Aplicación de técnicas inmunohistoquímicas en el diagnóstico diferencial del carcinoma diferenciado de tiroides.

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1 Aplicación de técnicas inmunohistoquímicas en el diagnóstico diferencial del carcinoma diferenciado de tiroides. J. Merino Montes 1, M. Cava Molina 2, R. Rios Pelegrina 2, AM. Sánchez López 3, E. Sánchez Cantalejo 4, R. García del Moral Garrido 2, M.Gómez Morales 2. 1-Hospital Rafael Méndez (Lorca). Murcia; 2-Hospital U. San Cecilio (Granada); 3-Red de Banco de Tumores de Andalucía; 4-Escuela Andaluza de Salud Pública (Granada).

2 =7,7 =2,3

3 >50 10%

4 PAAF

5

6 I- PROTEÍNAS REGULADORAS DEL CRECIMIENTO Y PROLIFERACIÓN CELULAR Función principal Proteína 1- PROTEÍNAS CODIFICADAS POR ONCOGENES Receptores de factores de crecimiento RET MET Proteínas implicadas en la transducción de señales Proteínas activadoras y coactivadoras transcripcionales RAS FOS IMP3 CITED1 Proteínas reguladoras del ciclo celular Ciclinas D1, D2 y E, P27 2- PROTEÍNAS SUPRESORAS O DE COMPORTAMIENTO SUPRESOR RB1 P53, P63 P16 3- PROTEÍNAS REPARADORAS DEL ADN PARP-1 PTTG1 4- PROTEÍNAS REGULADORAS DE LA APOPTOSIS Caspasas 5- PROTEÍNAS REGULADORAS DE LA LONGITUD DE LOS TELÓMEROS TERT II- OTRAS MOLÉCULAS DE INTERÉS RELACIONADAS CON EL METABOLISMO, ADHESIVIDAD, PROLIFERACIÓN CELULAR Y MATRIZ EXTRACELULAR 1- ENZIMAS Tiroperoxidasa Ciclooxigenasa 2- RELACIONADOS CON ADHESIVIDAD CELULAR Galectina3 CD44, CD57 Cadherina E y P β-catenina 3- SUPERFICIE CELULAR HBME-1 Queratán sulfato 4- CITOESQUELETO CK19 5- MARCADORES DE PROLIFERACIÓN MIB1 (Ki67)

7 Carcinoma papilar BRAF Célula folicular RET/PTC RAS RAS CTNNB1 PTEN /Akt PIK3CA P53 RAS Ca. pobremente diferenciado P27 PTEN /Akt BRAF P27 CTNNB1 P27 RAS P53 PTEN /Akt RAS P53 CTNNB1 Carcinoma anaplásico RAS PAX8/PPAR γ RAS PTEN /Akt PAX8/PPAR γ Aneuploidías RAS PTEN /Akt CTNNB1 P53 RAS PTEN /Akt P53 CTNNB1 PIK3CA P27 Adenoma Carcinoma folicular Basado en: Garcia-Rostan G, Sobrinho- Simões M. Poorly differentiated thyroid carcinoma: an evolving entity.diagnostic Histopathology. 2011; 17(3):

8

9

10 Planteamiento y objetivos 1- Analizar con matrices de tejido marcadores biológicos, que se saben implicados en el cáncer, en una serie amplia de tumores malignos y lesiones benignas de la glándula tiroides. 2- Mediante estudio estadístico pertinente, establecer un perfil molecular característico de las lesiones malignas y de cada tipo histológico de tumor tiroideo, que pueda ser utilizado en el futuro en el diagnóstico preoperatorio (PAAF) de los nódulos tiroideos. 3- Investigar, de igual forma, si existe un patrón molecular que se relacione con el pronóstico.

11 548 casos: AÑO HCN AF G-B Ts TN micpt CPT MCPT CFT CMT CAT CPD Total

12 Nº casos Grupo de patología benigna n= 402 Grupo de casos con patología benigna % HCN (n= 263) 13,7% AF (n= 54) 13,2% GB (n= 52) 8,1% Ts (n= 33) 0 Hiperplasia coloide nodular Tiroiditis Adenoma folicular Graves- Basedow

13 Nº de casos Grupo de patología maligna n= 124 Grupo de casos con patología neoplásica MCPT (n=10) micpt (n=30) CPT 19 CPTc 15 CPTvf 11 CPTvca (n=45) Microcarcinoma papilar Carcinoma papilar Metástasis de CPT Carcinoma folicular Diagnóstico Carcinoma medular Carcinoma anaplásico Carcinoma insular CFT (n=31) CMT CAT CPD (n=4) (n=2) (n=2)

