Universidad Nacional Autónoma de Nicaragua. UNAN-León. Facultad de Ciencias y Tecnología. Departamento de Biología Edgar Munguía Álvarez

Transcripción

1 Universidd Nionl Autónom de Nirgu UNAN-León Fultd de Cienis y Tenologí Deprtmento de Biologí Edgr Munguí Álvrez Evluión de l onentrión de proteín y metolitos lires (gluos y minoáidos) en el río Estero Rel y su relión on los prámetros físios y químios. Período Myo-Oture 213. Requisito previo pr optr l título de Lienido en Biologí Autores: Ktherinne del Rosrio Osorio Urteho, Br. Mriel del Soorro Prdo Olivres, Br. Tutor: Ariel José Aguilr, Ph. D. León de Nirgu Mrzo, 213

2 CERTIFICACIÓN ARIEL JOSÉ AGUILAR, Profesor Titulr en el Deprtmento de Biologí, Fultd de Cieni y Tenologí de l Universidd Nionl Autónom de Nirgu- León, (UNAN-León). CERTIFICA: Que l presente memori tituld Evluión de l onentrión de proteín y metolitos lires (gluos y minoáidos) en el río Estero Rel y su relión on los prámetros físios y químios presentd por ls Brs. Ktherinne del Rosrio Osorio Urteho y Mriel del Soorro Prdo Olivres pr optr l grdo de Lienid en Biologí por l Universidd Nionl Autónom de Nirgu-León, h sido relizd jo mi direión y que hllándose onluid utorizo su presentión pr que pued ser juzgd por el triunl orrespondiente. Y pr que sí onste y surt los efetos oportunos, firmo el presente en León, 13 de mrzo de 214. Dr. Ariel José Aguilr II

3 DEDICATORIA Le dedio este trjo investigtivo : Mis pdres Alin Osorio y Ydir Urteho de Osorio por su poyo inondiionl y todo el srifiio en pro de mi desrrollo profesionl, espiritul y morl preprándome pr el futuro. A mis uelos Crlos Osorio, Rosrio Zpt, Reyn Condeg y Hermógenes Urteho por sus oriones y todo su poyo. A mi hermnito Alin Osorio Urteho esperndo sig mis psos. A mis fmilires y migos! Br. Ktherinne del Rosrio Osorio Urteho Le dedio este trjo investigtivo : Mis pdres Leonrdo Orlndo Prdo y Frnis Olivres Rodríguez por su poyo inondiionl, por su mor y todo el esfuerzo que me rindn dí dí pr preprrme pr mi futuro profesionl. Mi hermn Tni Prdo Olivres por rindrme su mistd y riño pr slir delnte. Al señor Rymond Flores y su espos Mgly Sánhez Flores, l señorit Mrth Sánhez Srvi y l señor Nidi Sánhez Prio por tods ls muestrs de riño que me rindron pr poder superr todos los ostáulos y slir delnte. A mis fmilires y migos! Br. Mriel del Soorro Prdo Olivres III

4 FINANCIACIÓN L presente Tesis de grdo h sido relizd en el Lortorio de Fisiologí Animl, Deprtmento de Biologí, Fultd de Cieni y Tenologí de l Universidd Nionl Autónom de Nirgu, jo l direión del Dotor Ariel José Aguilr. L investigión desrrolld en est Tesis, h sido suveniond por el PRESANCA II-CSUCA trvés del proyeto Relión entre l regulión de l ingest de limento en Tilpis (Oreohromis nilotius) por ftores metólios y neuroendorinos y el estrés produido por ftores mientles (ódigo: C5) rgo del Dr. Ariel José Aguilr. El reorrido sore ls gus del río Estero Rel fue poydo por los gerentes de grnjs D. Bruno Amru (Lngostinos de Centroméri) y D. Máximo Hernández (Grupo PESCANOVA). IV

5 AGRADECIMIENTOS Primermente dmos gris Dios por drnos liento de vid d dí y poder llegr ulminr est etp de nuestrs vids. Y por otr prte enumerr y grdeerle tods quells persons que nos hn yuddo finlizr este trjo serí un lor poo menos interminle. Es por ello que nos limitremos menionr quells persons uy ontriuión h sido más signifitiv. Dmos muhs gris nuestro tutor el Dr. Ariel José Aguilr por hernos ddo l oportunidd de trjr nuestr tesis omo prte del trjo llevdo o en el Lortorio de Fisiologí Animl por su yud prestd y tenión en todo momento, por sus plrs de ánimo, su optimismo, por trsmitirnos sus onoimientos y onsejos tnto pr l vid lorl omo enseñnz pr l vid diri y en fin gris por formr prte de est etp de formión y ulminrl on muho éxito. Tmién le grdeemos l Sr. Máximo Hernández Jefe de Produión de CAMANICA, S.A por permitirnos prtiipr de un pitión y rindrnos lojmiento en ls instliones de l grnj mroner II Agus, gris todo el personl por hernos tendido muy ien y trsmitirnos sus onoimientos. Por otr prte tmién grdeemos l Universidd Centromerin (UCA) por todo su poyo y onoimiento rinddo proveniente de los responsles de l Estión Biológi de Puerto Morzán y en espeil l Ing. Eufrei Vlldres por su poyo en nuestro primer muestreo. De igul mner grdeemos l Señor Wendel Grí Diretor Ténio APEMAC y l Li. Lidi Romero Ténio de lortorio, por hernos omprtido sus onoimientos en l pitión referente nuestro trjo investigtivo. Tmién queremos grdeerle de mner espeil l Lortorio de Miroiologí UNAN-León por el poyo inondiionl rinddo pr l relizión y ulminión de est investigión. Gris tmién nuestros ompñeros y mestros, que nos poyron y nos permitieron entrr en su vid durnte estos si ino ños de onvivir dentro y fuer del slón de lse. Y por último pero no menos importnte nuestros pdres, hermnos, fmilires y migos que nos ompñron en este proeso de form inondiionl, omprendiéndonos, poyándonos, lentándonos seguir delnte en los uenos y mlos momentos. A todos muhísims Gris! V

6 ÍNDICE Pág. DEDICATORIA.. II CERTIFICADO III FINANCIACION IV AGRADECIMIENTOS V ÍNDICE VI LISTA DE ABREVIATURAS.. VIII LISTA DE TABLAS. X LISTA DE FIGURAS XI RESUMEN. XII 1. INTRODUCCIÓN OBJETIVOS LITERATURA REVISADA Sistems esturinos Clsifiión Esturin Desripión de l zon de estudio Clim Hidrologí Importni del Estero Rel Prámetros fisioquímios Slinidd Tempertur ph Oxígeno disuelto Turidez Metolitos y Proteíns Aminoáidos Clsifiión Reión de Ninhidrin Proteíns Clsifiión Estrutur Determinión de proteíns Método del Áido Biinonínio (BCA) Gluos Determinión de gluos Eosistem uátio Priniples miroorgnismos desomponedores Bteris Atinomietos Hongos Mirolgs Menismo de degrdión de l mteri orgáni Degrdión de elulos Degrdión de xilno Degrdión de quitin Degrdión de lignin Eutrofizión Efetos del proeso de eutrofizión Cuss del proeso de l eutrofizión Priniples modifiiones del inremento de nutrientes en el 3 VI

7 miente fisioquímio del gu y del sedimento.. 4. MATERIALES Y METODOS Áre de estudio Metodologí experimentl pr l tom de muestrs Determiniones nlítis Cuntifiión de niveles de metolitos lires en el uerpo de 36 gu Gluos Aminoáidos Cuntifiión de proteíns lires en el uerpo de 38 gu Cuntifiión de niveles de proteíns, gluos y minoáidos lires 39 en sedimento. 4.4 Análisis estdístios RESULTADOS Prámetros físios y químios Turidez Oxígeno disuelto Slinidd Proteíns y Metolitos Proteíns y metolitos lires en el uerpo de gu Proteíns Aminoáidos Gluos Proteíns y metolitos lires en el sedimento Proteíns Aminoáidos Gluos Relión de l onentrión de metolitos (gluos y minoáidos) 67 y proteíns on los prámetros (slinidd y tempertur) Análisis en el uerpo de gu Relión de l onentrión de proteín lire on l 67 onentrión slin y tempertur Relión de l onentrión de minoáidos lires on l 68 onentrión slin y tempertur Relión de l onentrión de gluos lire on l onentrión 69 slin y tempertur Análisis en sedimento Relión de l onentrión de proteín on l onentrión 7 slin Relión de l onentrión de minoáidos lires on l 71 onentrión slin Relión de l onentrión de gluos on l onentrión 72 slin. 6. DISCUSIÓN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 88 VII

8 ABREVIATURAS APHA: Amerin Puli Helth Assoition : Aminoáidos ANOVA: Análisis de Vrinz AGO: Agosto BAL: Bteris Aido Látis BCA: Aido Biinonínio CSIG: Centro de Sistem de Informión Geográfi. CIDEA: Centro de Investigión de Eosistems Auátios CRM: Cuent Reto del Milenio C: Citosin m: Centímetros m 3 : Centímetros úios C: Grdos Celsius 3D: Form Tridimensionl G: Gunin JUN: Junio JUL: Julio Km: Kilómetros Lip: Lignin Peroxids Mnp: Mgneso Peroxids ml: mililitro mg/l: miligrmo/ Litro M: Molridd min.: minutos mm: milimolr VIII

9 My: Myo nm: nnómetros N: Normlidd OH: Grupo Hidroxilo OCT: Oture ph: Medid de idez o llinidd de un disoluión (P): Puntos de Muestreo PCA: áido perlório R: Cden Lterl rpm: revoluiones por minuto SEP: Septiemre UV: Ryos Ultrviolet MARENA: Ministerio del Amiente y los Reursos Nturles PRADEPESCA: Progrm Regionl de Apoyo l Desrrollo de l Pes en el Istmo Centromerino RAMSAR: Convenión Internionl Sore los Humedles IX

