Herramientas básicas de análisis genético

Transcripción

1 J. Clària a, M. Sánchez b y R. Queralt c a Unidad de ADN. Centro de Diagnóstico Biomédico. Hospital Clínic. Institut d Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS). b Laboratorio de Genoma Humano. Facultad de Medicina. Universidad de Barcelona. c Servicio de Genética. Centro de Diagnóstico Biomédico. Hospital Clínic. Barcelona. El rápido desarrollo de la biología molecular en las dos últimas décadas ha representado una revolución en la metodología empleada en los laboratorios de análisis clínicos y de diagnóstico biomédico. La consecuencia inmediata de este progreso ha sido no sólo la reducción del número y volumen de muestras a analizar y la automatización de la mayoría de las técnicas, sino también el desarrollo de programas de prevención que han contribuido de forma significativa a mejorar la salud pública. El objetivo de este capítulo es describir de forma resumida las herramientas básicas más utilizadas en el diagnóstico molecular y definir el estado actual de su aplicación al análisis genético. AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS Para realizar cualquier análisis genético debemos previamente aislar el material genético del paciente, el cual está formado por cadenas de ácidos nucleicos. Existen dos tipos de ácidos nucleicos: el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN). El ADN se encuentra principalmente en el núcleo de las células, mientras que el ARN se encuentra en el citoplasma de las células. Así pues, debemos partir de un material celular, ya sea sangre total o muestra de tejido para aislar tanto ADN como ARN. Si partimos de tejidos sólidos, tanto para el aislamiento de ADN como de ARN, se debe fraccionar antes de la extracción del ácido nucleico. Aunque en este capítulo nos centraremos en metodologías basadas en el análisis de ADN, a continuación se describen las principales características del aislamiento de ADN y ARN. La extracción de ADN de las células se realiza mediante una incubación con el detergente dodecil sulfato de sodio (SDS) que solubiliza los lípidos de membrana y la proteinasa K que degrada enzimáticamente las proteínas. Posteriormente, se separa el ADN de las proteínas mediante precipitación salina o mediante extracción con fenol-cloroformo. Una vez aislada la fase nucleica se precipita con etanol absoluto y se eliminan las impurezas de sales con lavados de etanol al 70%. Finalmente, el ADN se resuspende en una solución acuosa 1. La extracción de ARN es más compleja que la del ADN debido a la alta estabilidad y actividad de las ribonucleasas, enzimas que degradan el ARN. Por tanto, es muy importante trabajar con materiales y productos libres de ribonucleasas. El primer paso para el aislamiento del ARN consiste en la lisis de las células en un medio químico que destruya las ribonucleasas, como el tiocianato de guanidinio. Posteriormente, el ARN es separado de las demás macromoléculas en un gradiente de cloruro de cesio, precipitado con isopropanol, lavado con etanol al 75% y resuspendido en una solución acuosa 2. AMPLIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS POR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue desarrollada a mediados de los años ochenta por Mullis 3,4. A este bioquímico el invento le valió el premio Nobel de Química en 1993, mientras que a la empresa que en esos momentos estaba trabajando (la compañía Cetus) le valió unos 300 millones de dólares al vender la patente a la compañía farmacéutica Hoffmann-La Roche. En tan sólo 20 años la PCR se ha convertido en una de las técnicas de laboratorio más utilizadas y una de las más citadas en la literatura científica. La PCR es una técnica relativamente sencilla por la cual una cadena de ADN es amplificada millones de veces de un modo rápido y preciso. La PCR es también una técnica altamente sensible que permite la amplificación de ADN a partir de cantidades mínimas de material (es posible amplificar una sola molécula de ADN). Estas características junto con su fácil aplicación y versatilidad, hacen que la PCR sea una técnica sumamente útil no sólo en investigación básica, sino también en aplicaciones de interés clínico, como el diagnóstico genético y la medicina forense. A grandes rasgos, la PCR es un método in vitro de síntesis de ADN por el cual cualquier fragmento de ADN