14 A B C D E F G H

15

16 Marcador Patrón de tinción Clona Dilución Recuperación antigénica Laboratorio comercial IMP-3 Citoplasmático /50 Tris high ph9 DAKO CITED-1 Cito/ Nuclear Ab /50 EDTA ph8 Master Diagnostica Ciclina D1 Nuclear SP-4 Prediluido Tris high ph9 DAKO Ciclina E Nuclear 13A3 Prediluido Tris high ph9 Master Diagnostica P27 Nuclear DCS-72F6 Prediluido Tris high ph9 Master Diagnostica P53 Nuclear DO-7 Prediluido Tris high ph9 DAKO P63 Nuclear 4A4 Prediluido Tris high ph9 Master Diagnostica PARP-1 Nuclear/Cito. Policlonal Prediluido Tris low ph6 Master Diagnostica Tiroperoxidasa Citoplasmático MOab47 1/50 Tris high ph9 DAKO COX2 Citoplasmático SP21 Prediluido Tris high ph9 Master Diagnostica Galectina-3 Citoplasmático 9C4 1/100 Tris high ph9 Master Diagnostica CD44s Cito/ Membr CH Prediluido Tris Low ph6 Master Diagnostica CD44v6 Cito/ Membr. VFF-18 Prediluido EDTA ph8 Master Diagnostica CD57 Cito/ Membr. NK-1 Prediluido Tris high ph9 Master Diagnostica E-cadherina Membrana NCH-38 Prediluido Tris high ph9 DAKO β-catenina Membrana Bcatenin1 Prediluido Tris high ph9 DAKO HBME-1 Membr/Cito. HBME-1 Prediluido Tris high ph9 DAKO KS Membr/Cito. 373E1 Prediluido Tris low ph6 Master Diagnostica CK19 Citoplasmático RCK-108 Prediluido Tris high ph9 DAKO Ki67 Nuclear MIB-1 Prediluido Tris low ph6 DAKO

17 Marcadores Puntuación cuantitativa Puntuación cualitativa IMP 3 <10% 10-25% 25-50% >50% Neg. Débil Moderada Fuerte CITED1 <10% 10-25% 25-50% >50% Neg. Débil Moderada Fuerte Ciclina D1 <10% 10-25% 25-50% >50% Neg. Débil Moderada Fuerte Ciclina E <1% 1-3% 3-5% >5% Neg. Débil Moderada Fuerte P27 <10% 10-25% 25-50% >50% Neg. Débil Moderada Fuerte P53 <10% 10-25% 25-50% >50% Neg. Débil Moderada Fuerte p63 <1% 1-3% 3-5% >5% Neg. Débil Moderada Fuerte PARP-1 ( ) <10% 10-25% 25-50% >50% Neg. Débil Moderada Fuerte TPO <10% 10-25% 25-50% >50% Neg. Débil Moderada Fuerte COX-2 <10% 10-25% 25-50% >50% Neg. Débil Moderada Fuerte Gal-3 <10% 10-25% 25-50% >50% Neg. Débil Moderada Fuerte CD44s <10% (*) (**) (***) Neg. Débil Moderada Fuerte CD44v6 <10% (*) (**) (***) Neg. Débil Moderada Fuerte CD57 <10% 10-25% 25-50% >50% Neg. Débil Moderada Fuerte E-cad <10% 10-25% 25-50% >50% Neg. Débil Moderada Fuerte Β-catenina (#) <10% 10-25% 25-50% >50% Neg. Débil Moderada Fuerte HMBE-1 <10% 10-25% 25-50% >50% Neg. Débil Moderada Fuerte KS <10% 10-25% 25-50% >50% Neg. Débil Moderada Fuerte CK19 <10% 10-25% 25-50% >50% Neg. Débil Moderada Fuerte Ki67 <1% 1-3% 3-5% >5% Neg. Débil Moderada Fuerte (*) Tinción de membrana con patrón irregular. (**) Tinción de membrana con tinción casi completa (apical y lateral/basal y lateral). (***) Tinción completa de membrana. ( ) Valoración de la expresión nuclear, la valoración citoplasmática atendió a la presencia/ausencia de la tinción. (#) Valoración compartida tanto para la expresión nuclear como para la citoplasmática.

