11 kn. de publicación: ES kint. Cl. 6 : C12N 7/00

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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 kn. de publicación: ES kint. Cl. 6 : C12N 7/00 A61K 39/12 G01N 33/69 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 knúmero de solicitud europea: k Fecha de presentación : k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Nuevo virus de la enfermedad de la bolsa infecciosa. k Prioridad: US k 73 Titular/es: The University of Maryland at College Park 4312 Knox Road College Park, Maryland 742, US k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Snyder, David k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Polo Flores, Carlos ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 1 ES T3 2 DESCRIPCION Nuevo virus de la enfermedad de la bolsa infecciosa. Campo técnico Esta invención está relacionada con la industria avícola y, en particular, con la enfermedad de bolsa infecciosa, un conocido azote en esta industria. Específicamente, se identifica un virus nuevo y se describen los procedimientos de utilización de este virus y la información asociada con él. Antecedentes de la invención La enfermedad de la bolsa infecciosa (EBI) ha sido identificada previamente como una pérdida económica significativa en la industria avícola. Esta enfermedad, que azota principalmente a la industria del pollo, está causada por virus de campo virulentos que causan un estado patológico altamente contagioso e inmunosupresor. Esta enfermedad, por supuesto, exacerba otras infecciones en la población de pollos. La enfermedad resalta por su impacto en pollos jóvenes, y se caracteriza por lesiones en los folículos linfoides de la bolsa de Fabricio. En el documento US-A-4,824,668, se explica que un virus atenuado de la enfermedad de la bolsa infecciosa puede prepararse a partir de la cepa virulenta 84 variante E y puede ser utilizado para preparar una vacuna. En la Patente de E.E.U.U. US-A , el inventor comunicó laidentificación de un nuevo virus no neutralizado por una vacuna disponible y no neutralizado por anticuerpos previamente desarrollados como sensibles al mismo, y capaces de neutralizar todos los virus conocidos identificados como inductores de la EBI. El documento US-A describe el depósito, bajo las Condiciones del Tratado de Budapest, de dos virus, en el Instituto Pasteur, bajo los números de acceso i-792 e i-793. Este virus, referido a partir de ahora como GLS, se detectó por el uso de anticuerpos monoclonales, particularmente aquéllos identificados como R63 y B69, expresados por líneas celulares hibridomales depositadas bajo ATCC HB-9437 y HB Estos Acm, identificados como anticuerpos monoclonales neutralizadores, comprenden una vacuna pasiva contra cepas conocidas de virus que inducen la EBI y actúancomounmedio para la detección de la presencia del virus GLS, ya que la unión positiva por un anticuerpo no neutralizador, como el B29, junto con una reacción negativa para el R63 y B69, es prueba de la presencia de VEBI GLS. Así, la historia reciente en la industria avícola, particularmente aquéllaalolargodelacostaeste de los Estados Unidos, refleja un número progresivamente mayor de informes de brotes de la enfermedad de bolsa infecciosa, que no son totalmente prevenidos por ninguna de las vacunas conocidas, incluyendo aquéllas preparadas a partir de los anticuerpos monoclonales antes comentados. Debido a la severa presión económica existente en la industria avícola por estos brotes incontrolados, se ha emprendido un grado significativo de investigación de la causa de los brotes, y la razón por la que fracasan las vacunas conocidas en la prevención de dichos brotes. No se ha detectado ningún error en la preparación de las vacunas, o en su administración. Sin embargo, siguen ocurriendo brotes desenfrenadamente. Este brote continuo se trata, en parte, por una vacuna desarrollada utilizando el virus consignado en el documento U.S.