INGENIERíA BIOFARMACÉUTICA

Transcripción

1 INGENIERíA BIOFARMACÉUTICA Mario Moisés Álvarez Centro de Biotecnología FEMSA TECNOLÓGICO DE MONTERREY Grupo Ingeniería de Bioreacción y Biotecnología Farmacéutica. DIA. 2nd Latin American Regulatory Conference (LARC) Ciudad de México, México. Noviembre

2 INGENIERÍA BIOFARMACÉUTICA Qué es un Biofármaco? Proteína ó Ácido Nucleico Fines terapéuticos Obtenidos por vía biotecnológica No obtenidos directamente por extracción de fuentes naturales ( non engineered ) entonces, generalmente hay una célula recombinante de por medio Walsh G. (2003). Biopharmaceuticals: Biochemistry and Biotechnology. Second Editions. Wiley. 551 pp. EJEMPLOS DE BIOFARMACOS Insulina recombinante Eritropoyetina Interferón Hormona del Crecimiento Humana Recombinante Anticuerpos Monoclonales Terapias T i basadas en suministro i de RNAi 2

3 HISTORIA Y NÚMEROS Industria Farmacéutica: apenas 65 años de historia Valor total en 1980: 100 billones de dlls= 100,000,000,000 dlls Industria Biofarmacéutica: comenzó a principios de los 80 Grandes nombres: Genentech, Amgen, Centocor, Chiron, Wyeth, Serono, Roche, Cytogen, Eli Lily. Farma migrando a biofarma: Merck, BMS, Abbott, Novartis. VALOR SOLO BIOFARMA SOLOLAS LAS 10 PRIMERAS: According to: Biotech Life Sciences: A global Transformation. 21st Annual Report On the Industry. Burrill&Company. STEVE Burrill. $491 Billon nes dlls $441 $52 $39 $

4 nes dlls Billo $491 $441 $52 $39 $15 Amgen Genentech Chiron Genentech ALZA Cetus Biogen ALZA Genzyme Applied Genetics Biosystems Institute Centocor Centocor Amgen IDEXX Nova Immunex Chiron Genetics Institute Biogen Genentech Amgen Gilead Sciences Celgene Biogen Idec Genzyme Serono Shire Quest Diagnostics MedImmune The Cancer Stem Cell Hypothesis Red= CSC; less than 1% of tumor cells 90% will not develop tumors 90% will develop tumors 4

5 PC3 (Prostate Cancer) CD PC3 (Prostate Cancer) 5

6 IgG, Inmunoglobulina G N OPTIMIZACIÓN Quién sintetiza el gen? 6

7 Recodificación de codones Fragmento de la región constante de la cadena ligera En menos de 350 pb hay 7 vs 3 codones con < 15% de uso VERSIONES IRES 1 IRES 1 (L P) Versión 1: Bicistrónico fluorescente (L P + G) Versión 2: Tricistrónico (L P D) 7

8 Aumento en la eficiencia de transfección (Co transfeccion no requerida) José Manuel Aguilar Yáñez Sergio García Echauri Gonzalo Mendoza Ochoa Roberto Portillo Lara David Bulnes Abundis Ernesto José Aguirre Ezkauriatza Johari Salgado Mario Moisés Álvarez Vacuna InfA H1N1 Grupo M.M. Álvarez Escuela de Biotecnología y Salud 8

9 El virus Inf A H1N1 Introducción El virus Inf A H1N1 Introducción A. HA MP MP NA MP B. 9

10 Una nueva vacuna Concepto Inactivación Purificación El virus Inf A H1N1 HA NA NP M1 M2 NS1 NS2 PB1, PB2, PA 10

11 Una nueva vacuna Concepto NA HA CATCATCAT CATCATCAT NA HA Purificación VACUNA Una nueva vacuna Concepto HA de la Influenza A H1N1,

12 Retiene inmunogenicidad Vacuna sin virus Se expresa en cantidades superiores a 1 g/l Bajo costo de producción Corto tiempo de proceso (24 horas cada lote) No es intuitivo el diseño de la molécula y del proceso Producción controlada Proceso Fermentación I, reactores Infors 250 ml 37 KDa ctorha-h1n1 H1N1 26 KDa 25 KDa M = marcador de peso molecular BIO- RAD Precision Plus Kaleidoscope (Cat.No ) G41 A G41 B G41 C 41 C- T41 B T41C TRB TRC M 12