18 Test estadísticos empleados: Test de U Mann Whitney Test de Kruskal-Wallis Chi-cuadrado Test de Fischer Modelo de regresión logística logit( p) X m X m Cálculo de S, E, VPP, VPN y Eficiencia Enfermos No enfermos Test + a (VP) b (FP) Total test + Test - c (FN) d (VN) Total test - Total de enfermos Total de no enfermos TOTAL

19 Frecuencia Resultados Edad

20 Media Edad Edad Distribución de casos según sexo masculino Sexo femenino masculino Sexo femenino Frecuencia Frecuencia 30 40

21 Comparación entre patología benigna y maligna

22 Marcadores Patología benigna Patología maligna p χ 2 IMP-3 38/395 (9,6%) 44/124 (35,5%) < CITED-1 15/402 (3,7%) 37/124 (29,8%) < Ciclina D1 99/402 (24,6%) 74/122 (60,7%) < Ciclina E 3/396 (0,8%) 9/119 (7,6%) < P27 147/400 (36,8%) 39/121 (32,2%) P53 42/394 (10,7%) 33/119 (27,7%) < p63 3/397 (0,8%) 10/120 (8,3%) < PARP-1 50/393 (12,7%) 24/120 (20%) PARPc-1 12/393 (3,1%) 19/120 (15,8%) < TPO 319/397 (80,3%) 47/122 (38,5%) < COX-2 327/404 (80,9%) 89/123 (72,4%) Gal-3 15/399 (3,8%) 46/123 (37,4%) < CD44s 166/395 (42%) 80/120 (66,7%) < CD44v6 86/399 (21,5%) 63/122 (51,6%) < CD57 34/402 (8,5%) 28/122 (23%) < E-cad 382/392 (97,4%) 106/120 (88,3%) < β-catenina 79/396 (19,9%) 38/122 (31,1%) HBME-1 13/401 (3,2%) 63/119 (52,9%) < KS 9/393 (2,3%) 54/120 (45%) < CK19 44/400 (11%) 58/122 (47,5%) < Ki67 32/393 (8,1%) 57/122 (46,7%) <

23 Marcador Sensibilidad Especificidad VPP VPN Precisión IMP CITED Ciclina D Ciclina E P P P PARP PARP-1c TPO COX Galectina CD44s CD44v CD E-cadherina β-catenina HBME Queratán sulfato CK Ki

24 KS HBME-1 TPO CD44v6 Ciclina D1

25 Sensibilidad Análisis multivariante Curva ROC: maligno vs benigno Área= Especificidad = 86% CITED-1 Ki67 TPO HBME-1 Gal-3

26 Sensibilidad Modelo 1 Modelo Especificidad CITED-1 Ki67 TPO HBME-1 Gal = CK19 HBME-1 Gal =

27 Sensibilidad Modelo 1 Modelo Especificidad = HBME-1 KS

28 Diagnóstico diferencial entre AF y CDT

29

30 Análisis logístico multinomial Galectina-3 e.e. Riesgo Sig. CFT CPT P<0.001 HBME-1 e.e. Riesgo Sig. CFT CPT P<0.001 Queratán sulfato e.e. Riesgo Sig. CFT CPT P<0.001 CITED1 e.e. Riesgo Sig. CFT CPT E-cadherina e.e. Riesgo Sig. CFT CPT Citoqueratina 19 e.e. Riesgo Sig. Tiroperoxidasa e.e. Riesgo Sig. CFT CPT P<0.001 CFT CPT P<0.001 P<0.001 PARP-1 e.e. Riesgo Sig. CFT CPT ki67 e.e. Riesgo Sig. CFT CPT

31 Verdaderos positivos Diagnóstico diferencial CPT/CFT Curva ROC: papilar vs. folicular Area= Falsos positivos + = 70% Ki67 HBME-1

