El desarrollo de técnicas moleculares de laboratorio nos ha permitido la detección y

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1 Ensayos de cuantificación de carga viral VIH-1. El desarrollo de técnicas moleculares de laboratorio nos ha permitido la detección y cuantificación de las moléculas de ARN de VIH-1 en sangre periférica y en otras muestras biológicas. La cantidad de ARN de VIH-1 presente en plasma, a la que denominamos carga viral, es un factor pronóstico de evolución a sida y muerte independiente de la cifra de linfocitos CD4 [1-3]. En un estudio promovido por los Centers for Disease Control (CDC), la cifra de CD4 era el principal factor de predicción del riesgo de desarrollar una infección oportunista, pero el riesgo relativo era de 1,6-3,5, en función de la carga viral, respecto a los pacientes que tenían menos de 400 copias/ml [3]. Entre los pacientes incluidos en la cohorte MACS, en estadios iniciales, la carga viral y las cifras de CD38 fueron factores de predicción más potentes de evolución a sida que los CD4; con posterioridad, los CD4 aumentaron su importancia como factor pronóstico [4]. La determinación de la carga viral de VIH-1 en plasma ha demostrado su utilidad como: factor de predicción del riesgo de progresión a SIDA o muerte; guía para el inicio del tratamiento antirretroviral, junto con el recuento de CD4 y la clínica; indicador principal de la eficacia del tratamiento antirretroviral; parámetro para la evaluación de la eficacia de nuevos fármacos antirretrovirales; medio útil para comparar la potencia relativa de diferentes tratamientos; sospecha de aparición de resistencias y posible indicación de cambio en la terapia; indicador intermedio de interacciones farmacológicas significativas; control de cumplimiento del tratamiento; evaluación del riesgo de transmisión, sobre todo materno-fetal;

2 detección del virus en neonatos y en primoinfección, aunque debe confirmarse posteriormente; mejor conocimiento de la cinética viral en diversos compartimientos del organismo; identificación de reservorios. Métodos de cuantificación de la carga viral Las pruebas comerciales están diseñadas para la cuantificación del ARN vírico en muestras de pasma. La mayoría están basadas en la detección del ADN complementario al ARN vírico (ADNc), que ha sido obtenido por un proceso de transcripción inversa de dicho ARN. El ADNc es inmediatamente amplificado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; Polymerase Chain Reaction ). El ácido nucleico amplificado se denomina amplicón. Las primeras pruebas comerciales como el test COBAS Amplicor HIV-1 Monitor (Roche Diagnostics) cuantificaban el ARN a partir del amplicón acumulado tras la reacción de PCR. Actualmente, este tipo de pruebas han sido sustituidas por otras como: COBAS TaqMan HIV-1 Test (Roche Molecular Systems), RealTime HIV type 1 (HIV-1) assay (Abbott Diagnostics), VERSANT HIV-1 RNA 1.0 kpcr Assay (Siemens Healthcare Diagnostics) y NucliSens Easy Q HIV-1 (BioMerieux Inc.), en las que la amplificación y cuantificación de los ácidos nucleicos (ADN o ARN) se realiza mediante la técnica de PCR a tiempo real, utilizando sistemas cada vez más automatizados que permiten la cuantificación más exacta y en menos tiempo sin necesidad de métodos laboriosos. La técnica de PCR a tiempo real cuantitativa permite amplificar y cuantificar simultáneamente el ADN o el ARN amplificado, ya que utiliza cadenas de oligonucleótidos marcados fluorescentemente que detectan y se unen al amplicón en cuanto aparece. Los oligonucleotidos que utilizan las pruebas comerciales VIH-1 suelen ser de dos tipos: las sondas tipo Taqman y los llamados molecular bacon. Las sondas tipo Taqman son oligonucleotidos que contienen dos moléculas fluorocromos

