Hepatitis C. Biología Molecular Su utilidad en el diagnóstico, pronóstico y tratamiento.
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- Roberto García del Río
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1 Hepatitis C Biología Molecular Su utilidad en el diagnóstico, pronóstico y tratamiento diego.arrigo@hospitalitaliano.org.ar
2 Según estudio del CDC en el 2013 la hepatitis C produjo más muertes en EEUU que la combinación de 60 enfermedades infecciosas incluyendo HIV, TBC y neumococo El número de muertes por HCC crecen más rápidamente que por cualquier otro tipo de cáncer
3 Hepatitis C Qué Sabemos? Es una enfermedad viral contagiosa que afecta el hígado, que puede causar hepatitis tanto aguda como crónica. La evolución natural de la enfermedad es el desarrollo de cirrosis y el riesgo de desarrollo de hepatocarcinoma. Se trata de la primera causa de trasplante y de muerte de origen hepático El diagnóstico inicial se realiza mediante la detección de anticuerpos anti- VHC y se confirma demostrando la replicación viral por métodos moleculares. La indicación de tratamiento se establece tras la evaluación del grado de fibrosis y el genotipo de VHC que ha infectado al paciente. Los antivírales actuales pueden curar más del 90% de los casos de infección por el VHC, lo que reduce el riesgo de muerte por cáncer de hígado y cirrosis, pero el acceso al diagnóstico y el tratamiento es limitado
4 Epidemiologia
5 Historia natural de la Hepatitis C El 75% de las infecciones agudas son asintomáticas Muy difícil la detección temprana! Infección aguda Cuando persite por casos mas en de el mundo seis meses Se cree que tanto factores virales como del hospedador contribuyen Recuperación a la incapacidad Valores del normales sistema / inmune para resolver espontánea la infección inicial levemente conduciendo elevados a una infección 15%-30% de AST-ALTs crónica Infección crónica 70% - 85 % El 25% ictericia y aumento de las transaminasas Valores Estable 20 años persistentemente 70%-85% elevados de Cirrosis Hepática 15%-30% enzimas hepáticas Cirrosis descompensada 6% x año Muertes: al año en el mundo Transplante o muerte 3 % x año Carcinoma hepatocelular 4% x año
6 Quedará a criterio médico detenerse aquí si no se sospecha de: Algoritmo diagnóstico recomendado (consenso a) Infección aguda (exposición dentro de los últimos 6 meses) b) Inmunosupresión 2013) para severa identificación activa de HCV Infección Resuelta De Infección lo contrario: Aguda RNA o HCV Crónica (a) (b) o seguimiento SOLO indica para probable la Detección detección - Con de replicación - anticuerpos (activa) anti-hcv (a). infección con el VHC. En todos - Sin los replicación casos evaluar (Intermitencia) elevación de ALT. Reactivo Falso positivo biológico No Reactivo No detectable - ARN HCV No se detecta ac anti-hcv Fin * No tiene infección activa por VHC Pruebas adicionales apropiadas ** Detectable Infección activa por HCV Tratamiento Fuente: CDC. Testing for HCV infection: An update of guidance for clinicians and laboratorians. MMWR 2013;62(18
7 Diagnóstico de Hepatitis C Ac anti-hcv RNA HCV + - No tiene infección activa por Hepatitis C Uso de un segundo ensayo de detección de ac anti HCV diferente al usado inicialmente o LIA - Falso positivos Biológico a) Infección pasada con resolución espontánea + b) Falso No detectable del RNA HCV. c) Infección crónica con disminución transitoria del nivel de viremia (Intermitencia) Si se sospecha de b) o c) justificaría la repetición de un RNA HCV RNA - FP + Falso N/D o Intermitencia
8 Algoritmo Consenso Hepatitis C 2013 Secuencia recomendada para identificación activa de HCV - Detección ac anti HCV No Reactivo Reactivo No detectable - ARN HCV No se detecta ac anti-hcv Fin * No tiene infección activa por VHC Pruebas adicionales apropiadas ** Detectable Infección activa por HCV Tratamiento Fuente: CDC. Testing for HCV infection: An update of guidance for clinicians and laboratorians. MMWR 2013;62(18