32 Análisis de los marcadores en función del tipo histológico y de factores pronósticos

33 Marcadores MiCPT CPTc CPTvf CPTvca MCPT p χ 2 IMP3 9/29 (31%) 2/18 (11,1%) 7/15 (46%) 7/9 (77,8%) 4/10 (40%) CITED1 6/30 (20%) 6/19 (31,6%) 3/15 (20%) 8/11 (72,7%) 5/10 (50%) Ciclina D1 15/30 (50%) 12/18 (66,7%) 8/15 (53,3%) 9/11 (81,8%) 9/10 (90%) Ciclina E 0/30 (0%) 2/17 (11,8%) 1/15 (6,7%) 0/11 (0%) 3/10 (30%) P27 10/30 (33,4%) 5/18 (27,8%) 3/15 (20%) 3/11 (27,3%) 5/10 (50%) P53 4/30 (13,3%) 3/18 (16,7%) 1/15 (6,7%) 4/9 (44,4%) 7/10 (70%) p63 1/30 (3,3%) 5/18 (27,8%) 0/15 (0%) 1/8 (12,5%) 3/10 (30%) PARP-1 6/30 (20%) 1/18 (5,6%) 1/14 (6,7%) 1/9 (11,1%) 2/10 (20%) PARP-1c 3/30 (10%) 4/18 (22,3%) 3/15 (20%) 1/8 (12,5%) 2/10 (20%) 0,757 1,687 TPO 17/30 (56,6%) 7/19 (42,1%) 11/15 (73,3%) 0/10 (0%) 1/10 (10%) COX-2 23/30 (76,7%) 13/18 (72,2%) 8/15 (53,3%) 7/11 (63,6%) 8/10 (80%) Gal-3 8/30 (26,7%) 11/18 (61,1%) 5/14 (35,7%) 8/9 (88,9%) 9/10 (90%) CD44s 18/30 (58,6%) 14/18 (77,8%) 13/15 (86,7%) 9/9 (100%) 8/10 (80%) CD44v6 13/29 (44,8%) 8/19 (42,1%) 8/15 (53,3%) 6/10 (60%) 7/10 (70%) CD57 3/30 (10%) 4/18 (22,2%) 3/15 (20%) 4/11 (36,7%) 4/10 (40%) E-cad 27/29 (93,1%) 16/18 (88,9%) 15/15 (100%) 6/10 (60%) 7/10 (70%) Β-cat. 11/30 (36,7%) 7/19 (36,8%) 5/15 (33,3%) 1/10 (10%) 2/10 (20%) HBME-1 14/29 (48,3%) 14/18 (77,8%) 8/15 (53,3%) 9/9 (100%) 8/10 (80%) KS 11/29 (38%) 14/18 (77,8%) 6/15 (40%) 10/11(90%) 8/10 (80%) CK19 11/29 (38%) 12/18 (66,7%) 8/15 (53,3%) 8/11 (72,7%) 8/10 (80%) Ki67 11/30 (36,7%) 8/18 (44,4%) 4/11 (26,7%) 5/11 (45,5%) 6/10 (60%)

34 Marcadores CPT met CPT no met p χ 2 IMP-3 4/11 (36,4%) 12/31 (38,7%) 1 0,189e-01 CITED 1 7/13 (53,8%) 10/32 (31,3%) 0,156 2,008 Ciclina D1 8/12 (66,7%) 21/32 (65,6%) 1 0,421e-02 Ciclina E 1/11 (9,1%) 2/32 (6,3%) 1 0,102 P27 3/12 (25%) 8/32 (25%) 1 0,00 P53 2/11 (18,2%) 6/31 (19,4%) 1 0,725e-02 p63 2/11 (18,2%) 4/31 (12,9%) 0,643 0,185 PARP-1 2/11 (18,2%) 1/31 (3,2%) 0,163 2,743 PARP-1c 2/11 (18,2%) 6/31 (19,4%) 1 0,725e-02 TPO 0/13 (0%) 16/31 (51,6%) 0,001 10,544 COX 9/12 (75%) 19/32 (59,4%) 0,487 0,921 Gal-3 9/11 (81,8%) 15/30 (50%) 0,085 3,357 CD44s 9/11 (81,8%) 27/31 (87,1%) 0,674 0,185 CD44v6 5/12 (41,7%) 17/32 (53,1%) 0,498 0,458 CD57 3/12 (25%) 8/32 (25%) 1 0,00 E-cad 9/12 (75%) 28/31 (96,9%) 0,325 1,693 Β-catenina 4/12 (33,3%) 9/32 (28,1%) 0,727 0,114 HBME-1 9/11 (81,8-%) 22/31 (71%) 0,696 0,494 KS 9/12 (75%) 20/31 (64,5%) 0,720 0,433 CK19 7/12 (53,8%) 21/32 (65,6%) 0,732 0,201 Ki67 4/12 (33,3%) 13/32 (40,6%) 0,658 0,196

