Diagnóstico genético de preimplantación (DGP)

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1 Avances EFICAZ OPCIÓN PARA PACIENTES QUE PRESENTAN ALTO RIESGO DE INFERTILIDAD O ESTERILIDAD Diagnóstico genético de preimplantación (DGP) Equipo Diagnóstico Genético de Preimplantación Dra Claudia Perandones Especialista en Genética Médica Dra Vanesa Lotersztein Especialista en Genética Médica Dra Albertina Paganini Especialista en Fertilidad Dr Agustín Pasqualini Especialista en Fertilidad Dr Carlos J. Quintans Director Lab. de Procreación Asistida Dra Mónica Donaldson Lab. de Procreación Asistida Dr Alejandro Laudicina Especialista en Citogenética Molecular, CNEA Dra María Muhlmann Directora Lab. Citogenética Molecular CNEA Investigadora CONICET Dr R. Sergio Pasqualini Director Correspondencia: Marcelo T. de Alvear 2084 C1122AAF Buenos Aires, Argentina. Tel: Fax:

2 El Diagnóstico Genético Preimplantatorio, DGP (o PGD por sus siglas en inglés), es la opción diagnóstica más temprana para parejas con alto riesgo de descendencia afectada por enfermedades genéticas. Permite la prevención de desórdenes monogénicos y cromosómicos mediante el diagnóstico de anomalías en los embriones obtenidos por técnicas de fertilización asistida de alta complejidad como el ICSI. De este modo, se transfiere al útero materno sólo aquellos embriones que no presenten la enfermedad genética por la cual la pareja consultante se encuentra en situación de riesgo. Puede realizarse aún en parejas que no tienen un antecedente de riesgo y que desean conocer el status genético de los embriones a transferir obtenidos mediante un procedimiento de ICSI riesgo. Antecedentes históricos Ya en 1984, la OMS (Organización Mundial de la Salud) enfatizó la relevancia de desarrollar estrategias que permitieran desarrollar diagnósticos previos a la etapa de implantación embrionaria. El advenimiento de la técnica de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) en 1985 y el éxito de las técnicas de manipulación y biopsia embrionaria permitieron el desarrollo del Diagnóstico Genético de Preimplantación (DGP). Desde sus inicios en 1990, el DGP, ha expandido sus objetivos e indicaciones. Esta estrategia diagnóstica, fue inicialmente utilizada para la identificación de embriones de sexo femenino mediante técnicas de biología molecular en familias con antecedentes de desórdenes génicos ligados al X recesivo. El advenimiento del FISH (Fluorescent In Situ Hibridization) determinó que pudiera aplicarse para la resolución de múltiples diagnósticos en parejas con rearreglos cromosómicos complejos como translocaciones recíprocas balanceadas, translocaciones robertsonianas y también en portadores de mosaicismos cromosómicos. Recientemente, la evolución de esta tecnología ha permitido la incorporación del tamizaje o screening genético de Preimplantación (SGP). Dicha estrategia tiene como objetivo la identificacón de aneuploidías de los cromosomas más frecuentemente involucrados en abortos tempranos, y se aplica tanto en parejas con abortos recurrentes como en aquellas que presentan fallas repetidas de implantación en procedimientos de FIV-ICSI (Fertilización In Vitro- Inyección Intracitoplasmática de Esperma). Clasificación e indicaciones Diagnóstico Genético de Preimplantación de alto riesgo: es el que se realiza a pacientes que presentan alto riesgo para descendencia afectada por enfermedades genéticas, tanto desórdenes mono-oligogénicos, poligénicos y cromosómicos. Se indica cuando existen: Antecedentes familiares de enfermedades monogénicas Alto riesgo para enfermedades cromosómicas: Padres portadores de rearreglos estructurales balanceados Padres portadores de mosaicismos Padres con alta tasa de aneusomías espermáticas Hijos previos con anomalías cromosómicas. Diagnóstico Genético de Preimplantación de bajo riesgo (Screening): es el que se realiza para incrementar las posibilidades de lograr el embarazo en pacientes que presentan infertilidad o esterilidad. Se indica cuando existe: Edad materna avanzada (35 años o más). Fallas repetidas de implantación. Parejas con cariotipo normal que presenten en su historia reproductiva abortos recurrentes