13 Producción controlada Proceso G41A G41B G41C T41 B T41 C TR B TR C WESTERN BLOT DEL GEL ANTERIOR Anticuerpo anti-6his peroxidado Proceso de bioreacción Reacción biológica (5 L) X (absorbance units) y = x R² = T41 C Ln T41C R² = L Bioreactor Linear (región exponencial) Time (h) 13

14 Producción controlada Proceso Fracción Fracción soluble insoluble Región no unida REACTOR 5 L 37 KDa ctorha H1N ctorha H1N1 Cuerpos de inclusión 25 KDa Marcador Producción controlada Proceso Gel electroforético 2D al 11%, ph Fracción insoluble de lisado celular. 14

15 Producción controlada Proceso de purificación Método de purificación desarrollado Proteína ctorha-h1n1 99.5% pura Marcador de peso molecular cuerpos de inclusión Lavados del Lisado celular Eluído de columna de afinidad retenido en resina Producción controlada Proceso de purificación 637 mg/l 63.7 mg/l Considerando reacción y purificación 100% pureza 15

16 Producción controlada Proceso de purificación 63.7 mg/l considerando reacción y purificación 4000 dosis/l 400,000 dosis/100 L Por día Planta piloto de producción Planta GMP Centro de Biotecnología 400,000 dosis/100 L/día 16

17 Proceso completo Reacción más purificación A B 1 Lisis celular C Solubilización de Cuerpos de inclusión D Cromatografía de afinidad E 3 Cultivo Microfiltración o centrifugación 2 4 IgG, Inmunoglobulina G N 17

18 18

19 Modelación tridimensional vista anterior 19

20 Modelación tridimensional, vista posterior Abs 450 nm Más concentración 3 repeticiones 1 0 Curva Estándar de IgG anti-tnfα y = 0.043x R² = [IgG ng/ml] Y Predicted Y Menos concentración Muestras 20

21 Técnica de ELISA Indirecta (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) Fundamento: formación de inmunocomplejos Ventajas: Alta sensibilidad Especificidad Reproducibilidad Masiva Bajo costo $$$ 3ra MTX (250 nm): 0.4 pg/cel*día 5ta MTX (1 um): 2 pg/cel*día 6ta MTX (2 um): 9 pg/cel*día DHFR: L P, P L GFP: L P, P L UCOE: L P, P L 21

22 Cuantificación de IgG anti TNFα, de un Biorreactor APLICON 1 L Muestras Curva Están ndar Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Técnica de ELISA Indirecta Abs 450 nm Curva Estándar de IgG anti-tnfα y = 0.043x R² = Y Predicted Y [IgG ng/ml] Producción de IgG anti TNFα (9 pg/ cel*día )(5x10 6 cel/ml)(7 días batch)= mg/ml En reactor 50L = g x batch GFP: L P, P L DHFR: L P, P L UCOE: L P, P L 22

23 INGENIERÍA DE BIOREACCIÓN CULTIVO DE CÉLULAS CHO EN REACTORES 6.00E CHO DG44 en Medio FreeStyle CHO E Densidad celular 4.00E E E Vivas Muertas Viabilidad Anticuerpo Total 1.00E E Días 23

24 INGENIERÍA DE BIOREACCIÓN ( Screening de condiciones ) 4 Reactores de Screening Independientes Completamente instrumentados Flujo de gases controlado: O 2, CO 2, N 2, aire Sistema DASGIP INGENIERÍA DE BIOREACCIÓN (Screening de condiciones) Sistema Infors 24

25 0 L eactor NB 50 Re Biotecnología en equipo: nuestra planta piloto 25

26 INGENIERÍA DE BIOSEPARACIONES Afinidad es la palabra High affinity low cost cromathography particles for purification of recombinant proteins 26

27 High affinity low cost cromathography particles for purification of recombinant proteins La Topografía de una partícula Fragmentos de anticuerpo en células de planta Células NT (tabaco) cultivadas en un reactor agitado (prueba de viabilidad) 27

28 José Manuel Aguilar Yáñez Leydi Maribel Carrillo Cocom Alfonso García Ullóa David Bulnes Abundis Felipe López 28