3 unidas a cada uno de sus extremos. La molécula de un extremo emite fluorescencia y la otra del otro extremo (el quencher ) absorbe la emisión de la anterior. Cuando la sonda se une al amplicón, la actividad exonucleasa de la polimerasa que interviene en la amplificación del ADNc elimina el quencher de la sonda y, en consecuencia, el fluorocromo emite una señal fluorescente que es detectada por un instrumento analizador. Los molecular bacon se caracterizan por ser oligonucleótidos de cadena simple con extremos complementarios capaces de unirse formando una horquilla. En los extremos de la horquilla se encuentran el fluorocromo y el quencher. Cuando la horquilla está cerrada el quencher absorbe fluorescencia emitida por el fluorocromo. En presencia del amplicón, la horquilla se abre para unirse al ADN o ARN amplificado y queda desbloqueada la emisión de fluorescencia, la cual es detectada por el instrumento analizador. El sistema empieza a detectar la señal de fluorescencia asociada al incremento exponencial del amplicón. Existe una relación cuantitativa entre la cantidad inicial de ácido nucleico y la cantidad de amplicón producido en un ciclo determinado. La utilización de estándares externos de concentración conocida permiten la preparación de curvas patrón en las que extrapolar el valor de la señal obtenido en cada muestra para poder calcular su concentración de carga viral (copias/ml o en unidades internacionales (IU, International units )). La mayoría de pruebas comerciales contienen, además, estándares internos que se colocan junto a cada muestra en el mismo tubo desde el inicio de la prueba y con las que se puede controlar las variaciones del análisis de tubo a tubo Otras pruebas comerciales de cuantificación de la carga viral han fundamentado la cuantificación del ARN vírico en la amplificación y detección de la señal emitida, en lugar de amplificar el ácido nucleico; como es el caso de Versant HIV-1 RNA 3.0 Assay (b-dna), aunque este tipo de técnicas terminará siendo sustituido por las pruebas basadas en la PCR a tiempo real. Actualmente, los laboratorios pueden disponer de las siguientes pruebas comerciales:

4 COBAS TaqMan HIV-1 Test (Roche Molecular Systems) RealTime HIV type 1 (HIV-1) assay (Abbott Diagnostics) VERSANT HIV-1 RNA 1.0 kpcr Assay (Siemens Healthcare Diagnostics) NucliSens Easy Q HIV-1 (BioMerieux Inc.) Versant HIV-1 RNA 3.0 Assay (b-dna, Siemens Healthcare Diagnostics). COBAS TaqMan HIV-1 Test (Roche Molecular Systems) La prueba COBAS TaqMan HIV-1 permite detección cuantitativa de ARN del VIH-1 en plasma de pacientes infectados, en un rango de copias/ml, mediante la detección de la amplificación de ADNc por PCR a tiempo real [5]. Este test ha sido validado para la cuantificación de los virus del grupo M (subtipos A-H) y los virus recombinados (CRF, Circulating Recombinant Form) de los tipos CRF01_AE. Esta prueba sustituye al anterior COBAS Amplicor assay. COBAS TaqMan HIV-1 está basada en tres procesos principales: (1) la preparación de las muestras para obtener el ARN del VIH-1, que puede realizarse de forma automatizada con el sistema COBAS AmpliPrep; (2) la transcripción reversa automática de una región del ARN del VIH-1 para generar ADNc; (3) la amplificación del ADNc, con iniciadores complementarios específicos ( primers ) que definen una secuencia altamente conservada del gen gag del VIH-1, y la detección del amplicón con sondas de tipo Taqman se realiza simultáneamente. Además, dispone de un estándar interno de cuantificación llamado QS que se coloca en la muestra en que se desea cuantificar la carga viral. El QS es ARN no infeccioso, con regiones de unión a iniciadores idénticas a las del ARN del VIH-1 y una región exclusiva de unión a sonda que permite distinguir el producto amplificado del QS del producto amplificado procedente del VIH-1. El analizador COBAS Taqman calcula la concentración del VIH-1 en las muestras de la prueba, comparando la señal procedente de la amplificación del VIH-1 con la señal del QS para cada muestra y control. El QS compensa los efectos de inhibición que

5 pudieran producirse y controla los procesos de preparación y amplificación para permitir la determinación cuantitativa exacta de ARN del VIH-1 en cada muestra. Actualmente se está evaluando un nueva versión de esta prueba desarrollada por Roche, se trata de la prueba COBAS TaqMan HIV-1 v 2.0. Esta versión se caracteriza por utilizar iniciadores que flanquean regiones del gen gag y del extremo altamente repetitivo (long terminal repeat, LTR). Esto le permite aumentar el rango de amplificación de copias/ml. Este ensayo demostrado una mejora en la sensibilidad respecto a la versión anterior, una aceptable precisión [6] RealTime HIV type 1 (HIV-1) assay (Abbott Diagnostics) RealTime HIV type 1 (HIV-1) assay es una prueba también automatizada que permite la cuantificación del ARN del VIH-1 en muestras de plasma de pacientes infectados, en un rango de 40 a copias/ml. Detecta y cuantifica la carga viral de un amplio grupo de virus, grupo M (subtipos A H), el grupo O y el grupo N [7]. La extracción de los ácidos nucleicos puede realizarse de forma automatizada con el instrumento m2000sp. Los iniciadores y las sondas van dirigidos a reconocer la integrasa, una región muy conservada del gen pol. La sonda que utiliza consiste en un fragmento de ADN de doble cadena con diferentes tamaños. El fragmento largo de la cadena es complementario a una región del ADNc objeto de amplificación y lleva unida una molécula fluorescente. El fragmento corto contiene la molécula de extición, el quencher. Cuando el ADNc está presente se produce la hibridación del ADNc con el fragmento largo de la sonda y se genera una señal que es detectada por el analizador m2000rt. VERSANT HIV-1 RNA 1.0 kpcr Assay (Siemens Healthcare Diagnostics) Se trata de un ensayo para la cuantificación del ARN de VIH-1 en muestras de plasma de pacientes infectados por VIH-1, en un rango de copias/ml y que ha sido validado para la cuantificación de los virus del grupo M (subtipos A-G), los virus

6 recombinados de los tipos AE y AG, y los virus del grupo O [8]. La extracción de los ácidos nucleicos ARN y ADN de las muestras de plasma se realiza mediante un sistema basado en bolas magnéticas en un proceso automatizado que permite analizar 96 muestras en 2 horas y 45 minutos (Hamilton STARlet instrument). Antes de iniciar la transcripción inversa del ARN vírico a ADNc se procede a la degradación del posible ADN contaminante presente en la muestra utilizando el enzima uracil N glycosylase. La transcripción inversa del ARN y la amplificación de una región muy conservada de la integrasa en gen pol del ADNc se realizan simultáneamente a partir del ARN del virus y de un estándar interno de cuantificación mediante el proceso de PCR a tiempo real, de forma automatizada (Agilent MX3005 Instrument). Las posibles mutaciones en el gen de la integrasa que pudieran contener los virus no afectarían a la detección y cuantificación de la carga viral [9,10]. NucliSens Easy Q HIV-1 (BioMerieux Inc., Boxtel, Netherlands) Esta prueba permite la cuantificación directa del ARN del VIH-1 a partir de muestras de plasma y de gotas de sangre seca recogidas en papel de filtro, en un rango de copias/ml, de todos los virus del grupo M (A, B, C, D, F, G, H, J) y los recombinantes CRF01_AE and CRF02_AG [11]. La extracción de los ácidos nucleicos (ARN y ADN) se efectúa mediante un sistema de bolas sílica que puede hacerse automatizadamente con el instrumento NucliSENS easymag. Esta prueba, a diferencia de las pruebas comerciales anteriormente descritas, amplifica y cuantifica a tiempo real el ARN amplificado a partir del ARN vírico y sustituye a la prueba comercial de primera generación Nuclisens HIV-1 QT. La amplificación del ARN la efectúa gracias a un sistema de amplificación isotérmica diseñado por NASBA [12]. Esta prueba utiliza horquillas marcadas o molecular bacons, en lugar de sondas, para detectar el amplicón. En uno de los extremos de la horquilla contiene el fluorocromo carboxyfluoresceine (FAM) y se une específicamente al ARN del VIH-1; el del otro extremo contiene la molécula carboxy-x-rhodamine (ROX) y se une al estándar de cuantificación o calibrador. La fluorescencia producida se monitoriza mediante un

7 sistema automatizado (NucliSens EasyQ Analyzer). La técnica de realiza en un tubo cerrado, lo cual disminuye el riesgo de contaminación de la prueba. El tiempo necesario es inferior a dos horas. Varios estudios han evidenciado una buena correlación con la cuantificación mediante otros métodos de detección [13,14].. Versant HIV-1 RNA 3.0 bdna base-assay (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Tarrytown, NY) Esta prueba permite la cuantificación del ARN viral en muestras de plasma de pacientes infectados, en un rango de 75 a copias/ml de virus del grupo M (A- G). Cuantifica directamente el ARN vírico sin la necesidad de realizar una amplificación del ADNc, ya que se basa el la amplificación de la señal de detección [15]. Para ello, después de efectuar la extracción de los ácidos nucleicos de las muestras de plasma de los pacientes infectados por el VIH-1, el material se traslada a placas que contienen un conjunto sondas de captura especiales para unirse ARN vírico. Este conjunto de sondas de captura (> 80) están formadas por oligonucleótidos sintéticos específicos que reconocen una amplia región del gen pol del VIH-1. Para conseguir una óptima hibridación entre las sondas de captura y el ARN vírico se requiere un periodo de incubación largo (overnight). Un segundo tipo de sondas, las sondas diana, se hibridan al ARN viral y a las sondas del amplificador. Un tercer tipo de sondas, las sondas del amplificador, se hibridan con el preamplificador, formando complejos de ADN ramificado. Finalmente, se añaden un cuarto tipo de sondas marcadas con fosfatasa alcalina y se incuban en un sustrato quimioluminiscente. La cantidad de señal detectada por el analizador es proporcional a la cantidad de virus en la muestra. La concentración de virus se establece a partir de una curva patrón definida por la emisión de luz de la muestra, comparándola con la emisión que producen las muestras estándares de concentraciones conocidas de virus. La inclusión de más de 80 sondas de ácidos nucleicos que reconocen a varias zonas del gen pol permite la cuantificación de subtipos no B dentro del grupo M.

8 En la Tabla 1 se resumen las características más importantes de los ensayos de cuantificación de la carga viral que están comercializados en la actualidad. Tabla 1. Características de los ensayos comerciales. COBAS TaqMan HIV-1 Test (Roche) RealTime HIV type 1 (HIV-1) assay (Abbott ) VERSANT HIV-1 RNA 1.0 kpcr Assay (Siemens ) NucliSens Easy Q HIV-1 (BioMerieux ) Versant HIV-1 RNA 3.0 Assay (b-dna). (Siemens ) Abreviación CAP/CTM HIV-1 RealTime HIV kpcr NucliSens EQ b-dna Plasma Plasma Plasma, sangre Tipo de muestra Plasma (citrato y Plasma (citrato y (citrato y seca en filtro y (anticoagulante) EDTA) (citrato y EDTA) EDTA) EDTA) tejidos Volumen de muestra , (ml) Método de extracción (Instrumento) Método amplificación (Instrumento) Regíon del genoma del VIH-1 amplificada Sondas Rango de linearidad (copias/ml) Subtipos detectados Número de muestras procesables simultáneamente Duración completa del proceso (horas) Automática (COBAS AmpliPrep) RNA RT-PCR Tiemporeal (COBASTaqman) Automática (m2000sp) RNA RT-PCR Tempo-real (m2000rt) Automática (Hamilton STARlet) ARN y ADN kpcr (Agilent X3005) Automática (Easy Mac) ARN y ADN PCR isotérmica NASBA Tempo-real (NucliSSENS) No extracción y purificación de ácidos nucleicos Amplificación de la señal bdna (Versant 340 y Versant 440 molecular systems) gag Pol-integrasa Pol gag pol Sonda Taqman Grupo M (A-H), CRF01_AE Sondas de doble cadena truncadas Grupo M (A-D, F-H), CRF01_AE y CRF02_AG, ; Grupo O y Grupo N Sonda Taqman Grupo M (A-D, F-H, K), CRF01_AE y CRF02_AG, CRF06_cpx; Grupo O Horquillas molecular bacon Grupo M (A-D, F-H, J) bdna Grupo M (A-D, F-G) Los estudios comparativos realizados entre las diferentes pruebas comercializadas de cuantificación muestran un alto grado de acuerdo. Las mayores discrepancias se suelen observar en los niveles bajos de carga viral y en la detección de virus del subtipo No-B [9,10,13,14,16]. Debido a la variabilidad biológica en un mismo sujeto a lo largo de la enfermedad y a la relacionada con la propia técnica, las variaciones de la carga viral superiores a 0,5 log 10 se consideran clínicamente significativas.

9 La diversidad genética del VIH-1 representa un desafío para el desarrollo de pruebas capaces de detectar y cuantificar de manera fidedigna a todas las variantes del virus. En Europa y Norteamérica, la mayoría de los pacientes están infectados por el subtipo B. En otras partes del mundo, las infecciones por subtipos no B del grupo M son más frecuentes e incluso mayoritarias. En España, entre los años 2000 y 2009, se ha observado un incremento de la prevalencia de los subtipos no-b y de virus recombinados (CRF) del grupo M [17,18]. Las infecciones por los grupos O y N son excepcionales. Las pruebas comerciales de cuantificación de la carga viral están diseñadas para la detección de VIH-1 del subtipo B, pero también pueden detectar otros subtipos e incluso formas recombinantes del grupo M aunque con menor eficacia. Algunos estudios comparativos han analizado el grado de acuerdo de las distintas pruebas comerciales para detectar y cuantificar la carga viral en muestras de pacientes infectados con subtipos no-b del VIH-1. Las mayores discrepancias se observaron en las muestras portadoras del subtipo G o de la forma recombinante CFR02-AG. En los casos en que eran detectados observaron discrepancias de > 1 log 10 y de > 0,5 Log 10, cuando las pruebas eran comparadas dos a dos [16,19]. Como alternativa a las pruebas comerciales anteriormente descritas se ha evaluado dos nuevas pruebas comerciales de bajo coste: el test ExavirLoad v2 (Cavidi) y el test Generic HIV viral load (Biocentric). ExavirLoad v2 mide la actividad del enzima de transcripción inversa del VIH-1 en la conversión del ARN a ADNc a partir de muestras de plasma y la compara con una curva patrón. Generic HIV viral load (Biocentric) está basada en la técnica de PCR a tiempo real que amplifica una región conservada de los extremos altamente repetitivo (LTR) del VIH-1. Ambas pruebas presentaron una buena correlación con COBAS Amplicor assay, aunque con ExavirLoad v2 se obtuvieron más resultados falsos positivos y algunas limitaciones en la detección de subtipos que con Generic HIV viral load [20]

10 Cuantificación de la carga viral en muestras biológicas diferentes al plasma La cuantificación de la carga viral suele realizarse en muestras de plasma, pero la sangre no es el único compartimento anatómico donde se puede detectar el VIH-1. El virus replica en el interior de las células y puede llegar a otros compartimentos a través de la sangre formando reservorios de células infectadas con el virus en estado de latencia o con replicación persistente, que en muchas ocasiones evolucionan de manera distinta a los virus circulantes en sangre [21,22]. Las técnicas de biología molecular han permitido la detección del VIH-1 en muestras procedentes de diferentes lugares anatómicos como el semen, lavado vaginal, frotis, tejido linfoide y líquido cefaloraquídeo; [23]. La cuantificación de la carga viral en este tipo de muestras no es muy frecuente y requiere la utilización de métodos caseros y la modificación de las pruebas comercializadas. La carga viral en estos compartimentos de puede ser un marcador subrogado de la infecciosidad en la transmisión sexual y en la transmisión materno-fetal, y de la eficacia del tratamiento antirretroviral. Detección en fluidos genitales Algunos estudios han demostrado que los niveles de la carga viral en el plasma están correlacionados con los niveles de carga viral en el semen [24]. El semen es uno de los principales vehículos de transmisión del VIH-1 y es frecuente determinación de la carga viral en semen durante la reproducción asistida parejas serodiscordantes. Su análisis requiere la preparación previa de la muestra, ya que el virus puede detectarse en el plasma seminal y en las células no-espermatozoides, y la adaptación de la prueba comercial. La mayor parte de estudios se han realizadoadaptando las pruenas de primera generación COBAS Amplicor assay y NASBA HIV-QT [25]. Este tipo de muestras contienen sustancias inhibidoras que dificultan la detección del VIH-1 cuando se encuentran en concentraciones muy bajas y puede dar lugar a falsos negativos. Se ha observado que la extracción de los ácidos nucleicos mediante los métodos basados en la sílica incrementa la sensibilidad de las pruebas comerciales [26].

11 En el aparato genital femenino se han observado diferencias significativas en la carga viral en diferentes fases del ciclo menstrual. Se produce una disminución significativa en la fase periovulatoria y un incremento por encima de las concentraciones plasmáticas en los períodos premenstrual y menstrual, sin que se acompañe de cambios en la viremia plasmática [27,28]. También se observa una correlación entre la cuantificación viral en las secreciones vaginales y de cuello uterino. Se ha descrito una cuantificación aceptable mediante b-adn de muestras obtenidas a partir de tampones, con cifras de carga viral similares a las registradas en el lavado cervicovaginal [29,30]. Detección y valoración en tejido linfoide La cuantificación de la carga viral en ganglios linfáticos en pacientes que reciben tratamiento antirretroviral de tipo TARGA ha permitido observar una disminución significativa de la carga viral tanto en plasma como en células mononucleares de ganglio linfático; sin embargo, en este último caso es más lenta y se produce una menor disminución tras unas pocas semanas de tratamiento [31]. La replicación viral puede persistir incluso a niveles elevados en el tejido linfático, a pesar de mantener una carga viral indetectable en plasma [32,33]. En todo caso, una terapia subóptima no consigue disminuir la carga viral a cifras indetectables en el tejido linfático [34]. El tejido linfoide asociado a intestino (GALT, gut-associated lymphoid tissue ) está muy implicado en la patogénesis del VIH-1. A diferencia del tejido linfoide de otros compartimentos anatómicos, el GALT se encuentra de una de entrada del virus en las etapas iniciales de la infección y en él reside gran número de linfocitos T-CD4 memoria fuente de replicación del VIH-1, y lo convierte en un gran reservorio de virus. La infección masiva del GALT conduce a la disfunción de la mucosa favoreciendo la translocación bacteriana, a cual a su vez contribuye a la activación generalizada de la respuesta inmune sistémica y a la progresión de la enfermedad. Algunos estudios han demostrado que la supresión de la carga viral en GALT suele ser más lenta que en sangre periférica y que no llega a ser completa, lo cual contribuye a la falta de

12 recuperación de la población de células T-CD4 en este tejido. El inicio del tratamiento antirretroviral en las fases tempranas de la infección puede tener un efecto más rápido y duradero en la supresión de la replicación viral en GALT que el inicio del tratamiento durante la infección crónica y contribuir en la restauración de la población de células T- CD4 [35]. La determinación de la carga viral en este tipo de muestras es complicada porque requiere la realización de una biopsia y porque requiere la modificación de las pruebas comerciales o caseras. Recientemente se ha publicado que la detección de ARN/ADN de VIH-1 y de ARN mensajero de células TCD4 en muestras de heces de pacientes VIH-1 en la fase crónica de la infección es posible, sugiriendo que este tipo de muestras podría ser útil para el estudio de la pérdida de células T-CD4 del GALT asociada a la patogéneis del VIH-1 [36]. Detección y valoración líquido cefalorraquideo La infección del sistema nervioso central por VIH-1 se produce desde las etapas iniciales de la infección del paciente. La carga viral en el líquido cefalorraquideo (LCR) esta correlacionada la disfunciones neurocognivas y a la demencia por SIDA [37,38]. Cuantificación de la carga Pro-viral de VIH-1 Tras la infección, el VIH-1 inicia ciclo vital con la transcripción inversa del ARNv a ADN en el citoplasma formando un complejo de pre-integración (CPI) poco estable. En el núcleo el CPI se integra en el ADN de la célula huésped de forma estable dando lugar al provirus. La cuantificación del ADN proviral puede ser útil como medida del reservorio celular del virus, como marcador de eficacia de la terapia antirretroviral, del diagnostico precoz de la primoinfección en adultos y en hijos nacidos de madres seropositivas, y como marcador predictivo de la progresión de la enfermedad [39-42].

13 El ADN vírico puede encontrarse de diferentes formas en el interior de la célula; como cadena de ADN simple, de cadena doble lineal, de cadena doble circular o de cadena doble integrado en el núcleo. Algunos estudios defienden que las formas circulares son poco estables e indicativas de infección reciente; otros estudios, si embargo, sugieren que estas formas no son tan inestables y que su número se diluye a medida que la célula se divide [43,44]. Se han desarrollado diferentes métodos para la cuantificación del ADN viral (recientemente revisado por Beloukas A y cols [45]). Algunos de estos métodos están basados en PCR a tiempo real caseros que amplifican una región entre los 2LTR, o regiones entre el LTR y el gen celular alu, otros se basan en modificaciones de pruebas comerciales de primera generación como COBAS amplicor [41,46-48]. En cualquier caso suelen referir las copias de ADN viral a la concentración de DNA total (microgramos de DNA) o al número de células (10 6 T-CD4+ o 10 6 PBMCs Periferal Blood Mononuclear Cells ). El rango de copias de ADN proviral en muestras clínicas obtenido en diferentes estudios empleando diferentes métodos suele estar entre 2 log 10 y 3,5 log 10, según el método empleado [45]. Bibliografía 1. Mellors, J.W., Rinaldo, C.R. Jr, Gupta, P. y cols. Prognosis in HIV-1 infection predicted by the quantity of virus in plasma. Science 1996; 272: Vlahov, D., Graham, N., Hoover, D. y cols. Prognostic indicators for AIDS and infectious disease death in HIV-infected injection drug users: Plasma viral load and CD4+ cell count. JAMA 1998; 279: Kaplan, J.E., Hanson, D.L., Jones, J.L., Dworkin, M.S. Viral load as an independent risk factor for opportunistic infections in HIV-infected adults and adolescents. AIDS 2001; 15: Giorgi, J.V., Lyles, R.H., Matud, J.L. y cols. Predictive value of immunologic and virologic markers after long or short duration of HIV infection. J Acquir Immune Defic Syndr 2002; 29:

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