10 LISTA DE TABLAS Pág. Tl 1. Vlores promedio de onentrión slin en el rio Estero Rel. Periodo Tl 2. Vlores promedio de tempertur registrdos en el río Estero Rel. Periodo Tl 3. Vlores promedio de oxígeno disuelto registrdos en el río Estero Rel. Periodo 2-24 Tl 4. Priniples métodos pr l untifiión de proteíns sus rngos de sensiilidd y sus ventjs y desventjs Tl 5. Miroorgnismos elulítios 26 Tl 6. Coordends de puntos de muestreos en el río Estero Rel, Nirgu. Tl 7. Vlores promedios de ph, Oxígeno Disuelto (O 2 mg/l), Tempertur ( o C), Turidez (m). Tl 8. Vlores de Turidez (m) en d punto de muestreo, en los meses de Agosto, Septiemre y Oture Tl 9. Vlores de Oxígeno disuelto por puntos de muestreo en el tiempo.. 44 X

11 LISTA DE FIGURAS Pág Figur 1 Mp de uiión de los puntos de muestreo relizdos en el río Estero 7 Rel... Figur 2 Fórmul Generl de minoáidos.. 12 Figur 3 Aminoáidos Proteios.. 13 Figur 4 Reión de Ninhidrin on los minoáidos Figur 5 Prinipio de l Reión Figur 6 Prinipio de l Reión en l Gluos.. 19 Figur 7 Iniiión del proeso de humifiión.. 24 Figur 8 Esquem de ls uss de l Eutrofizión Figur 9 Efeto de l eutrofizión en los uerpos de gu Figur 1 Mp de puntos de muestreo Figur 11 Tom de muestrs de gu y sedimento.. 35 Figur 12 Proesmiento de muestrs previo l nálisis de Gluos y Aminoáidos. 36 Figur 13 Psos pr el nálisis de Gluos.. 37 Figur 14 Psos pr el nálisis de minoáidos Figur 15 Psos pr el nálisis de proteín.. 38 Figur 16 Psos pr el nálisis de Proteín, Gluos y Aminoáidos en muestrs de 39 sedimento.. Figur Vlores promedios de Diso de Sehi en el tiempo. Figur 18 Conentriones promedios de oxígeno disuelto (mg/l), en el tiempo.. 45 Figur 19Conentriones slins (ppm) en el tiempo Figur 2 Vlores promedios de onentriones slins (ppm), por punto de muestreo.. 47 Figur 21 Promedio de onentriones slins (ppm) en el tiempo. 48 Figur 22 Conentriones promedio de proteíns (µg/ml) en gu, por mes de muestreo. 49 Figur 23Conentrión promedio de proteíns (µg/ml) en gu, por punto de muestreo.. 5 Figur 24 Conentriones promedio de proteíns (µg/ml) en gu, en el tiempo. 51 Figur 25 Conentriones promedio de minoáidos (µm) en gu, en d mes de 52 muestreo..... Figur 26 Promedio de onentrión de minoáidos (µm)en gu, por punto de 53 muestreo. Figur 27 Conentriones promedio de minoáidos (µm) en gu, en el tiempo.. 54 Figur 28 Conentriones promedio de gluos (µm) en gu, en d mes de muestreo.. 55 Figur 29 Promedio de l onentrión de gluos (µm) en gu, por punto de muestreo.. 56 Figur3 Conentriones promedio de gluos (µm) en gu, en el tiempo. 57 Figur 31 Conentriones promedio de proteíns (µg/gr) en sedimento, por mes de 58 muestreo.. Figur 32 Conentriones promedio de proteíns (µg/gr) en sedimento, por punto de 59 muestreo.. Figur 33 Conentriones promedio de proteíns (µg/gr) en sedimento, en el 6 tiempo... Figur 34 Conentriones promedio de minoáidos (µm) en sedimento, en d mes de 61 muestreo. Figur 35 Conentriones promedio de minoáidos (µm) en sedimento, por punto de 62 muestreo.. Figur 36 Conentriones promedio de minoáidos (µm) en sedimento, en el 63 tiempo.. Figur 37 Conentriones promedio de gluos (µm) en sedimento, en d mes de 64 muestreo.. Figur 38 Promedio de l onentrión de gluos (µm) en sedimento, por punto de 65 muestreo.. Figur 39 Conentriones promedio de gluos (µm) en sedimento, en el 66 tiempo.. Figur 4 Relión entre el promedio de l onentrión slin(ppm) y el promedio de l 67 onentrión de proteíns (µg/gr) y l relión entre el promedio del vlor de XI

12 tempertur C y el promedio de l onentrión de proteín (µg/ml) en el uerpo de gu Figur 41 Relión entre el promedio de l onentrión slin (ppm)y el promedio de l onentrión de minoáidos (µm),y l relión entre el promedio del vlor de tempertur C y el promedio de l onentrión de minoáidos (µm), en el uerpo de gu. Figur 42 Figur 42 Relión entre el promedio de l onentrión slin (ppm) y el promedio de l onentrión de gluos (µm), y l relión entre el promedio del vlor de tempertur C y el promedio de l onentrión de gluos (µm), en el uerpo de gu Figur 43 Relión entre el promedio de l onentrión slin (ppm) y el promedio de l onentrión de proteíns (µg/gr), en el sedimento. Figur 44 Relión entre el promedio de l onentrión slin (ppm) y el promedio de l onentrión de minoáidos (µm), en el sedimento. Figur 45 Relión entre el promedio de l onentrión slin (ppm) y el promedio de l onentrión de gluos (µm), en el sedimento XII

13 RESUMEN El ojetivo de l presente investigión onsistió en evlur, por primer vez, l slud del uerpo de gu del río Estero Rel medinte l vriión de los prámetros fisioquímios y su reflejo en l dinámi del metolismo intermedio de los priniples ompuestos orgánios. Por tnto, evlumos l dinámi de ls onentriones de los ompuestos energétios (proteíns, minoáidos y gluos) eseniles pr el uen funionmiento de l vid de los diferentes orgnismos y su relión on los prámetros físios y químios (slinidd y tempertur), en el periodo de invierno (myo-oture). El río se dividió en 1 puntos de muestreo, desde l oopertiv Herrer Memreño hst AGRIMAR II (23 Km). Un vez l mes se tomron leturs de los prámetros físios y químios y reoletron muestrs de gu y sedimento pr evlur ls onentriones de los ompuestos energétios. El río Estero Rel present los myores niveles de turidez de Puerto Morzán hi gus rri. En los meses de myo y oture, el setor de l Coopertiv Herrer Memreño presentó vlores de slinidd de 31.6 ppm y ppm, respetivmente. Los vlores de oxígeno disuelto, en promedio, son menores 2 mg/l en los meses de myo-septiemre y en oture llegn 3.15 mg/l. En todo el periodo de estudio el vlor de ph del gu present un rngo de y pr los meses julio y gosto, respetivmente. En el gu, el omportmiento de ls onentriones de proteíns y gluos presentn lt relión on respeto l omportmiento de l onentrión slin, on un R=.865 y R=.857 respetivmente; no siendo tn entud pr los minoáidos deido que l relión es de R=.595. No ostnte, unque l vriión de l tempertur muestr lgun relión on respeto l dinámi de ls onentriones de proteíns (R=.257), minoáidos (R=.619) y gluos (R=.446) los vlores son inferiores los mostrdos on l vriión slin. En sedimento, los niveles de los tres ompuestos energétios estudidos tienen un tendeni inrementr en el tiempo. Así, l relión de l onentrión slin on respeto los niveles de proteíns present (R=.626), l onentrión de minoáidos (R=.652) y l onentrión de gluos (R=XXX) denotndo un relión de l slinidd menor l oservd en el uerpo de gu. Nuestros resultdos permiten sugerir que el uerpo de gu, que onform el río Estero Rel, present grves prolems de estrés que fet serimente su slud, situión que podrí llevr l perdid de l iodiversidd esturin. XIII

14 1. INTRODUCCIÓN XIV

15 1. INTRODUCCIÓN El eosistem Delt del Estero Rel, Nirgu, pertenee l grn sistem esturino Golfo de Fonse, el ul es omprtido por Nirgu, Hondurs y El Slvdor. Diho humedl es un eosistem que ure más de 7 mil hetáres de esteros y osques de mngle. En él se desrroll fundmentlmente el ultivo de mrón y ls tividdes de pes rtesnl (Lezm, 26). Atulmente, el eosistem del Estero Rel está siendo fetdo deido l vertido de gus on lto ontenido de nutrientes provenientes de ls tividdes uíols y de ls desrgs on lto ontenido de sedimento y mteri orgáni e inorgáni provenientes de los fluentes l Estero (UCA, 1999; Lezm, 26). Ante tl situión, l pidd de reuperión de este importnte uerpo de gu se ve fetd produto del estrés l que está sometido, reflejándose fundmentlmente en los jos vlores de turidez y onentriones de oxígeno disuelto que prevleen en tod el áre de estudio, respetivmente. Bjo ese ontexto, el río Estero Rel no puede rterizrse en este momento omo un eosistem sno, deido l inpidd de regenerión y su respuest l estrés (Costnz, 1992). Por tnto, e menionr que jo ess irunstnis el Estero Rel present ondiiones de eroiidd y neroiidd que resultn estresntes pr todos los orgnismos que hitn ese eosistem, pudiendo reperutir en l perdid de l iodiversidd. Así, este esenrio indi que ls ruts de l degrdión de l mteri orgáni son deido l tivión-inhiiión de orgnismos neroios y eroios, respetivmente. En este sentido, pr explir el grve riesgo de muerte del uerpo de gu del Estero Rel e destr que jo situiones de neroiidd el produto finl del metolismo de ls proteíns y glúidos deriv en metolitos tóxios, tles omo: monio toxio, sulfuro de hidrógeno y metno, que son gses perjudiiles pr l slud niml y vegetl (Korhonen et l., 212; Fenhel y Finly 1995). Es más, en este uerpo de gu existe un lto riesgo pr l slud humn, deido ls ondiiones fvorles pr el reimiento de mirolgs lierdors de toxins y de teris perjudiiles. Por tl rzón, pr evlur ls ondiiones de slud del uerpo de gu del Estero Rel, en el periodo lluvioso, nuestro estudio se enfo sore el metolismo uátio intermedio y su relión on los prámetros físios y químios, evlundo ls onentriones de proteíns y metolitos lires (gluos y minoáidos) pr onoer por un ldo ls onentriones en estdo lire y por otro ldo l dinámi flutunte que nos permit ontr on un indidor del nivel de estrés que fet el estdo de slud del uerpo de gu (Gutiérrez, 29). 2