-A Esta vacuna (vacuna GLS), siendo actualmente introducida comercialmente con éxito, sola o junto con otras vacunas más convencionales, proporciona protección contra las formas dominantes de las infecciones del VEBI. Nuevas investigaciones utilizando anticuerpos monoclonales específicos para 3 categorías generales del VEBI, ha proporcionado una mayor comprensión del VEBI. Explicamos el desarrollo de Acm neutralizadores como el 179 y 8, disponibles en el ATCC bajo los números de depósito HB18, HB-174, y neutralizadores de todos los VEBI previamente conocidos, y 7, número de depósito ATCC HB- 16, neutralizador y específico de la cepa y variantes de GLS. Recientemente la investigación ha identificado aún un VEBI nuevo en el campo, no controlado por la vacuna GLS. El anticuerpo monoclonal 179 ni siquiera reacciona in vitro. Así, aún hay un virus VEBI nuevo en el campo, contra el que no existe una vacuna activa actual, y contra el que no se ha proporcionado todavía ninguna vacuna pasiva. Este nuevo virus, aparentemente una variante del GLS y una mutación del mismo, dada la unión in vitro del Acm 7, está actualmente incontrolado. La protección para la industria avícola contra este nuevo VEBI es por tanto una necesidad imperiosa. Descripción de la invención Se ha descubierto ahora que un nuevo virus responsable de la enfermedad de la bolsa infecciosa en las aves en los EEUU es una cepa recientemente identificada, cepa variante del GLS con lugares de reconocimiento alterados, tal que ninguno de los anticuerpos monoclonales reactivos en grupo y neutralizadores previamente desarrollados, es capaz de neutralizar o de unirse al virus. Sin embargo, estos anticuerpos monoclonales neutralizan y reaccionan con todas las vacunas para la EBI conocidas en la investigación actual. El virus ha sido aislado en la forma esencialmente pura y puede ser identificado por el fracaso del anticuerpo monoclonal 179 al no unirse al mismo, mientras que otro anticuerpo común no neutralizador así como los antisueros policlonales estándar disponibles del USDA, se unirá al mismo de una forma positiva, y el Acm 7 se unirá in vitro. Así, el virus nuevo puede ser reconocido por una prueba negativa. Si el Acm 179 no se une, pero sí reaccionan el B29, los antisueros policlonales o el Acm 7, está presente el nuevo virus variante de GLS, llamado DS 326. Como el 7 reacciona tanto con el GLS como con el DS 326, la reacción positiva de este Acm, solo, no se diseminará entre los dos virus. Este nuevo virus puede usarse en su forma muerta como vacuna muerta que induce anticuerpos resistentes al nuevo virus, y puede usarse en su forma atenuada o bien genéticamente alterada para preparar una vacuna viva o muerta. Descripción detallada de la invención Como se ha mencionado antes, el nuevo virus

3 3 ES T3 4 no está unido por ningún anticuerpo monoclonal específico al mismo. Así, la identificación de la presencia del virus nuevo no puede conseguirse através de las medidas normales. Sin embargo, gracias a una combinación de pruebas negativas y positivas, pueden conseguirse la presencia del virus y el aislamiento del virus. En particular, el anticuerpo monoclonal designado 179 que neutraliza todas las cepas del virus de la EBI serotipo uno previamente identificados y al menos una cepa serotipo dos, da resultados negativos en un ELISA de captura de antígeno cuando se hace reaccionar con las bolsas homogeneizadas sacadas de pollos que dieron los virus nuevos. Los mismos resultados se observaron con los Acm B69 y R63, selectivos para la cepa de virus D78 y ciertos virus clásicos y Delaware de una investigación anterior, que una vez se pensó que era la cepa prevalente en los Estados Unidos. Al mismo tiempo, otro Acm llamado B29, expresado por una línea celular hibridomal depositada en el ATCC bajo número de acceso MB 9746, sujeto a las condiciones del Tratado de Budapest, que no neutraliza el virus, sin embargo se une al él, así como a todas las vacunas existentes conocidas contra el virus. Adicionalmente, los antisueros del VEBI policlonales utilizados como un estándar, y disponibles del laboratorio nacional de servicios veterinarios de USDA en Ames, Iowa bajo designación ADU8701, se une en el ELISA de