puede ser replicado selectivamente. En la figura 1 se recoge un esquema resumido del proceso de la PCR. En general, la reacción de PCR consiste en la amplificación de un fragmento de ADN delimitado por dos oligonucleótidos cebadores (primers, fragmentos de ADN monocatenario de 15 a 25 bases) en repetidos ciclos de desnaturalización, hibridación (annealing) de los cebadores a la secuencia de ADN complementaria y extensión de la nueva cadena mediante la actividad de la enzima ADN polimerasa 5. Dado que cada miembro de la pareja de cebadores se hibrida específicamente a cada una de las dos cadenas complementarias de ADN, la síntesis de nuevas cadenas de ADN se restringe al fragmento de ADN delimitado por los dos cebadores. A continuación se describe con más detalle cada una de las etapas clave de la PCR. Desnaturalización Cuando se suministra calor a una cadena de ADN bicatenario, los puentes de hidrógeno que estabilizan la doble hélice se rompen y se separan las dos cadenas de ADN. Por esta razón, en la primera etapa de la PCR se aplica calor (94 C, 1 min) a la muestra para separar las dos cadenas complementarias de ADN (fig. 1). Hibridación Si la solución que contiene el ADN se deja enfriar (a temperaturas que suelen ir desde 40 a 60 C durante s) se logra la

2 Figura Ciclo 5 Cadena original Diagrama esquematizado del proceso de la PCR. El material de partida es un ADN de doble cadena. En primer lugar (ciclo 1), las cadenas se desnaturalizan y se hibridan los cebadores específicos, los cuales flanquean la región de ADN a amplificar (representada entre líneas discontinuas). A continuación la Taq polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN a partir del cebador específico. En el segundo ciclo (ciclo 2) se desnaturalizan las cadenas, se hibridan los cebadores específicos y se sintetizan nuevas hebras de ADN. A partir del ciclo 3 y en continuos ciclos de desnaturalización-hibridación-extensión se amplifica exponencialmente el fragmento de ADN de interés. En este esquema y a partir de los ciclos 1 y 2, no se representan las cadenas originales, las cuales se amplifican de forma no exponencial y, por tanto, no contribuyen de forma significativa en el producto final. hibridación de la pareja de cebadores específicos a las cadenas de ADN gracias a la complementariedad de sus bases a las regiones flanqueantes del ADN a amplificar (fig. 1). Cada uno de los cebadores se hibrida a una hebra distinta, de forma que ambos presentan su extremo 3 hacia el interior de la región a amplificar. Extensión Es la elongación de las cadenas de ADN mediante la actividad de la ADN polimerasa. En presencia de una ADN polimerasa termoestable (Taq polimerasa de Thermus aquaticus), de deoxinucleótidos trifosfato (dntp) en concentraciones saturantes, magnesio y Hibridar cebadores Extender nueva cadena Extender nueva cadena Extender nueva cadena Extender nuevas cadenas Extender nuevas cadenas 3 5 otros cofactores en un tampón apropiado y a 72 C (temperatura óptima de polimerización de la Taq) durante 1 min aproximadamente, las dos hebras de ADN son copiadas a partir de los cebadores específicos (fig. 1). Así, se obtienen dos productos mixtos con regiones de cadena doble y sencilla, que poseen en común un segmento de doble cadena, la región diana a amplificar. Si en un segundo ciclo se repite todo el proceso de desnaturalización-hibridación-extensión, se obtendrán cuatro moléculas de ADN de la región diana amplificada. A partir de aquí en cada ciclo se duplica el número de copias de la región diana. El resultado final es una acumulación exponencial del fragmento de ADN amplificado. Es decir, se obtienen aproximadamente 2 n copias, siendo n el número de ciclos de amplificación realizados. El termociclador es el aparato que de forma automática realiza esta secuencia de acontecimientos durante el número de ciclos deseado. Aunque la PCR, tal como apuntamos anteriormente, es una técnica rápida, sencilla y de fácil aplicación, también posee algunos inconvenientes. Entre los más importantes cabe citar la fidelidad de la Taq polimerasa que no siempre es del todo precisa (se ha estimado que incorpora de 1 a 2 errores por cada bases) y la fácil contaminación de los reactivos (p. ej. mediante la formación de aerosoles en las puntas de las pipetas dispensadoras). CLONACIÓN MOLECULAR La clonación molecular consta