16 2. OBJETIVOS 3

17 2. OBJETIVOS A lo lrgo de ls últims déds se h rterizdo l río Estero Rel omo uno de los reursos nturles de grn vlor pr l eonomí de muhs fmilis que se dedin l desrrollo de tividdes de pes y uiultur. L ntidd de sedimento, mteri orgáni y ontminntes químios proedentes del rrstre de los fluentes y ls desrgs on lto ontenido de nutrientes por prte de tividdes uíols hn deteriordo l slud de este uerpo de gu, sometiéndolo un nivel de estrés d vez más intenso que provo un lrgmiento del período de reuperión. Trdiionlmente se h rterizdo los prámetros fisioquímios y iológios omo indidores de l slud de los uerpos de gu. Sin emrgo, pr determinr l slud de un eosistem uátio es neesrio evlur l veloidd de degrdión de l mteri orgáni y el resultdo del metolismo intermedio trvés del nálisis de ls onentriones de metolitos lires que están presentes nte ls diverss ondiiones. Se se que muhos orgnismos tún de form onjunt pr llevr o el proeso de degrdión de l mteri y los que más se vinuln son ls teris, hongos, tinomietos y mirolgs. Los estudios reltivos l metolismo uátio on énfsis en resultdos del metolismo intermedio de ls proteíns y glúidos son essos y en el río Estero Rel son prátimente nulos. Por ello el ojetivo generl de l presente memori de investigión es evlur ls onentriones de proteíns y metolitos lires (gluos y minoáidos) y su relión on los prámetros fisioquímios en ls gus del río Estero Rel, en el período (myo-oture) 213. Los ojetivos espeífios que se ordn son los siguientes: Medir los vlores de los prámetros fisioquímios (oxígeno disuelto, slinidd, tempertur, ph y turidez) desde el setor de l Coopertiv Herrer Memreño hst l mroner AGRIMAR II. Determinr l flutuión de ls onentriones de proteín, gluos y minoáidos lires en el uerpo de gu y sedimento, desde el setor de l Coopertiv Herrer Memreño hst l mroner AGRIMAR II. Relionr ls onentriones de proteíns, minoáidos y gluos en el uerpo de gu y sedimento on ls flutuiones de los prámetros fisioquímios. 4

18 3. LITERATURA REVISADA 5

19 3.1. Sistems esturinos Un esturio se define omo un uerpo de gu ostero semierrdo on un onexión lire on el mr ierto, dentro del ul el gu de mr es diluid on gu dule derivd del drenje terrestre. Desde un punto de vist físio l definiión de un esturio dee reonoer ierts similitudes ásis en l distriuión de l slinidd y l densidd, sí omo el ptrón de irulión y los proesos de mezldo; se dee mrr tmién l importni de los límites que ontroln l distriuión de ls propieddes, el movimiento y l mezl del gu (Prithrd, 1967). Regulrmente los esturios se soin l desemodur de los ríos; y ls lguns osters uerpos de gu isldos que se soin llnurs osters on portes menores o estionles de gu dule. El reonoimiento de l diversidd y omplejidd de diversos tipos de esturios y lguns osters, l importni de su extensión geográfi por diversos píses y el interés en el estudio demostrdo por lgunos orgnismos y progrms internionles, h llevdo lgunos utores pensr que son eosistems diferentes (Prithrd, 1967; Dy, 198). L vriión estionl del rngo de mre y l desrg fluvil en un esturio, omo es el so del río Estero Rel, influenin forzosmente l distriuión espil y temporl de los prámetros físio-químios y de igul mner el mteril suspendido. El gu slin del oéno que irul hi dentro del esturio se mezl on el gu de origen fluvil que se mueve hi el oéno, determinndo un ptrón de movimiento de todo el mteril suspendido y disuelto. Asimismo ls distints onentriones de sles, ontminntes, oxigeno, plnton de nutrientes y sedimentos son en prte ontroldos por un ptrón de movimiento que vrín onsiderlemente en ortos periodos (Prithrd, 1955; Mede, 1972) Clsifiión Esturin Los esturios se lsifin en funión de diversos prámetros, y sen físios o químios. A su vez existen lsifiiones fundmentds en l morfologí, el rngo mrel y el grdo de estrtifiión slin de l olumn de gu. Teniendo en uent estos spetos se present un lsifiión sd en l slinidd, y en l difereni fundmentl entre los tipos de esturios en ls vriiones entre l desrg fluvil y el rngo mrel; reonoiendo sí tres tipos de esturios (Prithrd, 1967): 6

20 ) Esturio de uñ slin (ltmente estrtifido). Este tipo de esturio se desrroll undo un río desemo en el mr on mres muy déiles (régimen miromrel) donde el gu dule, menos dens, trnsit por enim del gu sld, más dens, y se form un uñ slin que v penetrndo y delgzándose gus rri. Entre el gu dule y sld hy un mrdo grdiente de slinidd, por lo que se form un hlolin muy definid. Por otr prte ls isohlins (línes de puntos de igul slinidd) se vn disponiendo de form horizontl, de tl mner que l posiión de l uñ slin depende del udl fluvil que se enuentre en el estero. Cundo el udl j, l uñ slin logr penetrr más gus rri logrndo desplzr l uñ slin hst l desemodur (Prithrd, 1967). ) Esturio prilmente mezldo Este se origin undo un río desemo en el mr on un rngo mrel moderdo (régimen mesomrel). Siendo ls orrientes mreles signifitivs en tod l ms de gu lo que propii movimientos rri y jo del esturio on el flujo y on el reflujo. Estos movimientos originn fenómenos de mezl deido l friión entre ls gus, ls orrientes mreles y l friión on el fondo. Resultndo que estos proesos de mezl hgn que l hlolin se muho menos definid que en los esturios de uñ slin (Prithrd, 1967). ) Esturio totlmente mezldo (Sin estrtifiión) Este es un tipo de esturio on rngo mrel lto (régimen mromrel) ddo que ls orrientes mreles son pes de romper l estrtifiión vertil, hiendo posile que l energí del mr hg que l olumn de gu se enuentre ompletmente mezld y que ls isohlins posen un disposiión vertil, on un umento de grdiente de slinidd en direión l mr (Prithrd, 1967) Desripión de l zon de estudio El Estero Rel se enuentr situdo en el extremo Sureste del Golfo de Fonse, Deprtmento de Chinndeg y pertenee l grn Sistem Esturino denomindo omo Golfo de Fonse (Lezm, 2). Es el río más extenso del oidente de Nirgu y reorre 137 km (CIDEA, 26). Los ríos que desemon en el Estero Rel son: Teomp, y el río Villnuev (CIDEA-UCA, 26). 7

21 Cuen del Estero Rel Figur 1. Mp de uiión. Fuente: CSIG-UNAN-LEON Clim L uen hidrográfi del río Estero Rel se loliz dentro de l región limáti tropil de Sn, siendo su prinipl rterísti l preseni de un mrd estión se durnte 6 meses (noviemre-ril), (Curie, 1994). Ls lluvis se muestrn on mrd estionlidd en l épo de invierno, que inii en Myo y onluye en Oture. L evporión no super los 2, mm nules. L tempertur medi nul es de proximdmente 27ºC y l humedd reltiv medi es de proximdmente 74%, mostrndo un disminuión en l épo se y un umento en l épo lluvios. Los vientos dquieren un veloidd medi nul de 6.8 km/h y su mgnitud se relion en form invers on l humedd reltiv. Sin emrgo, solo en los meses de septiemre y oture l veloidd medi de los vientos es de 5.7 km/h y es undo se muestrn los vlores más ltos de l humedd reltiv (Lezm, 2). 8

22 Hidrologí En l prte lt del Estero Rel, de l uen (Ahup, El sue), l ontriuión de gu dule en form de esorrentí, myoritrimente proede de los ríos Teomp y Vill nuev. Aun no existe un estudio o dtos de l ntidd del porte de gu dule proveniente de los ríos en l prte j del Estero Rel, pero tomndo en uent que existen más ríos en l prte lt y onsiderndo el porte de gu dule en form de preipitión pr tod l uen (37.7 millones de m 3 de gu dule por dí) es nturl pensr que es myor el porte de gu dule en l prte lt de l uen y que est viene de l sum del gu proveniente de los ríos más el gu en form de preipitión (CIDEA-UCA, 26). En el speto hidrológio, ls mres y ls desrgs fluviles son omprensilemente importntes; sin emrgo l lluvi, l esorrentí superfiil y l infiltrión tienen myor relevni lol. L flutuión horizontl de mres durnte el guje on l reiente tiene un reorrido del gu de km. y de 13 2 km. on l vinte. Por otro ldo, se estim que el tiempo de remio de gu en el Estero Rel tom de 2 3 meses. Pr Puerto Morzán se estimó omo tiempo de remio de gu 2 6 semns en l épo de invierno y en l zon gus rri de Puerto Morzán, el tiempo de remio hst el Oéno Pífio puede ser de hst 4 meses (Curie, 1994). L uen del Estero Rel muestr serios prolems de erosión hídri en los setores oeste y norte del omplejo volánio Chono-Csits. Así mismo existen difiultdes mientles relionds l destruión de mnglres y ontminión de ls gus produto del dinmismo de l mroniultur (CRM, 211). De tl form que en l épo de lluvi, los ríos rrstrn sedimentos ontmindos por ls tividdes gríols y ls depositn en ls prtes lts y medis de l uen, lterndo l lidd fisioquími de ls gus, lo ul reperute en un severo dño eológio (CRM, 211) Importni del Estero Rel El Estero Rel fue pronunido por el Ministerio del Amiente y Reursos Nturles (MARENA) omo reserv nturl protegid prtir de 1983 y reonoido por l onvenión RAMSAR omo Humedl de Importni Internionl. Desde el ño 23 es un de ls uens hidrográfis más trnsendentles y sede tul de l reiente produión mroner del pís (MARENA, 26). Atulmente, el eosistem esturino del Estero Rel enfrent un proeso rítio de deterioro, deido que este eosistem ofree l oportunidd de efetur numeross tividdes tles omo; l extrión de mngle pr leñ, mder pr onstruiones rustis, mrón juvenil en lguns de invierno (lets y rmles seundrios), pes de esm en lguns y esteros, punhes, onhs, nimles silvestres y l produión de mrones en sistem de estnquerí, lo que h propiido el mnejo inorreto de este reurso nturl (Gutiérrez y Sánhez, 27). 9

23 3.2. Prámetros fisioquímios En los distintos eosistems uátios l preseni de gentes externos o ontminntes de tipo orgánio o inorgánio us modifiiones en ls rterístis físis y químis del gu, perturndo l omposiión y distriuión de ls omuniddes uátis. (Roldn, 1992). En ese sentido, ls modifiiones eológis reperuten en los índies de iodiversidd (Sl et l., 2) deido que fetn ls poliones de pees, plnton y espeies de vid silvestre (Solís et l., 211) Slinidd En los eosistems uátios l slinidd puede vrir en direión tnto horizontl omo vertil y un en un mismo punto puede sufrir vriiones en ls diferentes estiones del ño. L tempertur es uno de los ftores que he mir l slinidd en un uerpo de gu, deido que si es elevd provo un evporión intens y, por ende, un umento de l onentrión de sles. Por el ontrrio los portes de gu dule propii l diluión del uerpo de gu, reperutiendo en l disminuión de l slinidd (Ar, 22; Contrers, 21). Estudios relizdos por el CIDEA, en el período del 2 l 24, muestrn que en l épo de verno el río Estero Rel present ls myores sliniddes, reduiéndose ésts en l épo de invierno (CIDEA-UCA, 26). Por otro ldo, on respeto l ondut de los grdientes slinos, el río Estero Rel se puede lsifir en l tegorí de vertilmente mezldo (CIDEA-UCA, 26). Tl 1. Vlores promedios de onentrión slin en el río Estero Rel. Período Año Máximo (ppm) Mínimo (ppm) Fuente: CIDEA-UCA (26) Tempertur L tempertur del gu se estlee fundmentlmente por muhos ftores dentro de los prinipl tenemos l posiión geográfi del gu (Contrers, 22). Por tnto, l tempertur es uno de los ftores mientles más importntes pr el funionmiento de los orgnismos uátios deido que fet l densidd y visosidd del gu, l soluilidd de los gses y en prtiulr l del oxígeno disuelto; de l mism mner fet l veloidd de ls reiones químis y ioquímis (produtividd primri, reproduión y reimiento de los orgnismos), (Chpmn, 1992; APHA, 1995). Bjo ese 1

24 ontexto, l tempertur del gu tiene un grn importni en el desrrollo de los diversos proesos que en ell se relizn, de form que un umento de l tempertur modifi l soluilidd de ls sustnis (umentndo l de los sólidos disueltos y disminuyendo l de los gses) y fetndo l tividd iológi (Chpmn, 1992; APHA, 1995). Estudios relizdos en el Rio Estero Rel por el CIDEA, indin que l tempertur y l slinidd están goernds por grdientes de mre y el porte pluvil (CIDEA-UCA, 26). Los vlores de tempertur entre el período se muestrn ontinuión. Tl 2. Vlores promedios de tempertur registrdos en el río Estero Rel. Período Año Máximo (ºC) Mínimo (ºC) Fuente: CIDEA-UCA (26) ph El ph en los eosistems uátios nos indi uán áid o ási es el gu. El gu on un de ph 7 no se onsider ni áid ni ási sino neutr, undo el ph es inferior 7 el gu es áid y undo el ph es superior 7 el gu es ási (Contrers, 21). De tl modo, que l esl de ph es de 14.Si l onentrión de dióxido de rono ree en un uerpo de gu, l onentrión de iones de hidrógeno ument, disminuyendo el vlor de ph. Por el ontrrio, si disminuye l onentrión de dióxido de rono, l de iones de hidrógeno desiende, ument el vlor del ph. De tl form, que en el dí el fitoplnton disminuye l onentrión de CO 2, por ende, ument el vlor del ph del gu y en l nohe los vlores de ph disminuyen deido l inremento en l onentrión de CO 2 (Chpmn, y V. Kimtsh, 1992) Oxígeno disuelto El oxígeno disuelto es un ftor primordil pr el desrrollo del metolismo uátio (APHA, 1995). En ondiiones esturins, ls onentriones de oxígeno disuelto flutún en se l nivel de enriqueimiento de nutrientes, tividd fotosintéti y l onentrión de miroorgnismos desomponedores (Rlis et l., 22). Estudios relizdo por el CIDEA, en el río Estero Rel, señln que l distriuión de oxígeno disuelto muestr un ondut similr l grdiente slino, disminuyendo grdulmente desde l o del estero prinipl l interior. Durnte l épo de lluvi (myo-oture) ls onentriones de 11

25 oxígeno muestrn vlores de 4. mg/l er de l o del estero disminuyendo hst 1.6 mg/l en el interior y en l épo se (noviemreril) ls onentriones de oxígeno lnzn vlores myores de 3.6 mg/l en todo el estero (CIDEA-UCA, 26). Tl 3. Vlores promedios de oxígeno disuelto registrdos en el río Estero Rel. Período Año Máximo (mg/l) Mínimo (mg/l) Fuente: CIDEA-UCA (26) Turidez L luz es un ftor determinnte pr l vid de los eosistems uátios, de tl form que l penetrión de l luz en un uerpo de gu propii l tividd fotosintéti (Gutiérrez et l., 26). Por tnto en uerpos de gu on lto nivel de eutrofizión y prtíuls disuelts es muy po l penetrión de l luz en el uerpo de gu (Huthinson, 1975; Wetzel, 21). El diso de Sehi es el equipo usdo pr relizr ls mediiones de turidez, posee utro udrntes lternos (2 negros y 2 lnos) que sirven pr definir hst donde lleg l penetrión de l luz en l olumn de gu (Chpmn, y V. Kimtsh, 1992). 3.3 Metolitos y proteíns Aminoáidos Los minoáidos son moléuls orgánis que funionn omo uniddes estruturles de ls proteíns (Chng, 27); poseen un grupo roxilo, un grupo mino y un grupo R situdos sore el átomo de rono α (Figur 2). Los grupos R vrín en su estrutur, en tmño y en su tendeni ls interiones on el gu, lo ul onstituye un reflejo de su polridd (Lehninger, 1979/29). 12

26 Figur 2. Fórmul generl de α minoáidos. Fuente: Grrett y Grishm (29) Clsifiión de los minoáidos ) En unto su ráter áido o ásio sí pueden ser: Neutros Áidos Básios ) Bsdo en l polridd de sus grupos R undo se hlln en disoluión uos, ph próximo 7.: Aminoáidos polres. Aminoáidos polres: (sin rg o on rg neutr; on rg: Aminoáidos ásios y minoáidos áidos (Figur 3) (Lehninger, 1979/29). 13

27 Figur 3. Aminoáidos proteíos. Fuente: Lehninger (29) 14

28 Reión de Ninhidrin L reión de l Ninhidrin es utilizd profus y prátimente (Figur 4) pr l vlorión untittiv de ntiddes muy pequeñs de minoáidos. El pionero en relizr estudios de nálisis de minoáidos fue Moore (1948), quien se enfoó en el desrrollo del retivo de ninhidrin pr uso en l determinión de minoáidos, y enontró que l preseni de ninhidrin reduid en l soluión es esenil si se puede otener el olor púrpur. (Moore y Stein, 1948/1954; Moore et l., 1958; Spkmn et l., 1958; Bidlingmeyer et l., 1984), que puede ser leído espetrofotométrimente longitud de onds de nm (Pertierr y Tejión, 26). En est reión d reion on 2 moléuls de Ninhidrin (que tún omo gente y oxidntes). L primer Ninhidrin oxid l y form NH3, C 2, R-COH (ldehido) y Ninhidrin reduid (Hidrindntin). L segund Ninhidrin reion on el NH3 y l Ninhidrin reduid pr formr el omplejo oloredo púrpur (Ruhemnn, 191/1911; Aderhlden y Shmidt, 1913; Hrding y Wrenford, 1916; Grssmnn y von Arnim, 1934; Vn Slyke y Hmilton, 1943; Morrell, 1944; MFdyen, 195; MFdyen y Fowler, 195; Troll y Cnnn, 1953; Yemm y Cooking, 1955; West, 1965; Friedmn, 24). Figur 4. Reión de Ninhidrin on los minoáidos Fuente: Villnuev (s.f) 15

29 Proteíns Ls Proteins son sustnis orgánis nitrogends omplejs que se hlln en ls éluls nimles y vegetles. Son polímeros lineles en los que ls uniddes monoméris son los minoáidos que se pliegn en un notle diversidd de forms tridimensionles. (Pertierr y Tejión, 26); y tienen un funión fundmentl en si todos los proesos iológios (Chng, 27). Su misión en el orgnismo es de dos tipos: un de tipo estruturl y l otr de tipo funionl. Por hidrolisis tods ls proteíns rinden α- minoáidos omo produtos finles (Lehninger, 1979) Clsifiión de ls proteíns. Ls proteíns se dividen en dos lses priniples, sándose en su omposiión: proteíns simples y proteíns onjugds. o Proteins simples: Son quells que por hidrolisis produen solmente minoáidos, sin ningún otro produto, orgánio e inorgánio, de hidrolisis. o Proteins onjugds: Son quells que por hidrolisis produen no solmente minoáidos, sino tmién otros omponentes orgánios e inorgánios. (Glioproteíns (rohidrtos), Lipoproteíns (grss), Nuleoproteíns (áido rionuleio), Fosfoproteíns (ésteres de fosfto), Metloproteíns (hierro)). En ls moléuls de ls proteíns los suesivos restos de minoáidos se hlln unidos ovlentemente medinte enles peptídio, formndo lrgs dens no rmifids. Por lo tnto ls proteíns tmién se lsifin de uerdo l número de suuniddes en: o Monoméris: L proteín onst de un sol den polipeptídi (lisozim). o Oligoméris: 2 o más dens polipeptídis, generlmente un número pr. Ls proteíns tmién pueden dividirse en dos grndes lses, sándose en sus rterístis físis: proteíns gloulres y proteíns fiross. o Proteins gloulres: Son solules en los sistems uosos y difunden on filidd. Su den o dens polipeptídi, se hlln plegds estrehmente y doptn forms ompts gloulres o esféris. Ls proteíns gloulres desempeñn hitulmente un funión móvil o dinámi (insulin, miogloin, rionules). o Proteíns fiross: Son insolules en gu y físimente tenes. Atún omo elementos estruturles o protetores en el orgnismo (olágeno, quertin, elstin). 16

30 De uerdo on l funión iológi que desempeñn existen diferentes tipos de proteíns. - Proteíns on tividd tlíti. - Proteíns de trnsporte. - Proteíns de reserv. - Proteíns ontrátiles. - Proteíns estruturles. - Proteíns de defens. - Proteíns reguldors de diversos proesos iológios (Toporek, 1977; Lehninger, 1979; Conn, 199) Estrutur de ls proteíns. Primri: Seueni de minoáidos en el esqueleto ovlente de un proteín. Seundri: Es l orientión reltiv de los átomos del esqueleto (que formn en enle peptídio). Depende de l región plnr en d enle peptídio, l formión de puentes de hidrógeno, seprión deud de los grupos R. Teriri: Desrie el enrollmiento de tod l proteín en un form tridimensionl (3D). Está determind por ls interiones hidrófoos de ls dens lterles, puentes disulfuro, puentes de hidrógeno y grupos prostétios. Cuternri: Desrie omo se unen ls moléuls de proteíns diferentes en grndes estruturs gregds (Toporek, 1977; Lehninger, 1979) Determinión de proteíns Existen diferentes métodos pr l untifiión de proteíns. Muhos de estos métodos se sn en: ) l propiedd intrínse de ls proteíns pr sorer luz en el UV, ) pr l formión de derivdos químios, o ) l pidd que tienen ls proteíns de unir iertos olorntes. Los métodos más utilizdos de uerdo su sensiilidd, sus ventjs e inonvenientes se muestrn en l Tl 4 (Lowry et l., 1951; Brdford, 1976; Fujimoto et l., 1985). 17

31 Tl 4. Priniples métodos pr l untifiión de proteíns sus rngos de sensiilidd y sus ventjs y desventjs. Métodos olorimétrios derivdos Rngo sensiilidd (µg) de Ventjs Inonvenientes Biuret 1-1 Bstnte espeífio pr proteíns Tiene sensiilidd po Muestr interferenis pos Es rto Lowry nm nm nm Tiene stnte sensiilidd No tods ls proteíns reionn igul Muestr muhs interferenis Brdford 1-15 Muy sensile Muestr interferenis detergentes on BCA.5-1 Es el método más sensile Es el que muestr menos interferenis Método del Áido Biinonínio (BCA) El áido iinonínio, sl sódi, es un ompuesto pz de formr un omplejo púrpur intenso on iones Cu 1+ en medio llino. Este retivo form l se de un método nlítio pz de monitorizr el ión uproso produido en un reión entre ls proteíns on Cu 2+ en medio llino (reión de Biuret). L estilidd del retivo y el romóforo proporion un método pr l untifiión de proteíns que es senillo, rápido, muy sensile, y que muestr un grn tolerni ompuestos que fetn otros métodos (Fujimoto et l., 1985). 18

32 Proteín + Cu 2+ Cu 1+ Cu 1+ + BCA omplejo púrpur BCA- Cu 1+ Figur 5. Prinipio de l reión del método del Áido Biinonínio Fuente: Fujimoto et l., (1985) Gluos L gluos es l hexos más omún en los polisáridos. Los orgnotrofos pueden utilizr ompuestos omo l gluos omo fuente de rono y omo fuente de energí. Los polisáridos son polímeros formdos prtir de monómeros de zúr (Brok y Mdign, 1991). Los disáridos más orrientes son l mltos, l eloios, l ltos y l sros. L mltos se form omo un produto intermedio de l ión de ls milss sore el lmidón que ontiene dos restos de D-gluos unidos medinte un enle gluosídio entre el átomo de rono 1 del primer resto de gluos, y el átomo de rono 4 de l segund gluos. L eloios ontiene dos uniddes de D-gluos y es l unidd que se repite en l elulos. L sros es un disárido de gluos y frutuos. Es extremdmente undnte en el reino vegetl. El lmidón y el gluógeno ontienen únimente uniddes de gluos, es deir que son glunos. Entre los polisáridos de reserv el lmidón es el más undnte en ls plnts y en los tejidos nimles, espeilmente en el hígdo y músulos, es el gluógeno, depositdo normlmente en form de grndes gránulos en el itoplsm elulr.. El lmidón ontiene dos tipos de polisáridos, l α-milos y l milopetin. L milos puede hidrolizrse por medio del enzim α- mils, de tl mner que se otienen finlmente un mezl de gluos y mltos. Por trjo onjunto de l α-mils y de l α 1,6 gluosids se puede degrdr ompletmente l milopetin.. El gluógeno es un polisárido rmifido l igul que l milopetin y se hidroliz de igul form on muh filidd por ión de α-mils y de l α 1,6- gluosids.. L elulos es el omponente prinipl de ls gruess y rígids predes elulres de ls plnts y onstituye el 5 % de l mteri orgáni totl de l iosfer. Cundo l elulos es hidrolizd ompletmente produe únimente D-gluos y en el so de hidrólisis pril el resultdo son uniddes de eloios (Lehninger, 1979; Conn, 199). 19

33 Determinión de gluos L gluos se determin después de l oxidión enzimáti en preseni de gluos oxids. El peróxido de hidrógeno formdo reion jo l tálisis de peroxids on fenol y 4-minofenzon formndo un omplejo rojo-violet usndo l quinoneimin omo indidor. (Teusher y Rihterih, 1971; Brhm y Trinder, 1972). GOD Gluos + O 2 + H2O áido gluónio + H 2 O 2 2 H 2 O minofenzon + fenol quinoneimin + 4 H 2 O 2 Figur 6. Prinipio de l reión de Gluos Fuente: Teusher y Rihterih, (1971); Brhm y Trinder, (1972) 3.4. Eosistem uátio En los mres y oénos de todo el mundo los miroorgnismos son responsles de los proesos de desomposiión de l mteri orgáni (Atls y Brth, 22). El gu dule ontinentl en form de ríos y ls filtriones de gu suterráne se enuentr on el gu de mr en los esturios y de mner rterísti los esturios son más produtivos que el mr y que ls gus ontinentles (Dy, 195) deido que los nutrientes trnsportdos por los ríos son depositdos en los esteros. Además, los esturios se rterizn por mntener un grdiente de slinidd j en l prte lt y lto er de l desemodur (Curie, 1994). Todos los esteros están sujetos l flujo de ls mres, puesto que los nutrientes que llegn proedentes de los ríos osiln trvés del esturio deido l flujo de ls mres en un movimiento neto hi el mr ierto (Atls y Brth, 22). El neustón es l p que sirve omo háitt fvorle pr miroorgnismos fotoutótrofos, deido que los produtores primrios tienen eso ilimitdo l dióxido de rono tmosfério y l rdiión luminos. En l superfiie de est mirop se d un enriqueimiento de lgunos nutrientes minerles y en lgunos metles. L miroiot utóton rterísti del neustón omprende lgs, teris, hongos y protozoos (Vlknov, 1968). En mientes uátios los miroorgnismos son gentes tivos en el reildo de minerles y en l iodegrdión de l mteri. Ls teris desomponedors y ls poliones fúngis son muy importntes en esturios osteros y el totl de iomss fúngi viv puede umentr más del 1 por iento de l omunidd totl durnte l degrdión de los rotes vegetles, los ules están ompuestos en su myor prte por elulos, hemielulos y lignin (Pul y Clrk, 1996). 2

34 L prtiipión terin en l degrdión de los rotes ourre priniplmente sore ls prtíuls íds en el uerpo de gu e impli l produión de exoenzims y l ptur de los produtos disueltos (Atls y Brth, 22). Tnto en ondiiones eróis omo neróis los mro y miroorgnismos omprten l pidd de degrdr nutrientes orgánios senillos y lgunos iopolímeros omo lmidón, elulos, petin y proteíns (Flngn, 1978) Priniples miroorgnismos desomponedores Bteris Ls teris desempeñn un ppel entrl en l trnsformión de l mteri y en el flujo de energí en los eosistems uátios y que prtiipn en el intermio de elementos químios en ls fses suelo-gu y gu-tmósfer (Fenhel et l., 1998). L fse iniil del tque miroino se rteriz por l rápid pérdid de mteri orgáni fáilmente desomponile. Ls moléuls myores deen primero ser degrdds moléuls más pequeñs por enzims seretds l exterior por l propi teri (exoenzims). En el so de ls teris Grm negtivs ests exoenzims se enuentrn lolizds fundmentlmente en el espio periplásmio (uido entre l memrn extern y l memrn itoplsmáti), mientrs que en ls teris Grm positivs están nlds en l memrn itoplsmáti. Ests enzims son tivs sore: proteíns, polisáridos, lípidos y áidos nuleios entre otros (Lynd et l., 22). Ests enzims pueden ser onstitutivs (se sintetizn siempre) o induiles (se sintetizn sólo undo está presente su sustrto); es difíil determinr uáles son los mínimos nutrientes neesrios pr que l teri soreviv y se multiplique, sin emrgo, onsiderndo los omponentes elulres, se firm que ls teris neesitn fundmentlmente: gu, fuente de Crono, Nitrógeno (N 2 ), Azufre (S), Ddores de H 2 y reeptores de H 2, Iones inorgánios (P, K, Mg), elementos trzs u oligoelementos, los nutrientes que se enuentrn en el medio que rode ls teris deen proporionr ls ondiiones físio-químis propids, que fvorezn el reimiento terino, tles omo, tempertur, presión osmóti y ph (Atls y Brth, 22; Fores et l., 22; Artijs, 28; Felix et l., 21). Ls Bteris Aido Látis (BAL) son teris estritmente fermenttivs, reen un ph entre 4,8 y 9,6 y no formn espors. Pueden ser ilos y oos Grm positivos, inmóviles, tls y oxids negtivos, nerois erotolerntes. Este tipo de teris promueve l fermentión de mteri orgáni y desomponen mteriles omo lignin y elulos (Zhou et l., 29); poseen l pidd de inhiir otros miroorgnismos deido l produión de sustnis ntimiroins omo áido látio, peróxido de hidrógeno y terioins (ntiterinos), o sustnis preids ntiiótios omo idofilin, ltoidin produids por Ltoillus idophilus, ltolin produid por Ltoillus plntrumy, nisin produid 21

35 por Streptoous ltis, (Visser et l., 1986). De igul mner ls BAL son produtores de nisttin y de áidos orgánios omo áido étio, utírio, próio, propiónio, áido 4-hidroxi-fenilátio y áido-3-fenilétio reonoidos omo ntifúngios (Lowe y Arendet, 24; Ström, 25; Yngid et l., 26) Atinomietos Los tinomyetes son teris filmentoss Grm positivs, son proriontes que minerlizn l mteri orgáni que hongos y teris verdders generlmente no degrdn y estos son undntes en suelos, pero tmién enontrds en mientes uátios duleuíols y mrinos. (Cross, 1981; Jensen y Fenil, 1994). Son eroios heterótrofos priniplmente, formdores de espors y on lto ontenido G+C (7 74%) en su DNA. El género prinipl es Streptomyes uyo olor rterístio tierr húmed se dee ompuestos volátiles omo l geosmin. Espeies de l fmili Streptomyetee se enuentrn extensmente distriuids y estudids deido l produión de metolitos seundrios omo enzims inhiitoris extrelulres que funionn omo ntiiótios (Lezhv et l., 1995; Sm y Kinkel, 21; Leiv et l., 24; Shltter et l., 29). Son pes de degrdr moléuls omplejs y sustnis relitrntes omo elulos, lignoelulos, xilno y lignin; diionlmente juegn un importnte ppel en el proeso de desomposiión de mteril orgánio, deido sus enzims lítis (González et l., 29; Sous et l., 28; Zhou et l., 29; Lynd et l., 22). Dentro de los miroorgnismos pes de degrdr elulos, Solns y Vois (23) demuestrn que los tinomietos y en espeil los Streptomyes poseen er de un 33% de tividd degrddor de elulos. Aunque, tmién se se que son pes de produir otrs enzims degrddors omo: tls, mils, lips, elulss y xilnss que tún en l desomposiión de mteri orgáni (Jiménez, 211) Hongos Los hongos poseen rterístis fundmentles tles omo: Todos son heterótrofos (quimioorgnótrofos), teniendo que limentrse de mteri orgáni preformd que utilizn omo fuente de energí; poseen un pred elulr rígid formd por polisáridos, polipéptidos y quitin; deido l rigidez de l pred elulr no pueden fgoitr prtíuls limentiis sino que soren nutrimentos simples y solules que otienen l desintegrr polímeros medinte enzims extrelulres llmds despolimerss; y presentn tlo o mielio. (Bresinsky, 1986; Méndez, 28). Los hongos uátios se pueden distriuir en utro grupos: Phyomietes: Presentn forms de propgión flgelds y por est rzón preen espeilmente dptdos medio uátio. 22

36 Hifomietes: Hongos imperfetos tienen un mielio septdo, que generlmente se enuentrn en tejidos vegetles en desomposiión. Estos hongos son los responsles de los proesos de olonizión y degrdión del mteril vegetl que e en l superfiie de los uerpos de gu, permitiendo que otros orgnismos presentes en el eosistem uátio lo utilien pr su limentión. Asomietes: Dentro de este grupo se enuentrn ls levdurs y ests se podrín onsiderr omo el tipo iológio de hongos mejor dptdos vivir suspendidos en el gu. Bsidiomietes: dentro de este grupo perteneen los hongos lignolítios o hongos de l pudriión ln (Sntmrin et l., 1997). Los hongos por medio de l sereión de enzims hidrolítis desempeñn un ppel fundmentl en l depolimerizión de los omponentes orgánios, de los diferentes residuos, en el medio uátio y terrestre (Mrx et l., 21). Por tnto, los hongos son unos de los grupos priniples y fundmentles en los proesos de degrdión de l mteri orgáni, puesto que l produión de ests enzims extrelulres son potenilmente útiles en l degrdión del sustrto y que ests hidrolizn moléuls grndes omo el lmidón, elulos, hemielulos, petin, lípidos y áidos nuleios (Cruz et l., 29). Entre ests enzims ls más importntes son elulss, hemielulss, protess, lipss, fosftss y risulftss (Mondini et l., 24). Los hongos filmentosos produen un grn ntidd de xilnss extrelulres en omprión on ls levdurs y teris que los he ser los priniples degrddores de xilno (Kulkrni et l., 1999; Lynd et l., 22; Phm et l., 1998). Así mismo, los hongos tmién son responsles de l myor elulosis en l nturlez (Ferrer et l., 211), por l efiieni y diversidd de sus sistems elulolítios, y sus ventjs dpttivs (Rmos y Forhissin, 1996). Por otr prte los hongos de l pudriión Asomyots y Bsidiomyots son importntes en el proeso de desomposiión de l mder hst su minerlizión, esto deido l tividd de su omplejo enzimátio espeilizdo de peroxidss, lss y elulss deshidrogens, que tienen grn importni en el ilo del rono (Chprro y Ross, 26). Los tronos de mder ontienen zures en ls olumns de ls rátes del prénquim que se enuentrn longitudinlmente. Por tnto, undo los restos de ároles (rms, toones hojs et) en, ls olumns son rápidmente olonizds por hongos que pueden mir el olor de l mder (Ej. Trihoderm spp.). Un vez ourrido esto, l mder se vuelve esile solo pr los hongos de l pudriión (Asomyot y en espeil Bsidiomyot) (Chprro y Ross, 26), los ules tn l mder e invden sus éluls pr otener limento. De uerdo l modo de tque y de ls ondiiones en que los hongos reen ls priniples tegorís en l desomposiión son: 23

37 L pudriión lnd: Ourre undo el dño usdo por el miroorgnismo es superfiil. Es usd por Asomyetes y Deuteromyetes los ules genern un destruión lolizd de l elulos lrededor de l hif, formndo un vidd en l pred seundri (Chprro y Ross, 26). L pudriión fé: Cusd priniplmente por sidiomietes, los ules degrdn ls hemieluloss y ls elulos despolimerizd (Chprro y Ross, 26). L pudriión ln: Degrdn profund y ompletmente los omponentes lignoelulósios (Ryner y Boddy, 1988) Mirolgs Un propiedd muy onoid de ls mirolgs es l produión de enzims extrelulres, tles omo; mils, protes, lips, eluls y fosfts que prtiipn en los proesos de degrdión de l mteri orgáni (Rodríguez, 21); Los géneros Cholorooum y Spongiooum produen enzims proteolítis extrelulres y enzims milolítis (Arhil y Bold, 197; Deson, 1976), Chlorell, Ankistrodesmus y Senedesmus poseen l hilidd de degrdr geltin y en ditomes tles omo Nvíul y Nitzshi se h desuierto tividd grolíti, proteolíti, y fosfts (Tnk y Ohwd, 1987) Menismos de degrdión de l mteri orgáni L mteri orgáni sujet l degrdión miroin proviene de remnentes vegetles, restos de nimles y plnton. Los miroorgnismos tienen pidd de produir exoenzims degrddors de ompuestos orgánios en ls gus fin de generr sustrtos más similles pr su reimiento y metolismo. (Rodríguez, 21). Durnte l desomposiión de los residuos vegetles, l mteri orgáni se iodegrd trnsformándose en pequeñs moléuls on friones solules en gu un ritmo vrile. Así, los ompuestos hidrolizdos o fermentdos se soluilizn y lgunos de estos lnzn l minerlizión rápidmente, omo ls proteíns y rohidrtos, mientrs que los onstituyentes de ls memrns vegetles se desomponen lentmente (Gutiérrez et l., 28); entre ellos, ls eluloss y hemieluloss se degrdn más rápido que ls lignins; est primer etp de desomposiión d origen preursores de dens lifátis omo péptidos, polisáridos y minozúres (Chprro y Ross, 26). 24

38 Figur 7. Iniiión proeso de humifiión. 25

39 Degrdión de elulos L elulos es uno de los omponentes más undntes de l ioms vegetl. En su form ntiv se ompone de un den linel de uniddes de gluos on enles gliosídios β- 1,4 (Fn y Lee, 198). Y onstituye un undnte fuente de rono, limitd los miroorgnismos pes de hidrolizr los enles gliosídios β- 1,4, deido l omplejo sistem de enzims denominds elulss o elulolítis (Ferrer et l., 211). Dentro de ls enzims que prtiipn en el proeso de degrdión de mteri orgáni, ls elulss son un de ls más importntes, puesto que prtiipn en el ilo del rono medinte l degrdión de desehos vegetles (Gutiérrez et l., 28). Est hidrólisis es llevd o por tres enzims (i) l endo β-1,4 gluns (β-1,4 gluno glunohidrols), (ii) l exo β- 1,4 eloiohidrols y (iii) l β-1,4 gluosids (Chprro y Ross, 26; Zhng et l., 26; Ferrer et l., 211). L endo β-1,4 gluns hidroliz letorimente los enles β- 1,4 gluosídio intrmoleulres esiles de dens de elulos, pr produir oligosáridos de vris longitudes. L exo β-1,4 eloiohidrols liv los extremos no redutores del sustrto, generndo uniddes de eloios o gluos y por último l β-1,4 gluosids, omplet el proeso hidrolítio onvirtiendo los frgmentos de eloios gluos o removiendo gluos desde los extremos no redutores de pequeños eloligosárido (Chprro y Ross, 26; Zhng, et l., 26). Finlmente l gluos lire puede ser tomd por ls éluls miroins omo fuente de rono (Chprro y Ross, 26). Tnto ls teris omo los hongos y los tinomyetes, eroio, neroios, mesófilos y termófilos que oupn un vriedd de háitt son pes de degrdr elulos (Gitn y Pérez, 27) deido l síntesis de ls elulss (Jiménez, 211; Stutzererger, 1972; Ceroni y Gutierrez, 1988; Bros y de Queiroz, 1996). 26

40 Tl 5. Miroorgnismos elulolítios Grupos de miroorgnismos elulolítios Hongos Bteris erois Bteris nerois Género Trihoderm reesei Phnerohetes hrysosporium Fusrium solni Peniillum funiulosum Trihoderm koningii Trmetes sp Aspergillus sp. Muor sp. Geotrihum sp. Rhizotoni sp. Peilomyes sp. Cldosporium sp. Bulgri sp. Chetoium sp Cellulomons sp. Miroispor ispor Thermomoospor sp. Cytophg sp. Pseudomons sp. Thermoifidi sp. Aetivirio ellulolytius Butivirio sp. Bteroides ellulosolvens Bteroides suinogenes Clostridium ellulovorns Clostridium thermoellum Ruminoous lus Ruminoous flvefiens Streptomyes drozdowizii Streptomyes ellulolytius Atinomietos Thermonospor urvt Thermonospor hromogen, Thermonospor l Thermomoifidi fus Fuente. Lynd et l., (22); Semedo et l., (24); Grigorevski et l., (25); Li (1997); Rmírez y Coh (23) Degrdión de Xilno El xilno es el segundo polisárido más undnte después de l elulos. Sin emrgo, es degrddo más rápidmente que l elulos, priniplmente por hongos filmentosos (Phm et l., 1998) deido su lt produión de xilnss extrelulres (Kulkrni et l., 1999; Lynd et l., 22). 27

41 L xilns es un heteropolisárido que puede ser segregdo de mner onstitutiv o induid. L degrdión del xilno, es llevd o por un grupo de enzims omo l endo-β-d-xilnss que rompe los enles gliosídios l zr; l rinofurnosids hidroliz ls dens lterles de rinos; l etilxilnesters lier grupos ettos; l gluoronids remueve ls dens lterles de áido gluurónio prtir de uniddes de xilos; l β-xilosidss son enzims tivs sore oligosáridos ortos, llevndo o l hidrólisis de los enles β-1,4-ril-xilopirnósido produiendo xilos (Pone y Pérez, 22) Degrdión de Quitin L quitin es un homopolímero insolule, formdo por residuos de N-etil-Dgluosmin unid por enles β-1,4. Su estrutur es similr l de l elulos exeptundo el grupo hidroxilo (-OH) presente en el rono dos de l elulos. Este polímero se enuentr mplimente distriuido en l nturlez omo un omponente estruturl de hongos, insetos, rustáeos y protozoos (Mukherjee y Sen, 27). Al igul que el xilno, l quitin es otro de los ompuestos más undntes del plnet y se enuentr reliondo on proteión y resisteni en nimles inferiores omo rustáeos, zooplnton, fitoplnton y hongos on exepión de los oomietos. Es un polisárido insolule y se enuentr en forms tles omo lf-quitin, et-quitin y gm-quitin (Sstoque, 25; Yoon et l., 2). El proeso iológio de l degrdión de quitin es llevdo o medinte l ión de quitinss que hidrolizn el enle gliosídio β-1,4; ests enzims formn prte del sistem quitinolítio junto ls quitoioss, enzims de ión sinérgi y onseutivs presentes en Streptomyes. Muhos Streptomyes pueden utilizr l quitin omo úni fuente de rono. Por lo tnto, pueden degrdr l pred elulr de hongos. En los tinomietos, espeífimente en Streptomyes, se hn desrito muhs quitinss de tipo endo y exoelulres. Inluso, lgunos miroorgnismos llegn poseer un grn vriedd de quitinss omo el so de S. lividns que posee tres enzims pr hidrolizr ls diferentes lses de quitin que se enuentrn en l nturlez (Yoon et l., 2) Degrdión de lignin L lignin es un polímero on un lt onentrión de nillos romátios y un profundo grdo de polimerizión (Cstillo, 24). Por tnto, le onfiere un proteión físi l elulos y l hemielulos ontr el tque enzimátio deido su lt resisteni l desomposiión; l lignin es efiientemente degrdd en l nturlez, priniplmente por los hongos de l pudriión ln o hongos lignolítios (Bsidiomietos) que tn y metolizn l myor prte de los onstituyentes de l mder, siendo pes de 28

42 despolimerizr y metolizr l lignin medinte l sereión de un omplejo extrelulr de enzims oxidss y peroxidss que tlizn ls primers reiones. Rompiendo ls uniones dentro de l omplej moléul de lignin pr generr moléuls más pequeñs (Chprro y Ross, 26; Dávil y Vásquez, 26; Córdo, 29). L hilidd de un miroorgnismo de degrdr lignin, se dee l funionmiento de diverss enzims; ls más importntes son l lignin peroxids (LiP), mngneso peroxids (MnP) y ls lss (Selvm et l., 23), ls ules pueden estr presentes en dependeni de l espeie de hongo o el sustrto. Ests enzims iniin el proeso de degrdión de l lignin por l mediión de l enzim lignin peroxids (LiP), l ul rompe enles C-C o enles éter (C-O-C) de ls dens rilpropno, formndo en lgunos sos monolignoles omo el áido ferúlio, que luego por l ión de enzims peroxidss (LiP y MnP) ps vinillin (Chprro y Ross, 26) Eutrofizión L eutrofizión en los uerpos de gu es produto del inremento de ls onentriones de nutrientes, priniplmente nitrógeno y fósforo que estimuln el reimiento de lgs. En ls últims déds, el efeto del mio limátio y el reimiento de l tividd industril de l polión, tles omo diverss prátis gríols, plnts de trtmiento de gus servids, esurrimiento urno y l quem de omustiles fósiles hn umentdo ls portiones de nutrientes en los uerpos de gu (Briker et l., 1999). Se se que ls lgs se desrrolln undo tienen presentes ondiiones fvorles omo tempertur, sol y nutrientes. El enriqueimiento en nutrientes, en ls gus, produe un reimiento exesivo de lgs, ls ules l morir se depositn en el fondo de los ríos o lgos, generndo residuos orgánios que l desomponerse onsumen grn prte del oxígeno disuelto, por lo que se propii l muerte por sfixi de l fun y flor, hst el punto de mtr el río o lgo por ompleto (Neel y Wright, 1999) Efetos del proeso de eutrofizión Los eosistems uátios eutrofizdos experimentn un lterión de l iot y de l diversidd iológi, l ul es provod por l proliferión de inofits y mrófits en demsí. El desrrollo de estos orgnismos provo opidd que impide l penetrión de l luz hst regiones profunds de l olumn de gu. Bjo ese ontexto ls onseuenis direts son l imposiilidd de llevr o l fotosíntesis en lugres d vez menos profundos y por lo tnto, l disminuión en l produión de oxígeno lire (Akefors y Enell, 1992). Est situión provo que el fondo del eosistem uátio se onviert de form grdul en un miente neroio, y el onseuente umento en l onentrión de gses omo nhídrido sulfuroso (H2S), metno (CH4) y nhídrido rónio (CO2) he poo ftile l vid de l myorí de ls espeies que formn diho eosistem. Dándose por tnto, l 29

43 mortndd msiv de l iot uáti (Korhonen, 212) deido l umulión de sustnis toxis que reduen ls ondiiones óptims de ienestr niml y vegetl, filitndo l priión de orgnismos ptógenos y vetores de enfermeddes (Akefors y Enell, 1992). Primer Etp (Oligotrófio) Agu lr L luz penetr Prosper l vegetión uáti sumergid Segund Etp (Mesotrófio) Agu turi L vegetión uáti sumergid qued en l osuridd Terer Etp (Eutrófio) Agotmiento del oxígeno Muerte de los verterdos por sofoo Figur 8. Esquem de ls uss de l Eutrofizión Fuentes: Neel y Wright (1999) Cuss del proeso de l eutrofizión Ls priniples uss ntropogénis pueden ser:. Un de ls más ntigus uss es l desrg de gus residules, ls ules son ris en nutrientes, ontriuyendo l mio trófio del uerpo de gu reeptor. 3

44 . El uso exesivo de fertilizntes gener l ontminión del gu medinte el porte de nitrógeno (en form de sles de nitrto y monio) y fósforo (omo fosfto).. L deforestión y l erosión en suelos gríols influyen en l rg de nutrientes, deido que los esurrimientos l psr por un tierr que no tiene proteión lvn l p fértil, llevándose onsigo los nutrientes. L preseni de gses mientles tles omo óxidos de nitrógeno (NO 2 ) y óxidos de zufre (SO 2 ) l entrr en ontto on el gu tmosféri formn ion nitrto (NO-3) e ion sulfto (SO-24) que formn sles solules l lnzr el suelo on los tiones del mismo, generndo un emporeimiento de dihos iones. Dihs sles son volds fáilmente en los uerpos de gu, dndo lugr un proeso de eutrofizión (Akefors y Enell, 1992). L eutrofizión de los uerpos de gu es de preoupión, deido que puede tener muhs onseuenis negtivs. Estos inluyen imptos eológios (omo el deterioro de l lidd del gu y l pérdid de l diversidd iológi), estétios, reretivos y efetos en l slud humn. Que finlmente reperuten en l eonomí de los píses (Ntionl Eutrophition, 22) Priniples modifiiones del inremento de nutrientes en el miente fisioquímio del gu y del sedimento. El umento de l rg de nutrientes determin un myor ioms de produtores primrios y seundrios en el sistem, que se trdue en un notori modifiión de l trnspreni y olorión del gu produto del inremento del fitoplnton (Moss, 1996). Por tnto, l exesiv generión de mteri orgáni super l pidd de degrdión del sistem, determinndo su umulión en el sedimento, ondiionndo l distriuión de l onentrión de oxígeno disuelto en l olumn de gu. Por otro ldo, en los sistems poo produtivos l onentrión de oxígeno disuelto está determind priniplmente por ftores físios (fundmentlmente por l tempertur) y no se oservn diferenis muy notoris entre ls ps superfiiles y profunds (Moss y Phillips, 1996; Sheffer, 1998). El umento de l produtividd promueve diferenis vertiles en l onentrión de oxígeno, registrándose vlores elevdos en superfiie produto de l tividd fotosintéti y vlores ernos ero en el fondo, resultdo de l degrdión de l mteri orgáni (Wetzel, 21). Cundo l respuest l proeso de eutrofizión es el desrrollo exesivo de plnts flotntes lires, el intermio gseoso entre l olumn de gu y l tmósfer se ve limitdo, registrndo ondiiones de hipoxi o noxi en tod l olumn de gu (Moss y Phillips, 1996; Sheffer, 1998). El défiit de oxígeno ontriuye l predominio de l desomposiión nerói que gener gses sulfhídrio o metno, lo que se trdue en prolems de olor y sor del gu. El umento de l produtividd primri tmién determin vriiones 31

45 diris del ph en l olumn de gu deido que el onsumo de CO 2 por los proesos fotosintétios sifi el gu, mientrs que los proesos de desomposiión idifin el gu deido l lierión de CO 2. Si ien durnte el proeso de eutrofizión l onentrión de nutrientes ument onsiderlemente, l elevd tividd fotosintéti puede determinr que ls friones disuelts diretmente similles omo el monio (N-NH4+), el nitrto (N-NO3) y fósforo retivo solule (priniplmente PO4-3) presenten vlores muy jos o indetetles deido su lt ts de inorporión (Gorg et l., 22). Figur 9. Efeto de l eutrofizión en los uerpos de gu. Fuente: (Gorg et l., 22) 32

46 4. MATERIALES Y METODOS 33

47 4.1. Áre de estudio. El presente estudio se relizó en el río Estero Rel, Deprtmento de Chinndeg, Nirgu. L zon de estudio tiene un longitud de 23 Km; dividos en 1 puntos de muestreo (P). Figur 1. Mp de puntos de muestreos. (P1: Herrer Memreño: N 12º51.73', W 87º8.539'; P2: Sn Mrtin N 12º51.25', W 87º8.844'; P3: Emplme N 12º5.632', W 87º9.235'; P4: Puerto Morzán: N 12º5.984', W 87º1.193'; P5: Crlos Fonse: N 12º51.99', W 87º1.55'; P6: Lngostinos: N 12º56.147', W 87º1.695'; P7: El Semilll: N 12º52.868', W 87º11.74'; P8: L Treint: N 12º53.229', W 87º12.637'; P9: AGRIMAR I: N 12º53.993', W 87º12.774'; P1: AGRIMAR II: N 12º54.419', W 87º13.252'). 34

48 Tl 6. Coordends puntos de muestreo en el Río Estero Rel, Nirgu. Puntos Loliddes Longitud Ltitud P 1 Herrer Memreño 87º8.539' 12º51.73' P 2 Sn Mrtin 87º8.844' 12º51.25' P 3 Emplme 87º9.235' 12º5.632' P 4 Puerto Morzn 87º1.193' 12º5.984', P 5 Crlos Fonse 87º1.55' 12º51.99' P 6 Lngostino 87º1.695' 12º56.147', P 7 El Semilll 87º11.74' 12º52.868', P 8 L treint 87º º53.229' P 9 AGRIMAR I 87º12.774' 12º53.993' P 1 AGRIMAR II 87º13.252' 12º54.419' 4.2. Metodologí experimentl pr l tom de muestrs Los muestreos se hiieron un vez l mes (Myo-Oture) relizndo un reorrido que iniio en l Coopertiv Herrer Memreño (P1) y finlizo en AGRIMAR II (P1), siempre entre ls 1 y 11 de l mñn, en mre lt. El proedimiento pr l relizión de l tom de dtos fue el siguiente: 1. Los prámetros fisioquímios se midieron un profundidd de 2 m de l superfiie del uerpo de gu, siempre en el entro del río. 2. Ls muestrs de gu y sedimento pr l evluión de d uno de los prámetros de nálisis (Proteín, gluos y minoáidos) se relizo usndo el proedimiento que se muestr en l figur

49 AGUA 1. Ls muestrs de gu se otuvieron en el entro del rio, usndo un tuo de PVC de 2 pulgds y 1 m de lto pr otener muestr de 1 metro de l olumn de gu (por triplido) 2. El gu se deposit en un uet on pidd de 5 L y del volumen de gu otenido se tomron líuots de 1ml por triplido pr el nálisis de d prámetro. SEDIMENTO Ls muestrs de sedimento se tomron en uno de los extremos del rio (jo el gu, 2 Cm de profundidd), usndo un reipiente previmente rotuldo, on volumen de 5 m 3. Durnte el tiempo de muestreo, tods ls muestrs se mntuvieron en hielo 4 o C y solo ls líuots de gu pr evluión de gluos y minoáidos fueron desproteinizds on PCA.6N, ontinuión tods ls muestrs se ongelron -3 C hst su uso posterior. Figur 11. Tom de muestrs de gu y sedimento. 36

50 4.3. Determiniones Anlítis Cuntifiión de niveles de metolitos lires en el uerpo de gu Proedimiento previo l relizión del nálisis de ls muestrs pr evlur gluos y minoáidos: 1. Ls muestrs se neutrlizron on ironto potásio 1M 2. Se entrifugron, en un entrifug FISHER SCIENTFIC, modelo (uspin Miro 17) 8, rpm (gluos y minoáidos) durnte 1 min pr preipitr los uerpos elulres 3. Se tomó el sorendnte y se entrifugo (minoáidos) 13 rpm durnte 4 min pr l preipitión de ls proteíns. Posteriormente se tomó el sorendnte pr su nálisis. Figur 12. Proesmiento de muestrs previo l nálisis de gluos y minoáidos. En d ensyo experimentl ls muestrs siempre se nlizron en prlelo on l urv de lirión dentro de l miropl; prtir de l ul se extrpolron los vlores de onentriones de ls muestrs Gluos En todos los experimentos los niveles de gluos lire en gu se determinron enzimátimente utilizndo un kit omeril (Spinret, Espñ) dptdo l formto de miropls. 37

51 1. Pr desrrollr l urv estndr se uso D- Gluos 2. Previo ls leturs de sorni, l miropl se gito por 5 min 3. Se oloó en l estuf J.P Selet, modelo DIGITHEAT 15L por 1 min tempertur de 37 o C 4. Seguido se introdujo en el letor de miropls (Bio Tek ELx 8) pr otener l letur de sorni 515 nm Figur 13. Psos pr el nálisis de gluos Aminoáidos Los niveles de minoáidos lires en gu, un vez otenido el sorendnte (prtdo 4.3.1), se untifiron usndo el método olorimétrio de l Ninhidrin propuesto por Moore (1968). 1. Pr desrrollr l urv estndr se uso L- Alnin 2. Previo ls leturs de sorni, l miropl se gito por 5 min 3. Se oloó en l estuf J.P Selet, modelo DIGITHEAT 15L por 3 min tempertur de 75 o C 4. Seguido se introdujo en el letor de miropls (Bio Tek ELx 8) pr otener l letur de sorni 57 nm Figur 14. Psos pr el nálisis de minoáidos. 38

52 Cuntifiión de niveles de proteíns lires en el uerpo de gu L untifiión de los niveles de proteíns en gu, se hizo de uerdo on el Método del Áido Biinonínio (Fujimoto et l., 1985). 1. se entrifugron ls muestrs 9 g por 1 min 2. Pr desrrollr l urv estndr se uso serolúmin ovin 3. Previo ls leturs de sorni, l miropl se gito por 5 min 4. Se oloó en l estuf J.P Selet, modelo DIGITHEAT 15L por 6 min tempertur de 37 o C 5. Seguido se introdujo en el letor de miropls (Bio Tek ELx 8) pr otener l letur de sorni 57 nm Figur 15. Psos pr el nálisis de proteíns. 39