captura del antígeno, al nuevo virus. El Acm 7 se unirá al nuevo virus in vitro, así como el virus GLS. Los expertos identificarán los anticuerpos no neutralizadores que se unen al virus, y pueden ser directamente producidos como anticuerpos monoclonales convencionales. La invención no está limitada aningún factor de prueba Positivo dado. Como el tamaño total del virus, en comparación con cualquier lugar de neutralización disponible, es bastante grande, habrá un campo de gran potencial de tales factores de prueba positivos y antisueros policlonales. Así, la presencia del virus puede ser mejor determinada actualmente por pruebas negativas en un ELISA de captura de antígeno para el 179, y pruebas positivas bien del Acm 8, B29, 7 los antisueros policlonales u otros Acm positivos. Debería resaltarse, sin embargo, que la verificación morfológica o sintomática de la presencia de un virus EBI, unido al fracaso del 179 para fijarse a la muestra de un antígeno, es clara evidencia de la presencia del virus. Además, una reacción positiva con el Acm 7 indica la presencia, bien de GLS o bien del DS 326. Identificación de la presencia del virus Para identificar originalmente la presencia del virus nuevo, se muestrearon las poblaciones de pollos de una granja afectada. Las bolsas de las poblaciones de pollos se homogeneizaron colocando una bolsa en un ml de tampón SGPA- EDTA y moliendo la mezcla con un mortero y su mazo hasta obtener la consistencia similar a la de fluido. Este material se clarificó centrifugándolo a baja velocidad, y los sobrenadantes se analizaron por el ELISA de CA. En este ensayo, se recubrieron placas Inmulon 1 con 96 pocillos (obtenidos de Dynatech, de Virginia) con 0,1 ml de dos µg/ml de proteína A del Staphylococcus aureus en un tampón de revestimiento. Después de 18 horas a 4 C, las placas se vaciaron. De forma alternativa, se añadieron diluciones 1/ de los sobrenadantes ácidos recogidos de los cultivos de hibridoma que segregaron los Acm específicos del virus EBI 179 y 7 a la solución salina tamponada con fosfato, que contenía TWEEN y 2% de leche en polvo en seco sin grasa. Después de 24 horas de reacción a 4 C, se taparon las placas en seco y se cerraron durante minutos a temperatura ambiente. Después de cerrarlas, las placas se vaciaron y taparon en seco. Se añadió 0,1 ml de diluciones seriadas de cada muestra de las suspensiones de bolsas homogeneizadas a las placas cubiertas y, después de la incubación, las placas fueron vaciadas, tapadas en seco y lavadas tres veces durante tres minutos con PBS-T. Entonces, cada pocillo recibió 0,1 ml de biotina marcada con un conjugado de Acm 179, que se diluyó enpbs-t+nfdm.después de una hora de incubación, las placas se volvieron a vaciar y a lavar. Posteriormente, 0,1 ml de una estreptavidina-rábano peroxidasa conjugada se añadió a cada pocillo. Después de una hora de incubación las placas volvieron a vaciarse y a lavarse. Esto se siguió delaadición de un sustrato de TMB. Después de un breve período de incubación, se leyeron las pruebas a nm con la ayuda de un espectrómetro automatizado. Así, el Acm biotinizado se usó paraseñalarlas reacciones positivas entre el virus y los pocillos con 179 y 7, mientras que se realizó un ELISA de CA similar con sueros anti-vebi policlonales para señalar las capturas de B29. Alternativamente, el B29 biotinizado podía ser utilizado para el mismo efecto. Además, podía usarse cualquier forma de marcaje del Acm o de los anticuerpos policlonales. Todas las cepas se mostraron negativas a la reactividad con el 179, pero fueron altamente positivas para el Acm B29, que se combina de manera no neutralizadora así como reaccionante con el anticuerpo neutralizador 7. Como el 179 es un anticuerpo neutralizador para todos los virus EBI previamente identificados, es adecuado un ensayo empleando sólo éste como el ensayo positivo no neutralizador. El uso añadido de B69 y R63 ó7ledaunamayornivel de confianza, y puede utilizarse para definir y separar más las cepas de VEBI de las investigaciones anteriores. Confirmación de la pureza y virulencia