9 Confirmación de infección por HCV Ac anti-hcv RNA HCV Opción Caso confirmado de Infección activa por VHC Ac anti HCV(+) RNA-HCV Cualitativa Detectable RNA-HCV Cuantitativa Opción 2 Ac anti HCV(+) RNA-HCV Cuantitativa Decisión de tratamiento
10 Diagnóstico de la hepatitis C Métodos serológicos y de Biología molecular Detección de Anticuerpos Anti - HCV (EIA-CMIA) Detección de Anticuerpos Serológicos Anti HCV (LIA) Detección de HVC-Ag del core o Ag-Ac Detección cualitativa de HCV-RNA Cuantificación de Moleculares la viremia HCV-RNA (carga viral) Determinación del genotipo HCV
11 Patrón serológico durante la infección por VHC
12 Patrón serológico de Infección aguda con resolución espontánea Patrón serológico de Infección aguda con progresión a la infección crónica
13 Métodos moleculares Para determinar infección activa por VHC Permiten una detección tanto cualitativa como cuantitativa del ARN-VHC circulante en suero o plasma. El ARN-VHC es detectable entre la 1 y 2 semana después de la infección (aproximadamente 1 mes antes de la detección de anticuerpos)
14 Ensayos Moleculares (cualitativos) Aplicaciones de su detección Diagnóstico de la infección en pacientes con serología positiva (replicación) Diagnóstico de hepatitis C aguda durante el período de ventana Detectar la infección en pacientes inmunodeficientes, inmunosuprimidos o hemodializados (con serología negativa) Tamizaje en donantes de sangre Detectar la infección en recién nacidos de madres infectadas Ref: Virología Medica. Cap 24.5 Carballal -Oubiña
15 Métodos Cualitativos Informe de resultado: Método: Especificar ensayo y marca comercial Límite mínimo de detección del ensayo (LmDE)=Expresión en UI/ ml Resultado Detectable / No Detectable La detección de ARN viral indica que el virus se está multiplicando activamente (replicación viral). Técnica Para la sensibilidad de esa técnica no detecta virus circulando Por eso es importante conocer el limite de detección del ensayo Estos ensayos están basados en la amplificación de la secuencia blanco mediante: RT-PCR (Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa equipos comerciales o no comerciales TMA (Amplificaciòn mediada por transcripción) Equipos comerciales
16 Ensayos moleculares Cuantitativos (Carga viral) Herramienta multidiagnóstico Monitorea y Predice la respuesta al tratamiento: cuanto más baja sea la carga viral antes de la terapia, hay más posibilidades que funcione. El nivel de carga viral no guarda relación con el grado de lesión hepática y no permite inferir el estadio de la enfermedad hepática. Con el aumento de la sensibilidad y al descender los costos 1. Confirma una infección aguda por VHC 2. Verificar el diagnóstico de infección vertical 3. Confirma una hepatitis crónica C 4. Confirma la infección en pacientes con una alteración de la inmunidad humoral La RT-PCR en tiempo real es la técnica mas usada para detectar y cuantificar el ARN-VHC en la práctica clínica
17 Primera consideración Carga Viral VHC Existen en el mercado diversas alternativas comerciales que permiten estudiar la cantidad de virus circulante: - Amplifican el genoma - Diferentes sistemas de detección - Amplifican señales - Distintas unidades de medida - UI/mL - Copias/mL (factor de conv.) La OMS ha establecido un estándar internacional expresado en UI/ml para poder intercronvertir los resultados obtenidos por diferentes equipos comerciales Segunda consideración : Los métodos comerciales tienen diferentes: - Límites de sensibilidad y diferentes rangos de detección. Existe variabilidad en los resultados entre las diferentes técnicas Es recomendación medir la carga viral durante el tratamiento con el mismo método y si se puede en el mismo laboratorio
18 Carga viral Informe de resultado: Método: Especificar ensayo y marca comercial Rango dinámico del ensayo : LmCE (límite mínimo de cuantificación) - Concentración mas baja de HCV RNA detectable y cuantificable LMCE (límite máximo de cuantificación) - Concentración mas alta de HCV RNA detectable y cuantificable Límite de detección del ensayo (LmDE)=Expresión en UI/ Ml - Mínima concentración de HCV RNA detectable Resultado : No Detectable / Detectable no cuantificable/ Detectable Valor Hallado: Resultado expresado en UI/ml y Log. (Solo en resultados detectables)
