LABORATORIO DE LIPIDOS

Transcripción

1 LABORATORIO DE LIPIDOS

2 A quien? A toda persona a partir de los 20 años. Si se obtienen valores deseables repetirlos cada 5 años Hombres años y mujeres años o mujeres post menopáusicas sin ECC previa coronaria (EC) conocida. <35 años con 2 o mas factores de riesgo Individuos con enfermedades que afecten el metabolismo lipidico Individuos con familiares en primer grado con dislipidemia Toda persona con EC, cerebral o periférica conocida En niños >2 anos con enfermedades con riesgo CV, con padres con hipercolesterolemia o con historia familiar de enfermedad vascular prematura

3 Colesterol Total Valores esperados en adultos < 200 mg/dl mg/dl > 240 mg/dl Deseable Intermedio alto Alto Colesterol LDL < 100 mg/dl mg/dl mg/dl mg/dl > 190 mg/dl Optimo Intermedio bajo Intermedio alto Alto Muy alto Colesterol HDL < 40 mg/dl varones < 50 mg/dl mujeres > 60 mg/dl Bajo Alto Trigliceridos < 150 mg/dl mg/dl mg/dl > 500 mg/dl Deseable Levemente elevados Elevados Muy elevados

4 Valores esperados en niños Colesterol Total < 170 mg/dl mg/dl 200 mg/dl Deseable Intermedio alto Alto Colesterol LDL < 110 mg/dl mg/dl 130 mg/dl Deseable Intermedio Elevado Colesterol HDL > 45 mg/dl mg/dl < 40 mg/dl Deseable Intermedio Bajo Triglicéridos 0-9 años años < 75 mg/dl mg/dl 100 mg/dl < 90 mg/dl mg/dl 130 mg/dl Deseable Intermedio Elevado Deseable Intermedio Elevado

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6 Variabilidad Analítica Variabilidad Pre analítica Variabilidad Biológica

7 Variabilidad pre analítica Estado metabólico estable Dieta y estilo de vida habitual Ayuno Toma de muestra

8 Etapa analítica La estandarización y armonización del Laboratorio de Lípidos y Lipoproteínas Procedimientos de medida Selección de calibradores y controles Terminología y unidades Formato de informes Intervalos de referencia y limites de decisión Pruebas perfiles y criterios de interpretación de resultados Programas de control de calidad Programas de validación

9 Variabilidad Biológica y Analítica de los parámetros lipídicos y lipoproteicos Variabilidad Biológica CV% Imprecisión % Bias % Error Total % Triglicéridos 20,9 10,5 10,7 27,9 Colesterol Total 6,0 3,0 4,0 9,0 Colesterol LDL 8,3 4,2 6,8 13,6 Colesterol HDL 7,1 3,6 5,2 11,1

10 Variabilidad Biológica 1. Paciente con TG de 90 mg/dl ± 21%= mg/dl 2. Paciente con TG de 160 mg/dl ± 21%= mg/dl 3. Paciente con TG de 320 mg/dl ± 21%= mg/dl Como hacemos para disminuir la Variabilidad Biológica??????????? Aumentando el Nº de determinaciones por individuo

11 Error Total% Error Absoluto% + Error Sistemático% EA + ES EA % = 1,65 x CV% Precisión ES % = valor obs-valor ver x 100 valor verdadero Exactitud Control de calidad interno Control de calidad externo

12 Ejemplo: Colesterol Total VB: 6,0 % Imprecisión 3,0 % Biass 4,0 % ET: 9,0% Paciente con Colesterol Total= 200 mg/dl 200 ± 9% 182 mg/dl 218 mg/dl Aceptable Debemos conocer el Error Total con el que estamos trabajando y saber si cumplimos con los requisitos de calidad establecidos

13 Etapa post analítica Con la finalidad de minimizar la VB y el ET, se recomienda realizar dos determinaciones con un intervalo de 14 días, de preferencia en el mismo laboratorio Cuando podemos decir que el valor de una determinación lipídica cambió significativamente entre dos muestras consecutivas de un paciente por causas clínicas y no por variaciones analíticas o biológicas?? DELTA CHECK O VALOR DE REFERENCIA DE CAMBIO VRC%= 2 x 1,96 x [(CV%)2 + (CVb% intraindividuo)2] porque son dos muestras valor estadístico Z para 95% de probabilidad El VRC% nos indica cuando el cambio entre dos valores consecutivos de un paciente es clínicamente significativo, y no debido a variaciones biológicas o analíticas

14 Ejemplo: CT: 260 mg/dl CT: 220 mg/dl Mejoró??? VRC%= 2 x 1,96 x [(CV%)2 + (CVb% intraindividuo)2] CV de mi laboratorio : 3% VB ColesterolTotal: 6% VRC%= 2 x 1.96 x (3.0)2 + (6.0)2 =1.41 x 1.96 x = 18,54 % Calculo el 18,54% de 260 mg/dl = 48,2 mg/dl 260 mg/dl - 48,2 mg/dl = 211, 8 mg/dl Este cambio no es clínicamente significativo!!!

