretación: Aglutina: prueba positiva presencia de Ag D: paciente Rh (D) positivo No Aglutina: prueba negativa no implica ausencia de Ag D, pues también puede tratarse de Ag D débiles que no son detectados por esta técnica. En este caso es necesario hacer un estudio de detección de Ag D débiles. Prueba directa en tubo Muestra: suspensión de GR del paciente al 5%. Reactivos: Anti-D. Se recomienda el uso de dos reactivos distintos para ampliar el espectro de detección y brindar seguridad. Técnica:

15 15 1- Agregar 1 gota de antisuero en un tubo de hemólisis. 2- Colocar 50μL de la suspensión de GR 5% en estudio. 3- Mezclar suavemente. Centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. 4- Resuspender suavemente los GR observando la presencia o ausencia de aglutinación. Interpretación: Aglutina: prueba positiva presencia de Ag D: paciente Rh (D) positivo No Aglutina: prueba negativa no implica ausencia de Ag D, pues también puede tratarse de Ag D débiles que no son detectados por esta técnica. En este caso es necesario hacer un estudio de detección de Ag D débiles Determinación de Ag D débiles Muestra: suspensión de GR del paciente 5%. Reactivos: --- Anti-D blend. --- SAGH poliespecífico ó anti-igg. Técnica: Identificar un tubo como D y otro como C (control). 1- Agregar 1 gota de anti-d al tubo D y 1 gota de solución fisiológica al tubo C. 2- Colocar 50μL de la suspensión de GR 5% en estudio a cada tubo. 3- Mezclar suavemente y centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. 4- Resuspender suavemente los GR observando la presencia o no de aglutinación. Aglutina: prueba positiva presencia de Ag D: paciente Rh (D) positivo No Aglutina: prueba negativa continuar el estudio El tubo C no debe aglutinar. 5- Incubar 30 minutos a 37 C 6- Mezclar suavemente y centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. 7- Resuspender los GR observando la presencia o no de aglutinación. Aglutina: prueba positiva presencia de Ag D: paciente Rh (D) positivo No Aglutina: prueba negativa continuar el estudio El tubo C no debe aglutinar. 8- Lavar los GR 3 veces con solución fisiológica. 9- Después del último lavado, descartar totalmente el sobrenadante sobre papel absorbente y agregar 1 gota del SAGH. 10- Centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. 11- Resuspender los GR suavemente observando la presencia de aglutinación. Interpretación: Aglutina: presencia de Ag D débil paciente Rh (D débil) positivo. No Aglutina: ausencia de Ag D paciente Rh (D) negativo En ambos casos el resultado solo es válido si el tubo C no presenta aglutinación. Nota: Si la suspensión de hematíes se prepara con una solución de baja fuerza iónica (LISS), la incubación a 37º C se reduce a 15 minutos. Los reactivos anti-d deben contener Ac que detecten la categoría DVI (por ser la más inmunogénica de los Ag D parciales). Importancia de la detección de Ag D débiles En el acto transfusional tener en cuenta que: Pacientes receptores y embarazadas D débil positivo: se consideran como Rh (D) negativo.

16 16 Donantes y recién nacidos D débil positivo: se consideran como Rh (D) positivo. Causas de error en la determinación de grupos sanguíneos Resultados falso negativo No se agregó el antisuero No se agregó el suero del paciente. Proporción inapropiada de suero y de GR Centrifugación insuficiente. Incubación a más de 20-24ºC. Interpretación o registro incorrecto de los resultados Resultados falso positivo Centrifugación excesiva Uso de reactivos, GR o solución salina contaminada. Uso de material de vidrio sucio. Interpretación o registro incorrecto de los resultados. PRUEBA DE COOMBS Conocida también como Prueba de Antiglobulina Humana, permite detectar e identificar inmunoglobulinas y/o componentes del complemento unidos a GR que no pueden ser detectados por otros métodos. También se define como una prueba que permite reconocer anticuerpos no aglutinantes. Hay 2 tipos: directa e indirecta. PRUEBA DE COOMBS DIRECTA (PCD) Fundamento: llamada también prueba de antiglobulina directa, detecta Ac y/o componentes del complemento fijados in vivo en los GR del paciente mediante el suero de Coombs. Es decir que la PCD se emplea para demostrar que hubo una unión de Ac a los Ag eritrocitarios (sensibilización) in vivo. FIGURA N 7: Principio de la prueba de Coombs directa GR sensibilizados SAGH Aglutinado y lavados del paciente Muestra: sangre entera anticoagulada con EDTA. Los GR deben ser lavados 3 veces con solución fisiológica, y a partir del pellet de GR se prepara una suspensión al 3-5% en solución fisiológica. Reactivo: SAGH poliespecífico Técnica: 1- Identificar un tubo de hemólisis como P (paciente) y otro como C (control). 2- En cada tubo colocar 50 μl de la suspensión de GR en estudio.

17 17 3- Solo al tubo P agregar 1 gota de SAGH. 4- Centrifugar ambos tubos 1 minuto a 1000 rpm. 5- Desprender los GR suavemente y ver la presencia o ausencia de aglutinación. Interpretación: -- Aglutina: PCD positiva el paciente tiene GR recubiertos (sensibilizados) in vivo con Ac tipo IgG, complemento o ambos. Se debe realizar la PCD con SAGH monoespecífico (anti-igg, anti-c3d y anti-c3b). -- No Aglutina: no se puede aseverar que la PCD sea negativa, pues el complemento en algunas ocasiones tarda en reaccionar por lo que se dejan los tubos incubando 10 minutos a temperatura ambiente, luego se centrifugan 1 minuto a 1000 rpm y se desprenden los GR suavemente para ver la presencia o ausencia de aglutinación. Si no aglutina, la PCD es negativa. Si aglutina la PCD es positiva y se procede a identificar que fracción de complemento tienen los GR haciendo la PCD con SAGH monoespecífico. Aplicaciones de la PCD Diagnóstico de: Anemias hemolíticas autoinmunes (frías y calientes). Enfermedad hemolítica fetoneonatal (incompatibilidad D, E, Kell, Kidd). Anemias hemolíticas inducidas por fármacos Reacciones hemolíticas postransfusionales (hemólisis aloinmune que sigue a una transfusión incompatible). PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA (PCI) Fundamento: llamada también prueba de antiglobulina indirecta, detecta Ac y/o componentes del complemento presentes en el suero del paciente que son fijados in vitro a los GR durante un tiempo de incubación (Figura N 8). Hay situaciones en que un paciente puede desarrollar Ac anti-eritrocitarios (generalmente IgG, pero también hay aglutinantes) en respuesta a un estímulo antigénico (paciente sensibilizado). Estos Ac pueden permanecer circulando en el suero del paciente sin ocasionarle ningún trastorno, a menos que se enfrente nuevamente con su correspondiente Ag. Para ponerlos en evidencia, se utiliza la PCI. FIGURA N 8: Principio de la prueba de Coombs indirecta Muestra GR GR SAGH Aglutinado (suero conocidos sensibilizados con Ac/C 3 ) Como se ve, en la prueba indirecta la sensibilización de los eritrocitos ocurre in vitro y es visualizada por el agregado del reactivo de Coombs.

18 18 Muestra: suero del paciente. Reactivos: -- Mezcla de GR 0 Rh (D) positivos al 3-5% en solución fisiológica o en LISS. Para asegurar la detección de todos los Ac clínicamente significativos, se emplea un pool comercial o fabricado en el laboratorio de GR testigos o conocidos que expresen los Ag más corrientes de los principales sistemas de grupo sanguíneo. -- SAGH poliespecífico Técnica: 1- En un tubo de hemólisis colocar 100 μl del suero del paciente y 50 μl de la suspensión de GR. 2- Incubar 30 minutos a 37 C si la suspensión de GR se hizo en solución fisiológica. Pero si fue hecha en LISS, incubar 10 minutos a 37 C. 3- Lavar 3 veces con solución fisiológica. Después del último lavado, descartar totalmente el sobrenadante sobre papel absorbente. 4- Agregar 1 gota del SAGH. 5- Centrifugar 1 minuto a 1000 rpm. 6- Resuspender los GR suavemente observando la presencia de aglutinación. Interpretación: -- Aglutina: PCI positiva el paciente tiene Ac irregulares en el suero. Se debe realizar la titulación del Ac haciendo diluciones doble progresivas del suero en solución fisiológica. También se puede identificar el o los Ac detectados mediante el uso de paneles de GR identificadores. -- No Aglutina: PCI negativa Aplicaciones de la PCI Detección de Ac irregulares en suero de embarazadas, de donantes de sangre y de pacientes con clínica de anemias hemolíticas. Identificación de Ac irregulares. Determinación de Ag eritrocitarios a través de antisueros específicos (Ag D débiles, Ag Kell). Pruebas de compatibilidad pretransfusional. Pruebas de compatibilidad conyugal. Observaciones: Ventajas de utilizar LISS o SOSBI Aumenta la sensibilidad de la prueba de Coombs en la detección de la mayoría de los Ac de significación clínica. Permite detectar Ac en baja concentración y de baja afinidad que con la técnica convencional pueden perderse en los lavados previos a la adición del reactivo de Coombs. Permite reducir el tiempo de incubación de la prueba de Coombs de minutos a 10 minutos. Desventajas de utilizar LISS o SOSBI La solución LISS debe ser sometida a un estricto control de la osmolaridad para evitar la fijación inespecífica de complemento. Los GR resuspendidos en LISS no pueden ser utilizados luego de las 24hs desde su preparación.

19 19 Causas de error en la prueba de Coombs Falsos positivos 1. Sensibilización eritrocitaria in vitro por efecto de Ac naturales o del complemento cuando se mantiene la sangre durante cierto tiempo a 4 C antes de su análisis. 2. Lavado insuficiente de los GR. 3. GR autoaglutinados 4. Sobrecentrifugación. Falsos negativos 1. Tiempo insuficiente de la prueba que no permite alcanzar la aglutinación eritrocitaria. 2. Omitir incubación de 10 minutos a temperatura ambiente para demostrar la presencia de complemento. 3. Cuando el Ac es de naturaleza IgA, tener en cuenta que los SAGH normalmente empleados carecen de anti- lga. 4. SAGH de mala calidad debido a mala conservación o contaminación bacteriana. 5. Lavado inadecuado de los GR, lo que facilita la neutralización del SAGH por las inmunoglobulinas plasmáticas o el complemento. 6. Cantidad de moléculas de IgG y C3d presentes en la membrana del GR por debajo del umbral de detección del SAGH ( moléculas por célula). Titulación del SAGH 1. Preparación de GR sensibilizados con anti-d de origen inmune (anti- IgG): Realizar un pool de 3 muestras de GR O Rh(D) positivo. De allí tomar 500 μl de GR lavados y mezclarlos con 500 μl de suero humano con aloanticuerpos de especificidad anti-d (de embarazada o donantes, con un título entre 64 y 256). Incubar 60 min a 37ºC. Homogeneizar cada 5 minutos, para que los GR entren en contacto con los Ac del suero. Sacar una alícuota de 300uL de GR presuntamente sensibilizados, lavarlos 3 veces con solución fisiológica y realizar una suspensión al 3%. De esa suspensión tomar 50 μl y agregarle 100 μl de SAGH. Centrifugar y leer. Se debe obtener una aglutinación tal que permita visualizar reacciones débiles, lo ideal es obtener una intensidad de Realizar diluciones doble progresivas en S.F. del SAGH Tubos Dilución final 1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 Sol. Fisiol μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL SAGH 100μL 100μL Suspensión de GR sensibilizados 50μL 50μL 50μL 50μL 50μL 50μL 50μL 50μL 50μL 50μL al 3%. 3. Centrifugar 1 minuto a 1000 rpm, leer y determinar título en el tubo con la mayor dilución de SAGH que presente aglutinación macroscópica.