19 LmCE > o = LmDE Ejemplo LmCE : 25 UI/mL y LmDE : 10 UI/mL Resultado del paciente : 20 UI/mL Detectable no cuantificable
20 Ensayos cuantitativos comerciales disponibles - No detectable : Indica que no se detecta la presencia del virus - Detectable <25 : Indica que la carga viral del paciente está por debajo del LmCE y NO indica que el paciente NO esté infectado - > indica que la carga viral del paciente excede el LMCE del ensayo
21 Genotipificación: Utilidad en el tratamiento
22 Diversidad, variabilidad genómica del VHC Debido a la diversidad y la alta variabilidad genómica del HCV, desde su descubrimiento se han identificado 6 genotipos principales Genotipos que se tratan son 6 Mas de 70 subtipos
23 Distribución global de genotipos de VHC Los genotipos y subtipos del HCV se distribuyen de forma diferente en diferentes partes del mundo, y algunos predominan en ciertas áreas
24 Prevalencia Ref: Virología Medica. Cap 24.5 Carballal -Oubiña
25 Genotipificación: En pacientes que serán evaluados para terapia antiviral. Por esto es imprescindible realizarlo antes de iniciar el tratamiento Define la dosis y duración de la terapia antiviral, así como la probabilidad de respuesta al tratamiento Métodos de Genotipificación RT-PCR + Secuenciación nucleotídica directa: Goldstandard RT-PCR +Hibridación inversa (INNO-LIPA) RT-PCR + endonucleasas (RFLP)
26 Estrategia para el Estrategia análisis para (secuenciación) el Análisis Sangre entera con EDTA, solo la fracción plasma Extracción del RNA Trascripción Reversa de región de RNA Amplificación del cdna con PCR región NS5b (Termociclador) I PCR para obtener producto a secuencia PREPARACION DEL ADN MOLDE A Secuenciación SECUENCIAR de los productos y análisis para determinar PCR asimétrica (Método de Sanger) genotipo de HCV marcados con diferentes fluoróforos Informe de Resultados El informe debe contener el método utilizado, el genotipo y el subtipo detectado acorde a la nomenclatura internacional. Comparación a través de la Herramienta BLAST de la secuencia obtenida con secuencias del HCV caracterizados y disponibles en bases de datos
27 GenoHCV - HIBA 2013 (n=367)
28 INNO-LIPA: Principio de hibridación inversa. Basado en la amplificación mediante RT-PCR seguida de una Hibridación inversa
29 Genotipificación (consideraciones) Se justifica una nueva investigación del genotipo HCV, cuando entre el primer estudio y el comienzo del tratamiento, se produjo o se sospecha una nueva exposición al virus C Historicamente los Genotipos 1 y 4 tienen menos respuesta al tto que genotipos 2 y % rta de Genos 2 y 3 vs 40-50% Genos 1 y 4 a largo plazo Cambia con los AAD
30 Biopsia Hepática: Rol Una vez realizado el diagnóstico Hepatitis C crónica Evaluar el grado de daño hepático (fibrosis o cirrosis) Biopsia hepática (método de referencia) Pruebas no invasivas (Fibroscan). Biopsia hepática método invasivo con baja complicaciones (0.6% -5%). Discrimina entre los distintos tipos de fibrosis y el grado de actividad inflamatoria. Estadíos de F0 a F4. Umbral para iniciar tratamiento F2 Grado de daño hepático + Genotipo = Orientan a las decisiones terapéuticas y la conducta clínica?..y la carga viral? El nivel de carga viral HCV en sangre no muestra relación con el grado de lesión hepática OMS
31 Rol de los métodos no invasivos Elastografía por Fibroscan La utilización del Fibroscan permite la evaluación no invasiva de la Fibrosis Hepática mediante Elastografía Su ventaja es la alta reproducibilidad inter e intra operador y es órgano específico. La Elastografía consiste en la estimación de la rigidez del tejido hepático a una profundidad por debajo de la piel entre 25 a 65 mm, midiendo la velocidad de propagación de una onda de deformación elástica dentro del tejido. Cuanto mayor sea la rigidez que presente el tejido, mayor será la velocidad de propagación de la onda. La medición se realiza en sólo 10 minutos y el resultado se obtiene en el acto.