básicamente de dos procesos: la creación de una construcción o construct y la introducción de dicha construcción dentro de una célula eucariota o procariota. Una construcción se compone de un vehículo, denominado vector, donde insertaremos un fragmento de ADN obtenido normalmente mediante PCR. Seguidamente, se introduce esta construcción en una célula para generar múltiples copias idénticas. Un vector es una construcción artificial de ADN que contiene los elementos necesarios para replicarse en el interior de la célula, como un ente independiente del genoma celular, cuando ésta se divida. Un vector consta de un origen de replicación que permite la multiplicación dentro de la célula, un sitio de clonación, o multicloning site, que es la zona donde se inserta el fragmento de interés y de un gen de resistencia a un antibiótico (ampicilina, kanamicina, tetraciclina, etc.) que nos permitirá se-

3 ADN ADN Figura pb TTGA AACT TCGA AGCT 420 pb 280 pb Enzima de restricción Enzimas de restricción y electroforesis en gel de agarosa. La figura representa un fragmento de PCR de 420 pb que contiene la diana de restricción TCGA, que es cortado en 2 fragmentos de 140 y 280 pb por una enzima de restricción (simbolizado por unas tijeras). Si no existe la diana de restricción, la enzima no podrá actuar y obtendremos un único fragmento de 420 pb. Los fragmentos de ADN se visualizan en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. El tamaño de los fragmentos se estima mediante la extrapolación de la distancia recorrida en el gel por fragmentos de ADN de tamaño conocido (estándar). leccionar positivamente aquellas células que han incorporado el vector. Para realizar una construcción circular debemos tener el vector linearizado, es decir, cortado o digerido con una enzima de restricción que presente una diana única en el sitio de clonación del vector. Posteriormente, se inserta el fragmento de interés entre los dos extremos del vector, proceso que se denomina ligamiento. De esta forma, una vez incorporado el fragmento de interés al vector, volvemos a tener una construcción circular. De forma muy resumida, la reacción de ligamiento incluye el vector linearizado, el fragmento a clonar, la ligasa o enzima que los unirá y el tampón de la ligasa que aporta los iones necesarios para que la enzima funcione. Una vez insertado el fragmento de interés en el vector, se introduce toda la construcción en el interior de una célula eucariota o procariota, proceso que se denomina transformación. Normalmente, se utilizan células procariotas, como la bacteria Escherichia coli, debido a que crecen con más rapidez y con menos requerimientos nutricionales que las células eucariotas. Existen diferentes métodos de transformación, siendo los más utilizados la electroporación, el choque térmico y la transfección mediada por virus o por liposomas. En la electroporación sometemos a las células a una descarga eléctrica, mientras que en el choque térmico las sometemos a un cambio de temperatura. Ambos procedimientos generan poros en las membranas de las células permitiendo que la construcción se introduzca en el interior de ellas. En la transfección utilizamos virus para infectar o liposomas para fusionar las células e introducir nuestra construcción. Una vez transformada, la propia maquinaria celular se encargará de realizar múltiples copias de la construcción. Para recuperar estas copias será necesario lisar las células y purificar nuestra construcción. Las miles de copias de nuestro fragmento de interés se utilizarán para otras aplicaciones como, por ejemplo, sondas para Southern o Northern blot, para realizar estudios de transcripción y/o traducción in vitro, etc. Digerido No digerido Estándar Gel de agarosa Electroforesis Origen 506 pb 396 pb 298 pb 154 pb 134 pb ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Y ELECTROFORESIS En 1970 Smith et al descubrieron que algunas enzimas de ciertos microorganismos cortaban el ADN en determinados puntos de su secuencia 6. Estas enzimas son las endonucleasas de restricción o enzimas de restricción y se denominan según las iniciales del microorganismo del que proviene, seguido de la variedad de la especie y de un número romano si existe más de una enzima aislada de un mismo tipo de bacteria (p. ej., Hind III proviene de Haemophilus influenzae variedad Rd y es la tercera