del virus Se juntaron muestras de la cepa identificada, cuyo virus está expresadoporeldepósito en el Instituto Pasteur sujeto a las condiciones del Tratado de Budapest bajo el número de acceso i-9, se hicieron reaaccionar con el Acm 179 y fueron inoculados a pollos SPF. Cinco días después de la inoculación, estos pollos, y los pollos no inoculados, se sometieron a necropsia. Aquellas aves alasqueselesinoculó el virus recogido, referido como DS 326, mostraron lesiones consistentes sólo con la enfermedad de la bolsa infecciosa. Para más certeza, se tomaron los antisueros delasaves11días después de la inoculación, y se probaron con el ELISA indirecto y mostraron conversión serológica al VEBI, pero no a otras enfermedades avícolas conocidas. Las muestras de bolsas de estas aves se homogeneizaron y pasaron 3

4 ES T3 6 una segunda vez en presencia de 179 con resultados idénticos. En ambos pasajes, en una escala de 0-9, la reactividad con el B29 y el Acm 7 estaba en el nivel 9, y la reactividad con el 179 estaba en el nivel 0. Así, se identificó una preparación pura de un virus no identificado previamente, no relacionado con ninguna vacuna conocida en los lugares de neutralización del R63 y B69, preparados a partir del virus o de otra forma. La preparación de anticuerpos monoclonales adicionales, la información de proteínas,elanálisis de ARN viene a continuación. Esta información proporcionará la base necesaria para la preparación de vacunas basadas en las proteínas tipo virus recombinantes neutralizadoras, pero no tóxicas. Hasta que tales vacunas de diseño estén disponibles, cualquiera de las preparaciones del virus aislado, cada una con la designación DS 326, puede usarse en su forma muerta, para la preparación de las vacunas muertas convencionales, que confieren inmunidad contra el nuevo virus. Las cepas DS 326 pueden prepararse en una vacuna a través de los procedimientos comunes que no son, per se, parte de esta invención, entre los que los más prominentes son, la inactivación por calor y la inactivación química, que preserva la forma esencial de la vacuna para permitir la pre- 1 2 paración, por parte del ave inoculada, de los anticuerpos NV protectores mientras se le hace no virulento. Alternativamente, hay conocidos procedimientos para atenuar los virus, incluyendo el pasaje en serie, la clonación de los virus, quitando secuencias de ácidos nucleicos y mutagénesis dirigida al lugar, que permitirá la preparación de una vacuna de virus vivos no virulentos. Las vacunas pueden prepararse por la simple incorporación del derivado del virus seleccionado y suspendiéndolo o mezclándolo en un vehículo. Los valores de dosificación adecuados pueden ser determinados a través de técnicas de rutina de prueba y error, muestreando para un anticuerpo. Siendo tan importante la preparación de la nueva vacuna, no se proporciona un procedimiento por el que se pueda identificar la presencia del virus en una población dada de aves, por una prueba ELISA relativamente rápida y eficiente, por la que se confirma la presencia del virus, si la reacción con el 179 es negativa, mientras que la reacción a una vacuna policlonal, 7 o B29, es positiva. El B29 se expresa por una línea celular hibridomal que ha sido depositada, bajo los términos del Tratado de Budapest en el ATCC bajo el número de acceso HB

5 7 ES T3 8 REIVINDICACIONES 1. Un proceso para la preparación de un virus purificado que comprende el aislamiento en una población de pollos de un virus capaz de inducir la enfermedad de la bolsa infecciosa en las aves, al que el anticuerpo monoclonal expresado por la línea celular HB 18 ATCC no se unirá, y al que se unirán, un factor de prueba no neutralizador seleccionado del grupo que consiste en un antisuero policlonal estándar contra el virus de la enfermedad de la bolsa infecciosa, y el anticuerpo monoclonal expresado por la línea celular HB 9746 ATCC y que comprende los anticuerpos de la enfermedad de la bolsa infecciosa. 