32 Tratamiento Candidatos: Todos los pacientes con hepatitis crónica por HCV, naive o no respondedores a un tratamiento previo, que quieran ser tratados (efectos adversos). La tasa de curación depende de factores tales como la cepa del virus, el grado de fibrosis y el tipo de tratamiento que se dispensa.
33 Objetivo del tratamiento El objetivo principal es erradicar la infección por el VHC Que se puede prevenir? Cirrosis hepática Hepatocarcinoma (HCC) Manifestaciones extrahepáticas Muerte Habrá una reducción significativa de la morbi-mortalidad Objetivo: RVS: (Respuesta viral sostenida) es cuando el VHC es No-detectable a las 12 semanas después de haberlo completado. Utilizar un método molecular sensible con un límite inferior de detección, de 15 UI/ml Van der Mer AJ et al JAMA 2012
34 Históricamente, el VHC se trató con : Drogas disponibles 2011 Antivirales de acción directa (AAD) emergieron como una nueva promesa para acortar la terapia y reducir efectos secundarios y complicaciones, consiguiendo algunos hasta mas del 90 % de curación Interferón (IFN) Ribavirina (RBV) IFN Pegilado (PEG IFN)
35 AAD: disponibles en la Argentina Los AAD Diseñados para inhibir las proteínas virales involucradas en el ciclo de replicación del HCV Son mucho más eficaces y seguros, con menos efectos adversos y mejor tolerados que los tratamientos antiguos, aunque mas caros. Un único AAD no puede evitar por sí solo la replicación del VHC por eso un tratamiento debe constar de dos AADs de diferente familia de inhibidores como mínimo
36 Evolución del tratamiento Boceprevir Telapreviren G1
37 Las pautas de tratamiento varían principalmente en función de los genotipos del VHC, de los tratamientos previos recibidos y de la presencia o no de cirrosis Sofosbuvir / simeprevir. Sofosbuvir es el mejor inhibidor de la polimerasa. Actúa a nivel de la región NS5B del VHC. Simeprevir es un inhibidor de la proteasa NS3/NS4 de primera generación con acción sobre los genotipos 1, 2, 4, 5 y 6. Con este régimen se trata a pacientes con genotipos 1 y 4, durante 12 semanas y añadiendo ribavirina si existe cirrosis hepática.
38 Tratamiento El acceso al tratamiento del VHC está mejorando, pero sigue siendo limitado (1%) Diagnosticados (20%) Inicio Tto (7%) Recibieron AAD (50%) WHO Global Hepatitis Report 2017
39 Desafío Detectar a los pacientes no diagnosticados Que todos los pacientes puedan acceder al tratamiento Conclusiones Los métodos de detección cualitativos están prácticamente en desuso (Por sensibilidad y costos) Existen métodos que presentan limites de detección y cuantificación diferentes. Se recomienda a los laboratorios que realicen estos ensayos que estén suscritos a programas de control de calidad o que tengan acreditadas las técnicas moleculares ante requisitos internacionales (CAP ISO 15189) Al inicio del tratamiento se debe disponer del genotipo y subtipo viral, la carga viral y una evaluación del grado de fibrosis.
40 Muchas gracias por su atención!
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