enzima que se aisló). El lugar que reconoce y corta una determinada enzima de restricción se denomina diana de restricción. Algunas de estas dianas presentan la característica de ser palindrómicas, es decir, que leyendo la secuencia nucleotídica en sentido 5-3 obtenemos lo mismo que en sentido 3-5 (fig. 2, TCGA). El proceso de cortar el ADN con una enzima de restricción se denomina digestión. Para realizar una digestión de un fragmento de ADN normalmente basta añadir la enzima de restricción y un tampón adecuado e incubar la mezcla a la temperatura requerida por la enzima. Finalmente, se analiza la muestra cargándola en una matriz o gel de agarosa o poliacrilamida y sometiéndola a un campo eléctrico (electroforesis) (fig. 2). De forma breve, la electroforesis consiste en aplicar sobre el gel de agarosa o poliacrilamida un campo eléctrico donde el polo positivo se sitúa en el extremo contrario al sitio de carga de la muestra; de este modo, la muestra, que es ADN y posee carga negativa, se desplaza por el interior del gel en dirección al polo positivo (fig. 2). Es necesario añadir a las muestras un colorante que nos permita visualizar su localización aproximada. Las moléculas de ADN se visualizan por tinción con bromuro de etidio, compuesto que se intercala entre las bases del ADN y emite fluorescencia cuando es estimulado con radiación ultravioleta. Para tener una referencia del tamaño de los productos de digestión, en uno de los carriles del gel se carga un estándar o marcador, que consiste en un conjunto de fragmentos de ADN de longitud (en pares de bases, [pb]) conocida (fig. 2). SECUENCIACIÓN DE ADN Las técnicas de secuenciación de ADN se desarrollaron a finales de los años setenta y revolucionaron de forma significativa el mundo de la genética molecular. Originalmente, se describieron dos métodos de secuenciación de ADN: el método de Maxam y Gilbert 7 y el método de Sanger et al 8. Mientras que el método de Maxam y Gilbert está basado en la degradación química de la cadena original de ADN, el método de Sanger et al se basa en la síntesis de una nueva cadena de ADN mediante la actividad enzimática de una ADN polimerasa. Aunque ambos métodos producen poblaciones de fragmentos marcados (originalmente con radioactividad) de distinta longitud, los cuales son separados por electroforesis en un gel de poliacrilamida, en la práctica el método enzimático de Sanger et al es el más popular y el más utilizado para secuenciar ADN de forma rutinaria. En los últimos años, el método original de Sanger et al se ha modificado y mejorado sustancialmente, sien-

4 Figura 3 ADN polimerasa dntp Terminadores (ddntp) PCR Electroferograma ADN a secuenciar Gel de poliacrilamida Secuenciación de ADN. La reacción de secuenciación consta de la muestra de ADN a secuenciar, un cebador (sense o antisense), una ADN polimerasa, deoxinucleótidos (dntp) y terminadores dideoxinucleótidos (ddntp), acoplado cada uno de ellos a un fluorocromo característico. Durante el proceso de la PCR, estos terminadores se incorporan a la nueva cadena de ADN, generando fragmentos de tamaño variable. Estos fragmentos se separan en un gel de poliacrilamida y la señal emitida por cada uno de ellos da lugar a un pico característico del electroferograma. do los cambios más importantes la sustitución de la radioactividad por marcadores fluorescentes y la aplicación de la PCR. A continuación se describen a grandes rasgos las principales características del método de Sanger et al. Método de Sanger et al El método enzimático de Sanger et al está basado en la incorporación de terminadores dideoxinucleótidos (ddntp) a una nueva cadena de ADN mediante la actividad de una ADN polimerasa. Aunque los ddntp se incorporan a la nueva cadena de la misma forma que se incorporan los deoxinucleótidos convencionales (dntp), difieren de éstos porque carecen del grupo 3 -OH necesario para la elongación de la cadena. Por esta razón, cuando se incorpora un ddntp a la nueva cadena creciente de ADN, la ausencia del grupo hidroxilo evita la formación del puente fosfodiéster con el siguiente dntp y la elongación de la cadena se termina en ese punto. En la práctica, cada uno de los cuatro ddntp se combina con una mezcla de los cuatro dntp convencionales en presencia de la ADN polimerasa y de un cebador (primer) específico. En el método original, cada uno de los