35 Marcadores AF CFmi CFai p χ 2 IMP3 17/53 (32,1%) 9/19 (47,4%) 3/12 (25%) CITED-1 8/52 (15,4%) 5/19 (26,3%) 4/13 (30,8%) Ciclina D1 34/53 (64,2%) 13/19 (68,9%) 5/12 (41,7%) Ciclina E 3/53 (5,7%) 1/19 (5,3%) 0/12 (0%) P27 25/53 (47,2%) 7/18 (38,9%) 5/12 (41,7%) P53 16/52 (30,8%) 7/18 (38,9%) 5/12 (41,7%) P63 1/53 (1,9%) 0/19 (0%) 0/12 (0%) PARP-1 14/52 (26,9%) 10/19 (52,6%) 2/12 (16,7%) PARP-1c 6/52 (11,5%) 1/19 (5,3%) 2/12 (16,7%) TPO 45/50 (90%) 9/18 (50%) 3/13 (23,1%) 9,1e COX-2 44/53 (83%) 16/19 (84,2%) 10/13 (76,9%) Gal-3 3/53 (5,7%) 2/19 (10,5%) 3/12 (25%) CD44s 34/52 (65,4%) 8/19 (42,1%) 9/12 (75%) CD44v6 24/52 (53,8%) 11/19 (57,9%) 7/12 (58,3%) CD57 18/53 (34%) 5/19 (26,3%) 3/12 (25%) E-cad 52/53(98,1%) 19/19 (100%) 11/12 (91,7%) β-catenina 15/53 (28,3%) 6/19 (31,6%) 2/12 (16,7%) HBME-1 6/53 (11,4%) 3/19 (15,8%) 6/12 (50%) KS 6/53 (11,4%) 2/19 (10,5%) 4/12 (33,3%) CK19 7/53 (13,2%) 7/19 (36,8%) 2/13 (15,4%) Ki67 16/53 (30,2%) 11/18 (61,1%) 8/13 (61,5%)

36 CONCLUSIONES

37 1 La aplicación de técnicas inmunohistoquímicas para detectar determinados antígenos célulares es un procedimiento útil y de ayuda en el diagnóstico de los carcinomas diferenciados de tiroides.

38 2 a) El estudio simultáneo de los marcadores Gal-3, HBME-1, ki67, CITED 1 y TPO ha resultado la combinación más útil en nuestro estudio para distinguir los carcinomas diferenciados de tiroides de las lesiones benignas. b) Esta combinación resulta igualmente eficaz si se sustituye la determinación de HBME-1 por la de KS. c) Las combinaciones reseñadas anteriormente son más eficaces para el diagnóstico de carcinoma diferenciado de tiroides que el uso simultáneo de CK19, Gal-3 y HBME-1.

39 3 Los marcadores que usados de forma individual presentan mayor precisión en el diagnóstico diferencial de los carcinomas diferenciados de tiroides, particularmente para el carcinoma papilar, son el HBME-1 y queratán sulfato.

40 4 A pesar de que estos dos marcadores, HMBE-1 y queratán sulfato, tienen una eficacia diagnóstica superponible, la distinta distribución celular que presentan indica que los anticuerpos utilizados para su detección reconocen moléculas diferentes.

41 5 En el carcinoma papilar de tiroides la ausencia de TPO y la expresión de Gal-3 son característicos de las formas más agresivas y por tanto son marcadores de progresión tumoral.

42 6 En el carcinoma papilar de tiroides la pérdida de expresión de TPO en el tumor primario se relaciona significativamente con la existencia de metástasis ganglionares en el momento del diagnóstico. Este hecho puede ser de utilidad para replantear la necesidad de completar la cirugía en aquellos casos en que esta fuera incompleta de inicio.

43 7 En el carcinoma folicular la ausencia de TPO y la expresión de HBME-1 se relacionan con las formas más agresivas y por tanto son marcadores de progresión tumoral.

44 8 Un valor superior a 3 en nuestra escala, con la tinción inmunohistoquímica para Ki67 utilizando el anticuerpo monoclonal MIB 1, se relaciona con el diagnóstico de carcinoma folicular, un hecho a considerar en el diagnóstico diferencial de las neoplasias foliculares.

45 9 De nuestro propio estudio y de la revisión de la literatura científica al respecto se deduce la necesidad de establecer protocolos técnicos y de valoración homogéneos para el estudio de marcadores en el diagnóstico diferencial de las neoplasias de tiroides, de forma semejante a los que ya existen para otras neoplasias y que puedan ser reproducibles en los distintos laboratorios de Anatomía Patológica.

46 One day, we imagine that cancer biology and treatment at present, a patchwork quilt of cell biology, genetics histopathology, biochemistry, immunology, and pharmacology- will become a science with a conceptual structure and logical coherence that rivals that of chemistry of physics. D. Hanahan. 2010

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