15 Formato de informes

16 COLESTEROL TOTAL TRIGLICERIDOS C-HDL C-LDL PCR hs HOMOCISTEINA Lipidograma electroforetico APOPROTEINA AI APOPROTEINA B100 Lipoproteina (a)

17 Aspecto del suero Realizar la observación contra fondo oscuro luego de dejar en reposo en la heladera durante 24 horas.

18 Colesterol Total Método de referencia primario del National Institute of Standards and Technology (NIST) es espectrometría de masas por dilución isotópica (IDMS). Método de referencia secundario del CDC es una modificación del procedimiento de Abell, Levy, Brodie and Kendall, el cual presenta un bias de +1.6% con respecto al IDMS debido a que también dosa esteroles y fitoesteroles. Este método fue y es utilizado para estandarizar los métodos de aplicación clínica, de los cuales los enzimáticos son los recomendados.

19 Colesterol Total Colesterol Total: variable lipídica con bajo poder discriminatorio, 60% de los valores de CT pueden estar presentes tanto en pacientes sanos como en pacientes con ECV, por lo que su utilización aislada tiene una gran incertidumbre.

20 Triglicéridos Método definitivo del National Institute of Standards and Technology (NIST) es espectrometría de masas por dilución isotópica (IDMS). (bias 0.7 %; CV % 1.2) Método de referencia (CDC) Isotope Dilution GC-MS (bias 2%) Mide glicéridos totales Métodos enzimáticos se basan en la hidrolisis enzimática de los TG por una Lipasa y la medición del Glicerol libre Material de referencia: DI CG-EM bias ± 5 % a 10 % ( mg/dl)

21 Calibrador primario CDC PROCEDIMIENTOS DE ESTANDARIZACION Red de laboratorios para Lípidos y lipoproteínas (CRMLN) Calibración Calibración Prueba de Proficiencia Correlación muestras de paciente TRAZABILIDAD CONMUTABILIDAD FABRICANTE LABORATORIO CLINICO

22 TRIGLICERIDOS CONCORDANCIA CDC vs NIST Clinical Chemistry 58:4, (2012)

23 TRIGLICERIDOS CONTROL DE CALIDAD CDC LSP Clinical Chemistry 58:4, (2012)

24 Colesterol-HDL Método de referencia (CDC) ultra centrifugación precipitación selectiva cuantificación Met Abell y col Método precipitación selectiva Métodos homogéneos o directos Si es capaz de medir menos de 50 mg /dl con una diferencia menor a 5 mg/dl, la determinación de C-HDL puede ser usada en la evaluación del riego individual

25 Ultracentrifugacion <1.006 g/l Quilomicrones, VLDL CENTRIFUGACIÓN suero 18 hs a 10º C rpm LDL y HDL del suero

26 DIFERENCIA (%) ENTRE C-HDL directo y METODO DE REFERENCIA Alan Ramely, Clinical Chemistry 56:6 (2010)

27 % de desvío de C-HDL directo vs método de referencia, según TG Alan Ramely, Clinical Chemistry 56:6 (2010)

28 El aumento de 1 mg/dl de C-HDL Disminuye el riesgo de enfermedad coronaria 6 % [Independiente de la concentración de C-LDL]

29 Colesterol-LDL Método de referencia (CDC) ultra centrifugación precipitación selectiva cuantificación Met Abell y col (C-IDL, C-Lp(a), Remanentes de VLDL) Fórmula de Friedewald Precipitación selectiva Métodos Homogéneos

30 ULTRACENTRIFUGACION G/L CENTRIFUGACIÓN Quilomicrones, VLDL 18 hs a 10º C suero rpm LDL y HDLdel suero

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32 El valor del C-LDL calculado C-LDL= Col Total - ( Col-HDL + TG/5 ) Acumulación de errores analíticos de CT, TG y C-HDL Se asume una relación constante de CT/TG en VLDL El uso de la fórmula de Friedewald no esta indicado en estado postprandial y cuando los TG están aumentados

33 DIFERNCIA C-LDLDmed - C-LDL calc. C-LDL MEDIDO CORRELACION Y CONCORDANCIA. TG mg/dl y = 0,9362x - 2,6413 R 2 = 0, C-LDL FF Diferencia en los valores de C-LDL medidos y calculado TG mg/dl PROMEDIO (C-LDLmed + C-LDLcal) / 2 Media de la diferencia -7

34 % de desvío de C-LDL directo vs método de referencia, según TG Alan Ramely, Clinical Chemistry 56:6 (2010)