cuatro ddntp se empleaban en cuatro reacciones distintas en presencia de un dntp marcado radiactivamente, de forma que se obtenían poblaciones de ADN de distinta longitud de nucleótidos. Los fragmentos radiactivos obtenidos se separaban en un gel de poliacrilamida y la secuencia de ADN completa se determinaba mediante autorradiografía. Como ya se ha comentado anteriormente, el método enzimático de Sanger et al es el método de secuenciación más utilizado en la actualidad, pero con importantes modificaciones. En este sentido, la incorporación de la PCR ha dado lugar a lo que se denomina secuenciación cíclica. En la secuenciación cíclica y al igual que en el método original de Sanger et al, se copia la cadena original de ADN a partir del cebador hasta el lugar de incorporación del ddntp por la ADN polimerasa. La diferencia radica en que en la secuenciación cíclica, esta reacción tiene lugar de veces en un termociclador, lo cual resulta en la generación de múltiples copias de los fragmentos, lo que amplifica enormemente la señal y facilita su detección. Otras modificaciones importantes del método original de secuenciación son la sustitución de la radiactividad por fluorocromos y la automatización de su detección y análisis mediante secuenciadores automáticos de ADN. Así, en el método actual la fluorescencia suele estar asociada a los terminadores ddntp (cada terminador esta asociado a un fluorocromo distinto), los cuales se incorporan a la nueva cadena de ADN mediante la amplificación cíclica usando la actividad de la Taq polimerasa (fig. 3). Los nuevos fragmentos de ADN se separan en un gel de poliacrilamida y la señal emitida por cada uno de los fluorocromos al ser excitados por un láser es captada por unos detectores y analizada mediante soporte informático (fig. 3). Las principales ventajas de la secuenciación automática son la gran flexibilidad en la utilización de cualquier cebador (normalmente es uno de los dos usados para amplificar el ADN por PCR) y que los errores de lectura causados por falsas paradas de la ADN polimerasa no se detectan, ya que no incorporan fluorescencia. Además, y puesto que cada terminador lleva asociado un distinto fluorocromo, el número de tubos a manejar se divide por cuatro mientras que el número de muestras a secuenciar en un mismo gel se multiplica por cuatro. SSCP Y RFLP El análisis de SSCP (single strand conformation polymorphism) es una de las técnicas mas empleadas para la detección de mutaciones del ADN. Es la técnica de elección cuando se conoce el gen responsable de una enfermedad pero se desconoce la situación de la mutación y hay que analizar un gran número de muestras. La técnica se basa que en condiciones no desnaturalizantes, el ADN de cadena sencilla adopta una conformación dependiente de su secuencia. La región de ADN a analizar se amplifica por PCR, la doble cadena generada se desnaturaliza por calor y, seguidamente, se analizan las cadenas sencillas por electroforesis en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante. Si el fragmento de ADN amplificado es portador de una mutación, la movilidad de las cadenas sencillas diferirá respecto a la de un control normal, generando un patrón anómalo de migración. Las condiciones de electroforesis permiten discriminar entre dos moléculas que difieran en un solo nucleótido 9. Los productos de PCR deben oscilar entre 200 y 400 pb. La confirmación del cambio de nucleótido y su situación se determinará posteriormente mediante secuenciación. El análisis de RFLP (restriction fragment length polymorphism) es la metodología empleada para el análisis de polimorfismos de longitud del ADN de los fragmentos de restricción. El ADN genómico a analizar se corta con las enzimas de restricción de interés y a continuación el ADN cortado se separa mediante electroforesis en un gel de agarosa. El gel se incuba en una solución desnaturalizante para obtener las dobles hebras desnaturalizadas y los fragmentos separados se transfieren a una membrana mediante la técnica conocida como Southern Blot 10. La membrana se hibrida con una sonda específica (fragmento de ADN marcado) dando lugar a distintos fragmentos a analizar. Esta