3 Qué enfermedades pueden diagnosticarse? Anomalías cromosómicas - Anomalías numéricas: Constituyen las alteraciones genéticas más frecuentes de la población en general. Su incidencia se incrementa con el aumento de la edad materna. Las más frecuentes son: Síndrome de Down (Trisomía del cromosoma 21), Síndrome de Edwards (Trisomía del cromosoma 18), Síndrome de Patau (Trisomía del cromosoma 13). - Anomalías estructurales: Intercambio recíproco entre cromosomas (translocaciones), muy frecuentes en las parejas con abortos recurrentes; pérdida de material de un cromosoma (deleciones); ganancia de material de un cromosoma (duplicaciones o inserciones), inversión de un fragmento cromosómico (inversión). Enfermedades Monogénicas - Actualmente pueden diagnosticarse más de 90 enfermedades monogénicas como: Fibrosis quística Alpha y Beta Talasemia Hemofilia A yb Anemia de células falciformes Anemia de Fanconi Retinoblastoma Mutaciones del encogen P 53 Enfermedad de Huntington Tipificación de HLA Neurofibromatosis Acondroplasia Hidrocefalia ligada al X Epidermolisis bullosa Distrofia Miotónica Fenilcetonuria Retinitis Pigmentaria ESTRATEGIAS DE DGP Existen tres estadios en los que puede realizarse el procedimiento. Primer estadio Biopsia del corpúsculo polar del ovocito (antes de ser fertilizado). Una vez realizada la aspiración de ovocitos durante un procedimiento de ICSI, se extraen los cuerpos polares de los ovocitos y se realiza la evaluación genética de los mismos. Los resultados, que generalmente se obtienen durante el transcurso de menos de 24 horas, determinan cuáles son los ovocitos que se fertilizarán, es decir, aquellos que no portan enfermedades genéticas. Ovocito con 2 pronúcleos Segundo estadio Biopsia de blastómera. Cuando los embriones alcanzan el tercer día de desarrollo in vitro contando con cerca de ocho células, llamadas blastómeras, se extrae una de ellas de cada embrión y se realiza el diagnóstico genético para evaluar las contribuciones parentales. Finalmente, se transfieren al útero los embriones cuyo resultado indica que no portan enfermedades genéticas. Tercer estadio Biopsia de blastocisto. Esta técnica es similar a la biopsia de blastómera, pero en este caso se realiza extrayendo una pequeña porción de trofoectodermo (fragmento del embrión que dará origen a la placenta y membranas). Blastocisto

4 TÉCNICAS: FISH Y CGH Todas las células contienen información hereditaria codificada en moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN); esta información dirige la actividad de la célula y asegura la reproducción y el paso de los caracteres a la descendencia. Dentro del núcleo, las moléculas de ADN y proteínas están organizadas en cromosomas que aparecen dispuestos en pares idénticos. En el momento de la división de las células, el ADN se ultracompacta y permite que los cromosomas sean detectables como estructuras independientes. Habitualmente el diagnóstico de anomalías cromosómicas en blastómeras es llevado a cabo a través de la técnica de FISH -hibridación fluorescente in situ- que se basa en el principio de complementariedad de las bases del ADN y la capacidad de las cadenas del mismo para desnaturalizarse (separarse) y naturalizarse (unirse) en respuesta a distintos estímulos químicos. Para realizar esta técnica se utilizan pequeños fragmentos de ADN complementarios a las regiones cromosómicas que quieren estudiarse (a determinar en cada caso por el especialista en base a antecedentes o factores de riesgo) y que se han marcado con un colorante fluorescente. Estos fragmentos denominados sondas se adherirán y emitirán una señal fluorescente cuando encuentren su secuencia complementaria en la célula a estudiar. De esta manera puede determinarse la ausencia o presencia en exceso de un fragmento o región cromosómica específica y así diagnosticar la presencia de patologías en el embrión evaluado