20 20 INVESTIGACIÓN DE CRIOAGLUTININAS. Las anemias hemoliticas autoinmunes (AHAI) constituyen un grupo de citopenias en las que hay una destrucción de GR por mecanismos inmunológicos. Se denominan autoinmunes por la presencia de Ac dirigidos contra los propios Ag eritrocitarios. Las características serológicas de los Ac implicados permite clasificarlos en: AHAI por Ac calientes. AHAI por Ac fríos: - enfermedad de las aglutininas frías. - hemoglobinuria paroxística a frigore. En la enfermedad de las aglutininas frías, los Ac responsables son aglutinantes (IgM), y actúan a una temperatura menor a 37ºC, siendo su rango óptimo entre 0 C y 10 C. Su especificidad está dada contra los Ag del sistema eritrocitario I i. Estos Ag se hallan en casi todos los GR. El Ag I se encuentra en grandes cantidades en los GR del adulto, mientras que por el contrario los Ag i son abundantes en los GR del recién nacido. El cambio i por I tiene lugar en los primeros 18 meses de vida. Método: Muestra: ----Suero del paciente obtenido a 37 C para evitar el atrapamiento de los Ac en el coágulo a bajas temperaturas. El tubo con sangre sin anticoagulante recién extraído se coloca rápidamente en baño a 37 C 2 horas. Separar el suero con pipeta pasteur y centrifugar en otro tubo. ----Suspensión de GR del paciente al 5% en solución fisiológica. Reactivos: ----Suspensión de GR fenotipo OI (adulto) al 5% en solución fisiológica ----Suspensión de GR fenotipo Oi (bebé) al 5% en solución fisiológica. Técnica: 1- Realizar diluciones doble progresivas del suero del paciente en solución fisiológica en tres hileras de 12 tubos cada una. 2- Enfrentar los tubos de la primera hilera con la suspensión de sus propios GR. 3- Enfrentar los tubos de la segunda hilera con la suspensión de GR OI. 4- Enfrentar los tubos de la segunda hilera con la suspensión de GR Oi. Tubos Dilución 1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1028 1/2048 final Sol.Fisiol μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL 100μL Suero del paciente 100μL 100μL GR al 5% 50μL 50μL 50μL 50μL 50μL 50μL 50μL 50μL 50μL 50μL 50μL 50μL 5- Incubar 18 a 24 horas a 4 C (técnica de sedimentación). 6- Sacar los tubos de la heladera de a uno por vez y observar inmediatamente la presencia de aglutinación ya que es reversible. Interpretación Se considera positividad patológica cuando el título es igual o superior a 1/64.

21 21 Nota: para preparar las suspensiones deben lavarse los GR tres veces con solución fisiológica precalentada a 37 C. BIBLIOGRAFIA Human blood groups. Daniels G. Oxford, England: Blackwell Scientific Publications. 2 nd edition Williams Hematology. Kenneth Kaushansky, Marshall A. Lichtman, Thomas J. Kipps, Uri Seligsohn, Josef T. Prchal. 8 th edition Dacie and Lewis Practical Haematology. Barbara J Bain, Imelda Bates, Michael A Laffan, S. Mitchell Lewis.11 th edition Inmunología. Biología y patología del sistema inmune. Regueiro González J.R., López Larrea S., González Rodríguez S. Editorial Médica Panamericana. 3 a edición Essential Guide to Blood Groups. Geoff Daniels, Imelda Bromilow Henry s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. Richard A. McPherson, Matthew R. Pincus. 22 th edition. 2011