5 CTGCACTTTGACAGGGATA GACGTGAAACTGTCCCTAT B M H 1 H 2 P A CACACACACACACACACA GTGTGTGTGTGTGTGTGT Core TACGTAGCCGTATACCGG ATGCATCGGCATATGGCC C M H 1 H 2 P CACACGTGCAC PCR (cebadores fluorescentes ) CACACGTGCAC D M H 1 H 2 P S E T M: madre P: padre H 1, H 2 : hijos S: sangre T: tumor Figura 4 Microsatélites. A) Secuencia de un microsatélite. La repetición (CA) n se halla dentro del rectángulo. B) Patrón electroforético de una herencia normal biparental. H 1 : heterozigoto; H 2 : homozigoto. B) Patrón electroforético de un desequilibrio cromosómico. H 1 : trisomía (dos alelos maternos y un alelo paterno); H 2 : monosomía (un alelo paterno y pérdida del alelo materno). D) H 1 : herencia uniparental materna; H 2 : herencia uniparental paterna; E: pérdida de heterozigosidad (pérdida de un alelo). técnica se ha utilizado para el análisis del ADN polimórfico (ADN repetido). Con la introducción de la PCR el análisis de RFLP por Southern Blot se ha sustituido por el análisis de microsatélites. ANÁLISIS DE MICROSATÉLITES Figura 5 GTGTGCACGTG CACACGTGCAC GTGTGTACGTG C T G A Chips de ADN. En este esquema se representa un chip de ADN utilizado para estudiar la existencia de mutaciones puntuales en un gen. Un chip de ADN es una matriz sólida donde se hallan inmovilizados miles de fragmentos de ADN diferentes (normalmente oligonucleótidos). La región del gen a analizar se amplifica por PCR en presencia de cebadores acoplados a un fluorocromo, y el fragmento obtenido se hibrida a la matriz conteniendo la secuencia de ADN complementaria inmovilizada. Según en qué posición de la matriz se detecte la fluorescencia podremos discernir qué nucleótido ocupa esa posición en nuestra muestra de ADN. El análisis de microsatélites, o STR (short tandem repeats), consiste en la amplificación por PCR de una región de ADN genómico no codificante que contiene una secuencia polimórfica (core) repetida n veces 11 (fig. 4A). En función del número de nucleótidos repetidos distinguimos los microsatélites del tipo dinucleótido (CA) n, trinucleótido (TGA) n, tetranucleótido (TAGA) n y pentanucleótido (TAGAG) n. Para un microsatélite determinado, el número de repeticiones (n) es variable entre individuos y, por tanto, el tamaño del fragmento amplificado será distinto. Con la posterior separación electroforética en un gel de poliacrilamida desnaturalizante se obtendrá un patrón de bandas alélico, polimórfico y propio de cada individuo. Para la elección de un microsatélite se debe tener en cuenta una serie de condiciones: una alta heterozigosidad (porcentaje de individuos con dos alelos de distinto tamaño), un elevado número de alelos, una secuencia polimórfica regular, unos alelos fácilmente distinguibles y una buena amplificación por PCR. Para un determinado microsatélite y un determinado locus se produce la amplificación de dos alelos, uno de cada progenitor. Estos alelos pueden ser de distinto tamaño (heterozigoto) (fig. 4B [H 1 ]), o bien del mismo tamaño (homozigoto), en este caso se visualiza una sola banda de doble intensidad (fig. 4B [H 2 ]). Las utilidades del análisis de microsatélites son bien conocidas para la identificación de individuos en genética forense. En genética clínica se utiliza para el diagnóstico de duplicaciones cromosómicas, como el síndrome de Down, que estudia el origen parental y meiótico de la no disyunción del cromosoma 21 (fig. 4C [H 1 ]) 12. También se utiliza en el análisis de microdeleciones cromosómicas, como el síndrome de Williams (microdeleción de la región 7q11.23) 13 y el síndrome velo-cardio-facial (microdeleción de la región 22q11.2) 14, donde se estudian los locus delecionados y el origen parental de la deleción (fig. 4C [H 2 ]). El análisis de disomía uniparental estudia la herencia de un determinado par de cromosomas de un solo progenitor, sin contribución del otro progenitor, dando lugar a distintos síndromes como el de Angelman y el de Prader Willi debido a una duplicación paterna y materna, respectivamente, del cromosoma 15 (fig. 4D [H 2, H 1 ]) 15,16. El análisis de ligamiento de una familia estudia la cosegregación de determinados alelos con el fenotipo de una enfermedad y, por último, el análisis de pérdida de heterozigosidad (LOH: Loss of heterozygosity), estudia en un mismo individuo y para un locus determinado la pérdida de un alelo en un tejido tumoral respecto a la presencia bialélica en otro tejido no tumoral (fig. 4E). CHIPS DE ADN Y OTRAS TECNOLOGÍAS DE FUTURO Una de las constantes de los métodos de biología molecular es la tendencia a disminuir el volumen de reacción y de miniatu- GTGTGGACGTG GTGTGAACGTG

