BIOCHIP ELECTRÓNICO PARA LA DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN SIMULTÁNEA DE LOS PRINCIPALES VIRUS Y BACTERIAS PATÓGENOS DE LA PATATA

Transcripción

1 INSTITUTO VALENCIANO INVESTIGACIONES AGRARIAS BIOCHIP ELECTRÓNICO PARA LA TECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN SIMULTÁNEA LOS PRINCIPALES VIRUS Y BACTERIAS PATÓGENOS LA PATATA Ruiz-García, A. B. 2 ; Olmos, A. 2 ; Arahal, D. R. 1 ; Antúnez, O. 1 ; Martínez- Bono, B. 1 ; Llop, P. 1, Pérez-Ortín, J. E. 1 ; López, M. M. 2 ; Cambra, M. 2 1 Universidad de Valencia 2 IVIA, Moncada, Valencia

2 INSTITUTO VALENCIANO INVESTIGACIONES AGRARIAS Cultivo de gran importancia económica Virus y bacterias producen grandes pérdidas Programas de selección sanitaria de la patata de siembra Análisis de tubérculos mediante técnicas ELISA Objetivo: método de detección basado en chips de DNA

3 INSTITUTO VALENCIANO INVESTIGACIONES AGRARIAS Chips electrónicos Procedimientos electrónicos Deposición de la sonda Deposición de la muestra Hibridación Detección

4 INSTITUTO VALENCIANO INVESTIGACIONES AGRARIAS Sistema robotizado de Nanogen Robot de fabricación e hibridación de chips Robot de lectura de chips Ordenador y software de control

5 El Chip de Nanogen INSTITUTO VALENCIANO INVESTIGACIONES AGRARIAS

6 El Chip de Nanogen INSTITUTO VALENCIANO INVESTIGACIONES AGRARIAS

7 INSTITUTO VALENCIANO INVESTIGACIONES AGRARIAS Ventajas del sistema Control de las condiciones de hibridación simultáneo a la detección Temperatura Restricción iónica Restricción eléctrica La restricción eléctrica permite aplicar condiciones diferentes a cada punto Posibilidad de detectar diferencias de un solo nucleótido

8 Métodos de ensayo INSTITUTO VALENCIANO INVESTIGACIONES AGRARIAS Oligos biotinilados Cy5 Deposición de la sonda de captura biotinilada Hibridación de la muestra desnaturalizada Hibridación de un oligo fluorescente Amplicones biotinilados Cy3 Deposición de un producto de PCR biotinilado Hibridación de un oligo fluorescente

9 patógenosnstituto I VALENCIANO INVESTIGACIONES AGRARIAS Virus PVY PVX PLRV Bacterias Ralstonia solanacearum Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum Pectobacterium carotovorum subsp. atrosepticum Pectobacterium chrysanthemi

10 Detección de virus INSTITUTO VALENCIANO INVESTIGACIONES AGRARIAS Extracto vegetal RNA RT-PCR multiplex Nanochip Fragmento de PCR amplificado con cebadores específicos del virus Sonda fluorescente Sonda de captura biotinilada

11 Detección de virus INSTITUTO VALENCIANO INVESTIGACIONES AGRARIAS nm 1 nm 25 nm 5 nm captura 5 nm 1 nm 25 nm 5 nm captura 5 nm 1 nm 25 nm 5 nm captura PVY PVX PLRV

12 Detección de virus Pruebas de especificidad INSTITUTO VALENCIANO INVESTIGACIONES AGRARIAS PVY PVX PLRV PVY-O PVY-N PVY-NTN PVX PLRV PVY-O PVY-N PVY-NTN PVX PLRV PVY-O PVY-N PVY-NTN PVX PLRV

13 Caracterización de PVY INSTITUTO VALENCIANO INVESTIGACIONES AGRARIAS Extracto vegetal RNA RT-PCR Nanochip Producto de PCR biotinilado Sonda fluorescente

14 INSTITUTO VALENCIANO INVESTIGACIONES AGRARIAS Caracterización de PVY PVY-O PVY-N PVY-NTN 1 PVY-O PVY-N PVY-NTN PVY PVY N/NTN

15 Detección de bacterias INSTITUTO VALENCIANO INVESTIGACIONES AGRARIAS Extracto vegetal DNA PCR Nanochip Producto de PCR biotinilado rdna 16S Sonda fluorescente

16 INSTITUTO VALENCIANO INVESTIGACIONES AGRARIAS Detección de bacterias nm 5 nm 1 nm 2 nm 3 nm 6 nm ºC 27ºC 1 nm 5 nm 1 nm 2 nm c 3 nm 6 nm C 27ºC 1 nm 5 nm 1 nm 2 nm 3 nm 6 nm 24 C 27ºC Ralstonia solanacearum Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum y atrosepticum Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum

17 INSTITUTO VALENCIANO INVESTIGACIONES AGRARIAS Detección de bacterias C 24 C 1 nm 5 nm 1 nm 2 nm 3 nm 6 nm 27ºC 1 nm 5 nm 1 nm 2 nm 3 nm 6 nm 27ºC Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus Pectobacterium chrysanthemi

18 Esta tecnología ofrece una alternativa interesante para el diagnóstico molecular de patógenos de patata, si se consigue simplificar el ensayo y abaratar el coste. Conclusiones INSTITUTO VALENCIANO INVESTIGACIONES AGRARIAS Se ha diseñado un Nanochip capaz de detectar simultáneamente los virus PVY, PVX y PLRV. El análisis del chip se lleva a cabo en un único ensayo en multiplex para los tres virus. Además el sistema de Nanogen permite diferenciar entre las razas de PVY, PVY y PVY N/NTN. Se ha diseñado un Nanochip capaz de detectar simultáneamente las bacterias Ralstonia solanacearum, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum y atrosepticum, Pectobacterium chrysanthemi y Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.