2. El proceso de la reivindicación 1, a cuyo virus se unirá in vitro el anticuerpo monoclonal expresado por el HB 16 ATCC. 3. El proceso de la reivindicación 1, donde dicho virus se suspende, bien en un medio no inmunogénico o en un medio inmunogénico. 4. Un proceso para la preparación de una vacuna para la prevención de la enfermedad de la bolsa infecciosa en las aves, que comprende: la mezcla del virus preparado por el proceso de la reivindicación 1, con un vehículo farmacológicamente aceptable para ello.. El proceso de la reivindicación 4, donde dicho virus está en forma muerta. 6. El proceso de la reivindicación 4, donde dicho virus está en una forma viva pero atenuada. 7. Un equipo de pruebas para la detección de la presencia de un virus de acuerdo con la reivindicación 1 capaz de inducir la enfermedad de la bolsa infecciosa en una población avícola, que comprende: una preparación de un anticuerpo monoclonal expresado por la línea celular HE 18 ATCC, una preparación de un factor de prueba no neutralizador que comprende los anticuerpos contra la enfermedad de la bolsa infecciosa, y los medios para el soporte de dichas preparaciones en contacto con una muestra de tejido de bolsa sacado de dicha población. 8. El equipo de la reivindicación 7, que comprende además una preparación de un anticuerpo monoclonal expresado por la línea celular HB 16 ATCC. 9. El equipo de la reivindicación 7, donde dicho factor de prueba comprende los anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en el anticuerpo monoclonal expresado por HB 9746 ATCC y los anticuerpos presentes en un antisuero policlonal estándar contra el virus de la enfermedad de la bolsa infecciosa.. Un procedimiento para la detección de la presencia de un virus de acuerdo con la reivindicación 1 capaz de inducir la enfermedad de la bolsa infecciosa en una población avícola, cuyo virus no es neutralizado por un anticuerpo monoclonal expresado por HB 18 ATCC y se unirá con un anticuerpo monoclonal expresado por la línea celular HB 9746 ATCC o con los anticuerpos presentes en un antisuero policlonal estándar contra el virus de la enfermedad de la bolsa infecciosa, que comprende: poner en contacto muestras de tejido de la bolsa separadamente con el anticuerpo monoclo nal expresado por HB 18 ATCC y un factor no neutralizador positivo capaz de unirse a dicho virus, comprendiendo dicho factor anticuerpos contra el virus de la enfermedad de la bolsa infecciosa, y comparando el grado de unión observado entre dichas muestras y dicho anticuerpo monoclonal y el factor de prueba, donde un alto grado de unión entre dicha muestra y dicho factor de prueba, junto a una ausencia sustancial de unión entre el anticuerpo monoclonal expresado por HB 18 ATCC y dicha muestra, es indicativa de la presencia de dicho virus. 11. El procedimiento de la reivindicación, donde dicho factor de prueba comprende anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en el anticuerpo monoclonal expresado por la línea celular HB 9746 ATCC y los anticuerpos presentes en un antisuero policlonal estándar contra el virus de la enfermedad de la bolsa infecciosa. 12. El procedimiento de la reivindicación 11, donde dicho factor de prueba comprende los anticuerpos monoclonales de HB 16 ATCC. 13. Un procedimiento para la detección de la presencia de un virus de acuerdo con la reivindicación 1 capaz de inducir la enfermedad de la bolsa infecciosa en una población avícola, cuyo virus no es neutralizado por el anticuerpo monoclonal expresado por HB 18 ATCC, que comprende, la detección de la presencia de un virus de la enfermedad de la bolsa infecciosa en dicha población por inspección morfológica o patológica, y poner en contacto las muestras del tejido de la bolsa sacado de dicha población con dicho anticuerpo monoclonal, y la observación del grado de unión entre ellos, en donde una ausencia sustancial de unión entre ellos indica la presencia de dicho virus. 14. Un proceso para preparar un virus sustancialmente puro, que comprende expresar dicho virus por la línea celular depositada bajo el número de acceso i-9 (CNCM, Instituto Pasteur). NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluída en la mencionada reserva.