6 rizar todos los procesos, de forma que sea posible analizar el máximo número de muestras en el mínimo espacio y volumen. Éste es el concepto básico de la tecnología de microarrays y chips de ADN: analizar miles de genes y variantes genéticas de forma rápida y en un volumen de reacción del orden de nanolitros. Un array es una matriz donde se ordenan un gran número de muestras. Un microarray es una matriz que contiene miles de muestras ordenadas cada una de ellas en puntos de 200 µm de diámetro. A grandes rasgos, existen dos tipos de microarrays. En primer lugar, los microarrays propiamente dichos donde diversos fragmentos de ADN (normalmente cadn) se hallan inmovilizados en una superficie sólida, como por ejemplo en un portaobjetos de vidrio o una membrana de nailon. Por otra parte, existen los denominados DNA chip microarrays, donde el ADN en forma de oligonucleótidos se halla inmovilizado en una placa de silicona de forma similar a los chips de informática o microprocesadores. En ambos casos el procedimiento analítico es el mismo: el ADN aislado de la muestra a analizar se marca con fluorescencia y se hibrida (a temperatura y condiciones ya establecidas) a la matriz conteniendo el ADN complementario inmovilizado (fig. 5). Las dos principales aplicaciones de los microarrays y chips de ADN son la detección de las mutaciones/polimorfismos más habituales de una enfermedad y el análisis de las diferencias en el grado de expresión de un determinado gen. En el primer supuesto, el material de partida será ADN genómico, mientras que en el segundo caso el material a analizar es el carn obtenido a partir del cadn sintetizado por retrotranscripción del ARNm original de la muestra. La aplicación de la tecnología de microarrays y chips de ADN al análisis del genoma humano se denomina de forma genérica como genómica. De forma similar, la aplicación de esta tecnología al estudio de la expresión proteica recibe el nombre genérico de proteómica. Bibliografía 1. Strauss WM. Preparation of genomic DNA from mammalian tissue. En: Ausubel FA, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA et al, editores. Current protocols in molecular biology. Nueva York: John Wiley & Sons, 1994; TEMA MONOGRÁFICO 2. Kingston RE, Chomczynski P, Sacchi N. Guanidine methods for total RNA preparation. En: Ausubel FA, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA et al, editores. Current protocols in molecular biology. Nueva York: John Wiley & Sons, 1994; Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 1986; 51: Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerasecatalyzed chain reaction. Methods Enzymol 1987; 155: Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ, editores. PCR Protocols. A guide to methods and applications. San Diego: Academic Press, Kelly TJ, Smith HO. A restriction enzyme Haemophilus influenza (II). Base composition of the recognition sequence. J Mol Biol 1970; 51: Maxam AM, Gilbert W. A new method for sequencing DNA. Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74: Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 1977; 74: Orita M, Suzuki Y, Sekiya T, Hayashi K. Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction. Genomics 1989; 5: Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by electrophoresis. J Mol Evol 1975; 98: Weber JL, May PE. Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction. Am J Hum Genet 1989; 44: Antonorakis SE, Petersen MB, McInnis MG, Adelsberger PA, Schinzel AA, Binkert F et al. The meiotic stage of non-disjunction in trisomy 21: determination by using DNA polymorphisms. Am J Hum Genet 1992; 50: Ewart AK, Morris CA, Atkinson D, Jin W, Sternes K, Spallone P et al. Hemizygosity at the elastin locus in a development disorder, Williams syndrome. Nature Genet 1993; 59: Morrow B, Goldberg R, Carlson C, Das Gupta R, Sirotkin H, Collins J et al. Molecular definition of the 22q11 deletions in velo-cardio-facial syndrome. Am J Hum Genet 1995; 56: Malcolm S, Clayton-Smith J, Nichols M, Robb S, Webb T, Armour JA et al. Uniparental paternal disomy in Angelman s syndrome. Lancet 1991; 337: Robinson WP, Bottani A, Xie YG, Balakrishman J, Binkert F, Machler M et al. Molecular, cytogenetic and clinical investigations of Prader-Willi syndrom patients. Am J Hum Genet 1991; 49: