PCR en tiempo real Como seleccionar pruebas Moleculares de VPV y ETS. Dr. José de J. Curiel Valdés Anatomopatólogo Colposcopista Patólogo Clínico

Transcripción

1 PCR en tiempo real Como seleccionar pruebas Moleculares de VPV y ETS Dr. José de J. Curiel Valdés Anatomopatólogo Colposcopista Patólogo Clínico

2 Evolución en la detección del Cáncer de Cérvix Meisels and Fortin 1976 Purola and Savia 1977 Coilocito / Efecto citopatico HPV Dürst et al Revisión de las pautas de screening VHP 99,7% Cánceres de Cérvix 1 LBC: Citología líquida ThinPrep SurePath P16 CINTec Cervatec p16 ELISA L1Ag Cytoactiv ONCOTEC mrna E6/E7 Screening 1º basado en DNA HPV 1949 Test de Papanicolau Prevención Secundaria Prog. Base Poblacional Finlandia PCR Walboomers et al., Journal of Pathology 189:12-19,1999 ( Modificado ) 1990s LBC HC-2 / H Ventana Amplicor* Roche DNA Invader* WD 2000s PREVENCION PRIMARIA ESCENARIO POSTVACUNAL

3 Cómo se si lo tengo? Cómo se diagnostica? 1.- Estudio de Papanicolaou citología cervical. FORMA TRADICIONAL 2.- Colposcopía 3.- Biopsia Estándar de 4.- Pruebas moleculares FORMA MODERNA MAS SEGURA BASE LIQUIDA

4 Cómo se si lo tengo? Cómo se diagnostica? 1.- Estudio de Papanicolaou citología cervical. 2.- Colposcopía 3.- Biopsia Estándar de Oro (?) 4.- Pruebas moleculares NORMAL VIRUS

5 Citología Es el método de detección recomendado Se considera en NIC 1 poco sensible y específica. Solo es positiva por definición si existe una fase productiva. NIC 2 y 3 es mas sensible y específica. En base líquida sube la sensibilidad y especificidad. Es estándar para medir esta sensibilidad y especificidad ha sido la biopsia.

6 Colposcopía Indicada cuando existe una citología anormal Usada de rutina y en personas de 20 a 30 años es causa de sobre diagnóstico Imágenes en mosaico de diversos tipos, relieves, patrón de vasos etc. Algunos muy característicos. Siempre requiere de biopsia que lo corrobore.

7 ALGUNAS IMÁGENES COLPOSCÓPICAS Y SU CORRELACIÓN HISTOLÓGICA Aceto Blanco Liso Mosaico Punteado Leucoplasia Fino Metaplasia Madura Metaplasia Inmadura Rara vez NIC Denso NIC Alto Grado Fino Metaplasia Madura con paraqueratosis Grueso NIC Alto Grado a Carcinoma Invasor Fino NIC I Grueso NIC II y III Metaplasia queratinizante Siempre ver que hay por debajo

8 1.- Estudio de Cómo se si lo tengo? Cómo se diagnostica? 2.- Colposcopía VIRUS 3.- Biopsia Estándar de Oro (?) 4.- Pruebas mol NORMAL

9 Espectros molecular y visible para diagnóstico de VPH

10 A quienes seleccionar 80-90% < 25 años ~20 % > 30 años 40-50% < 25 años ~20 % 30 años <10 % > 30 años UNIVERSO POSIBLE A ESTUDIAR

11 A quienes seleccionar PCR Y CH II P16 UNIVERSO CON ENFERMEDAD GRAVE NUESTRO OBJETIVO A ENCONTRAR

12 Debemos situar de manera segura a nuestra paciente en este esquema antes de cualquier tratamiento HS METAPLASIAS PORTADOR J.J.C.V.

13 META DETECTAR LAS INFECCIONES PERSISTENTES PREDOMINATEMENTE POR VIRUS DE ALTO RIESGO DEFINICIÓN DE ALTO RIESGO POR BIOLOGÍA MOLECULAR Y DATOS EPIDEMIOLÓGICOS. CASOS CON Dx HISTOLÓGICO DE CÁNCER Y NIC

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15 METODOS MOLECULARES PCR CH2 OTROS Inmunohistoquímica: P16 L 1 DE Cápsula otros

16 DEFINICION DE RIESGO Bajo: Pocas posibilidades, pero existentes de producir cáncer Alto: Mayores posibilidades de producir cáncer No es una definición absoluta.