5 Imágenes Técnica FISH Imagen correspondiente a FISH realizado en blastómera utilizando sonda centromérica para cromosoma X (FITC verde) y sonda centromérica para cromosoma 18 (Spectrum Orange). La técnica CGH -hibridización genómica comparada- consiste en comparar el ADN (Ácido desoxirribonucleico) genómico total de una célula a evaluar, con el contenido de ADN de un control normal. Este método permite la detección de desbalances cromosómicos tanto estructurales como numéricos. Con el CGH no se necesita definir a priori qué cromosomas se quieren evaluar, porque se evalúa la totalidad del ADN de la célula; mientras que en el FISH la evaluación es parcial, dado que se eligen ciertos cromosomas específicos a estudiar, los que se determinan de acuerdo a los antecedentes familiares o el diagnóstico realizado en la pareja. La técnica de CGH requiere de mayor tiempo de procesamiento lo cual determina que sólo se realice en casos específicos para diagnósticos embrionarios preimplantatorios. Imágenes Técnica CGH

6 CASUÍSTICA Y LOGROS La casuística de incluye 55 ciclos en tres años, realizando diagnóstico genético de preimplantación para la detección de anomalías cromosómicas. Los casos realizados incluyen la evaluación mediante la técnica de FISH (Fluorescent in situ hibridization) con 6 sondas para pacientes con alto riesgo para descendencia afectada por desórdenes cromosómicos y para abortadotas recurrentes o parejas con fallas recurrentes de implantación (SGP) y, además, la utilización de sondas específicas para pacientes con rearreglos cromosómicos complejos (PGD). Indicaciones: DGP vs SGP Indicaciones DGP Casuística DGP Las tasa de embarazo reportada es de un 36 %, contando a la fecha con 11 recién nacidos sanos y 6 embarazos en curso. La experiencia Halitus en DGP ha sido parcialmente reportada en Congresos Nacionales y Simposios Internacionales. Los desarrollos científico-tecnológicos derivados de la misma publicados en revistas de la especialidad (Genet Mol Res Jun 30; 4(2):143-51). CONCLUSIONES El Diagnóstico Genético de Preimplantación es la estrategia reproductiva de elección para parejas con alto riesgo de descendencia afectada por desórdenes genéticos, tanto cromosómicos como monogénicos. El Screening o Tamizaje Genético de Preimplantación es una herramienta no sólo diagnóstica sino también terapéutica para pacientes con abortos recurrentes o fallas repetidas de implantación en procedimientos de fertilización asistida. Perspectivas futuras La perspectiva más promisoria del Diagnóstico Genético de Preimplantación es la posibilidad de ser una herramienta terapéutica para salvar la vida de niños con enfermedades genéticas y hematológicas tales como la Anemia de Fanconi, Talasemias, Leucemias, Linfomas, etc., al permitir el nacimiento de un hermano sano HLA compatible. Los avances en las investigaciones con células madre, las cuales tienen la capacidad de diferenciarse en múltiples tejidos y posibilitar de este modo el reemplazo de células, tejidos u órganos afectados, podrían constituir un nuevo campo de desarrollo del DGP y tal vez una herramienta esperanzadora para el futuro de la genética y la biología molecular. REFERENCIAS 1. Cytogenetic analysis using cuantitative, high sensitivity, fluorescente hybridization. Proceedings of the National Academy of Science, USA 83: Pinkel, D.; T. Straume; J.W.Gray (1986). 2. Molecular Cytogenetics in metaphase and interphase cells for cancer and genetic research, diagnosis and prognosis.application in tissues sections and cell suspensions. Muhlmann M, Review, Genetics and Molecular Research 1 (2002) Preimplantation testing for chromosomal disorders improves reproductive outcome of poor-prognosis patients. Reprod Biomed Online Aug;11(2): Verlinsky Y, Tur- Kaspa I, Cieslak J, Bernal A, Morris R, Taranissi M, Kaplan B, Kuliev A. 4. Uses and limitations of two molecular cytogenetic techniques for the study of arrested embryos obtained through assisted reproduction technology. Genet Mol Res Jun 30;4(2): Muhlmann MC, Laudicina AO, Perandones C, Bertolino MV, Marazzi A, Quintans CJ, Donaldson M, Bozzo W, Pasqualini S. nota del editor. Las imágenes recibidas en el original de autor son a color

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