17 INFECCION POR VPH DOS MODALIDADES TRES ETAPAS PRODUCTIVA: L1 Y L2 TRANSFORMANTE: E6 (P53) Y E7 (grb) (ONCOGÉNICA) AMBAS EN TRES ETAPAS CLÍNICAS PORTADOR SANO INFECCIÓN SUBCLÍNICA INFECCIÓN CLÍNICA

18 Donde está el Patólogo Clínico en el diagnóstico del VPH Detección Como riesgo Enfermedad Diagnóstico y Capacidad de progresión Patólogo Clínico? Clínico Ginecólogo Colposcopista Colposcopía y Toma de muestras Anatomopatólogo Citopatólogo Interpretación y diagnóstico Estudio citológico Colposcopía Biopsia Sensibilidad mediana Especificidad alta Sensibilidad alta Especificidad baja Sensibilidad alta Especificidad mediana a alta

19 Para que se usan las pruebas DETECCION: Presencia de VPH como método primario de tamizaje antes de citología CONFIRMACION DE DX SEGUIMIENTO DESPUÉS DE TRATAMIENTO CURIOSIDAD (POSITIVO EN LA PAREJA) USO EN HOMBRES (?) EN TEJIDOS FRESCO Y PARAFINA Involucrados: Biólogos moleculares Anatomopatólogos Patólogos Clínicos, Químicos

20 Detección Estudio epidemiológico Factor de riesgo Seleccionar a quien realizar estudio citológico Preferentemente en mujeres de mas de 30 años

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23 EVOLUCIÓN DE VIRUS PRESENTE A VIRUS TRANSFORMANTE

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26 Quién fue primero mujer u hombre? La enfermedad es tan antigua como la humanidad PERO se detectó apenas desde 1980 como infección En 1983 se le ligó como productor de Cáncer C.U. De ahí nació su importancia

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29 HPV Prevalence and Cervical Cancer Incidence by Age HPV Prevalence (%) HPV (HC2) Cancer Cancer incidence per 100,000 Age (Years) 1. Sellors JW, et al. CMAJ, 2000;163:503. Ries, et al SEER Cancer Stats NCI, Sellors JW, et al. CMAJ, 2002;167:871.

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34 VIRUS FASE PRODUCTIVA (vegetativa o episomal) El virus es diagnosticable morfológicamente cuando tiene una fase proliferativa es decir un gran número de copias. Es cuando cambia la morfología celular, el núcleo crece y se lobula y es visible = Coilocitosis Existen estadios intermedios en donde hay virus con menos copias con cambios morfológicos inciertos Coilocitosis Abortiva!.

35 Infección productiva HPV

36 Cómo se transforma una infección HPV en un carcinoma? Integración del ADN viral en el ADN huésped ADN episomal del VPH L1 L2 LCR + E5 E6 E4 E7 E2 E1 Punto de rotura e integración ADN huésped ADN del VPH integrado AND huésped E2 E4 E5 L2 L1 Adaptado de 1. Phelps y Alexander. Ann Intern Med. 1995;123: Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; págs LCR E6 E7 E1 E2

37 La integración aumenta el riesgo de cáncer - I Forma del VPH en la célula Efecto Expresión del gen E6 controlada por E2 Episomal Después de la integración E6 PA p53 Asociación de E6 con p53 y PA La expresión de E6 deja de estar controlada Bloqueo de la actividad de p53 Resistencia a la apoptosis Aumento de la inestabilidad cromosómica Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; págs

38 La integración aumenta el riesgo de cáncer - II Forma del VPH en la célula Efecto Expresión del gen E7 controlada por E2 Episomal Después de la integración E7 Libre + prb E2F La expresión de E7 deja de estar controlada Generación de múltiples cromosomas Inmortalización celular Oncogénesis Syrjänen y Syrjänen. Papillomavirus infections in human pathology. Wiley & Sons, Chichester; págs

39 PCR de punto final Replicación, y electroforesis con comparación de un codigo de barras contra controles ya establecidos. No es absoluta la comparación, similitud de un % decreciente 95 % virus de alto riesgo 89 % virus de bajo riesgo 70 Virus de alto riesgo.

40 PCR de punto final El patrón y traducción para catalogar los virus en alto y bajo riesgo fue por aislamiento de VPH en casos de carcinoma y displasias y así saber si fueron o no oncogénicos. De nuevo el estándar fue la biopsia. Es decir PCR es una evidencia indirecta de la capacidad oncogénica y por lo tanto no es absoluta por si sola.

41 PCR de punto final Indicaciones de uso Como un método de Dx epidemiológico. Detecta desde portadores y enfermedad transitoria hasta enfermos No distingue fase productiva o transformante Selecciona a quienes vigilar de los 30 años en adelante.

42 Método de captura de híbridos (HC2) DESNATURALIZACIÓN HIBRIDACIÓN CON SONDAS ARN DE ALTO Y BAJO RIESGO CAPTURA DEL HÍBRIDO ADN/ARN MEDIANTE ANTICUERPOS ANTI-ADN/ARN FIJACIÓN AL HÍBRIDO DE ANTICUERPOS ANTI- ADN/ARN MARCADOS CON FOSFATASA ALCALINA DETECCIÓN DE LA ENZIMA FIJADA MEDIANTE SUSTRATO QUIMIOLUMINISCENTE

43 Detección del VPH mediante amplificación de la señal. Tecnología de captura de híbridos (HC2) Hibridación ADN/ARN. Cóctel de sondas: - Alto riesgo: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y Bajo riesgo: 6, 11, 42, 43 y 44. Sensibilidad adecuada a procesos de tamizaje de VPH (1 pg/ml). Aprobado por la FDA. Posibilidad de semicuantificar. Estandarizada y automatizable. (Poljak et al. J Clin Virol 2002; 25: S89-97.)

44 Detección del VPH mediante amplificación de la señal. Tecnología de captura de híbridos (HC2) LIMITACIONES: Prueba dependiente del estado de conservación del DNA viral La semicuantificación de la Carga Viral No distingue los diferentes tipos virales No detecta infecciones múltiples Se dan reacciones cruzadas entre las sondas de alto riesgo y ciertos tipos virales de bajo riesgo. La mayoría de las muestras discordantes HCII+ están relacionadas con un valor bajo de RLU y reactividad cruzada con genotipos de bajo riesgo

45 CAPTURA DE HIBRIDOS TRADUCCION CLINICA Al ser menos sensible a través de estudio se ha comprobado que detecta a los mas capaces de inducir neoplasia. Factor pronóstico de progresión. Aprobado por FDA.

46 CAPTURA DE HIBRIDOS TRADUCCION CLINICA Una prueba negativa de CH2 no significa que no se tenga virus El método ha sido estandarizado de manera que las unidades relativas de luz detectadas se compararon con la evolución a Ca Cu Se requiere un número relativamente elevado de copias para que sea oncogénico Por ello es que se requiere realizar la prueba cada 3 años

47 CAPTURA DE HIBRIDOS TRADUCCION CLINICA Toda mujer debería después de los 30 años realizarse cuando menos una vez la prueba Una mujer de mas de 60 años sin vida sexual y con CH2 podría hacerse su estudio dos veces mas cada 3 años y suspender estudios. Si hay Actividad sexual debe continuar con Citología cada 2 o 3 años de acuerdo al grado de riesgo

48 PRC en tiempo real El mismo método para subir la temperatura y desdoblar la cadena de DNA Ciclos con temperatura controlada con sustratos que emiten luz Medida a diferentes temperatura y diferentes colores para los tipos específicos de virus El proceso dura unas horas y se realiza en una termociclador programado que lee EN TIEMPO INMEDIATO (REAL) la progresión de la replicación viral.

49 PRC en tiempo real Ventajas sobre PCR de punto final Detección segura del tipo viral: la lectura de la electroforesis es dependiente de la calidad de la electroforesis, en PCR TR esta dada por la temperatura de unión y el color en cada ciclo Detección de enfermedades mixtas (varios tipos virales) La PCR de punto final el tipo que predomina inhibe a los otros y no se detectan. Tiempo de proceso: el mismo día (se requieren cuando menos 16 muestras por corrida) PCR tradicional mínimo 10 días Costo: es semejante

50 CH2 y PCR tiempo real FUTURO Método de tamizaje Es mas senisble que el estudio citológico (pero es mas caro) Si se realiza de manera simultánea obliga a revisar la citología de manera mas minuciosa, evita falsos negativos sobre todo el LAG Detecta mas mujeres en riesgo sin enfermedad (CCV detecta solo las que tienen enfermedad)

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53 En ASC US o H en México Es preferible hacer colposcopía y tomar biopsia. La psoitividad de PCR, CH2 no indica necesariamente enfermedad, puede ser metaplasia atípica o inmadura. En EU la colposcopía y la biopsia son mucho mas caras que una prueba de PCR o CH2. Si sale positiva en EU ya se manda a Colposcopía y biopsia.

54 CH2: 3.28

55 CH2 7.19

56 Recomendaciones de la sociedad Española de ETS

57 Metodologías Cultivo celular Cultivos con inmunoquímica Frotis con anticuerpos monoclonales PCR

58 Cultivos: Falso positivos y negativos, depende del estado de conservación de la muestra y el tiempo de la toma a el inicio del proceso en el laboratorio.

59 Publicación del Hospital Universitario de Monterrey NL Las muestras con sangrado fueron positivas en el 50 %, cuando el población fue solo el 29%, La mustra se toma de endocérvix y sangra fácilmente.

60 Uso en ETS La metodología tradicional de Chlamydia y las variedades de Mycoplasma- Ureaplasma (4 variedades) es muy errática, hay falsos negativos y positivos Depende de la toma y conservación de la muestra. Es método de crecimiento del germen. Es intracelular, por lo mismo está generalmente en el endocérvix

61 PCR en TR La muestra es fijada en el mismo medio de CBL La replicación de DNA es 100% específica de cada organismo Es mas sensible que los métodos microbiológicos convencionales. No da sensibilidad a antibióticos

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63 Conclusión PCR RT es una metodología que se está usando en forma alterna y asm segura que CH2 y PCR de punto final 1.- Detecta infecciones múltiples 2.- El tipo viral detectados en el mas real 3.- Mismo costo 4.- Menos tiempo de proceso 5.- En ETS es mas segura y con un costo similar a los dos cultivos.