35 COLESTEROL-NO-HDL = Col-LDL + col-idl + col-vldl Recomendado por NCEP-ATP III como 2º target de tratamiento en pacientes con TG> 200 mg% Fuerte predictor de ECV, en diabéticos tipo 2 (Strong Heart Study) Económico y de muy fácil determinación No se requiere ayuno Valores esperados: col-ldl+ 30 mg % Excelente correlación con col-ldl (r=0.9) y apo B (r=0.85), Correlación no es igual a concordancia

36 Sociedad Americana de Lípidos (NLA) Concentraciones de Colesterol y Triglicéridos según la categoría de riesgo mg/dl C- No-HDL C-HDL <130 Deseable <40 (Hombres) Bajo Cercano al deseable <50 (Mujeres) Bajo Moderadamente alto Alto 220 Muy alto C-LDL Trigliceridos <100 Deseable <150 Normal Cercano al deseable Moderadamente alto Moderadamente alto Alto Alto 500 Muy alto 190 Muy alto

37 Clasificación de riesgo según C-LDL directo, calculado y C-noHDL Alan T. Remaley, Clinical Chemistry 57:3 (2011)

38 MEJORA EN LA CLASIFICACIÓN DEL SCORE DE RIESGO CARDIOVASCULAR HDL C-No Error en la clasificación TG< 200 mg/dl Error en la clasificación TG mg/dl C-LDL calc 5% - 17% 15% - 35% C-LDL directo 8% - 26% 10% - 35% C-No HDL 0 % -11% 0% - 18% Russell Warnick, Alan T. Remaley Clinical Chemistry 57:3 (2011

39 COCIENTES LIPOPROTEICOS Significado fisiológico y utilidad clínica CT/C-HDL predictivo y diferenciador de enfermedad coronaria. Mayor sensibilidad y especificidad que CT TG/C-VLDL caracteriza la composición de VLDL TG/C-HDL insulino resistencia, síndrome metabólico LDL p y d

40 INDICES LIPOPROTEICOS Cociente Prevención primaria Objetivo Prevención secundaria Objetivo Varones Mujeres Varones mujeres CT/C-HDL < 4.5 < 4.0 < 3.5 < 3.0 C-LDL/C-HDL < 3.0 < 2.5 < 2.5 < 2.0 Apo B/Apo A < 0.9 < 0.8 < 0.7 < 0.6

41 NCEP -ATPIII, 2001 Colesterol VLDL (mg/dl) Deseable 30 mg / dl C-VLDL= C (VLDL+HDL) - C-HDL VLDL ATIPICAS VLDL GRANDES Y SOBRECARGADAS EN TG VLDL PEQUEÑAS RICAS EN COLESTEROL

42 Como estimar el tipo de VLDL Col total = col LDL + col HDL + col VLDL+ (col-idl) Col -VLDL= col total - col LDL - col HDL C - VLDL TG = O.2 = típica > 0.3 = VLDL rica en colesterol < 0.17 = VLDL rica en TG Requisito: Col LDL debe medirse por el método químico Obs: Se desprecia col-idl y se asume que todos los TG están en VLDL

43 Insulin-Resistance Small dense LDL 1 TG/HDL-C Triglyceride HOMA Total C/HDL-C BMI HDL-C Glucose Total cholesterol TG/C-HDL Valor de corte: 3.0 Valor de corte: 3.5 LR: 2.0 ( ) LR: 8.1 ( ) McLaughlin T, Ann Int Med 2003 McLaughlin T, Am J Cardiol 2005

44 TG/C-HDL: Predictor de enfermedad coronaria Clínicas (Sao Paulo) Aug; 63 (4) :427-32

45 Lipidograma electroforético Se realiza cuando los Triglicéridos están aumentados con o sin aumento de Colesterol Total. Principalmente para observación de Beta-VLDL. Soporte: gel de agarosa Buffer: Veronal Acido/Veronal Sódico, PH: 8,6 Interpretación visual semicuantitativa por comparación con un suero normal Método: Noble modificado Informe: Alfa lipoproteína: N o D Beta lipoproteínas: N o A Pre Beta lipoproteínas: N o A Quilomicrones: Presentes/ Ausentes Conclusión: Hiperlipemia fenotipo (I, IIa, IIb, III, IV o V) Hipolipemia Normolipemia Observaciones

46 Separación de lipoproteínas en gel de agarosa pre Pre 1 Banda ancha El Bioquímico puede tipificar las dislipemias

47 Fenotipos de hiperlipemia mas frecuentes en Diabetes tipo 1 Quilomicrones HDL o Alfa LP VLDL o pre beta LP

48 CLASIFICACION DE HIPERLIPOPROTEINEMIAS Aspecto TG Col-Total Alteración del suero Lipoproteica I -HTG exógena Lechoso Normal ó Acum. Quilomicrones IIa-HiperCol Límpido Normal LDL IIb- HiperCol + HTG endógena III- HTG mixta + HiperCol Opalescente/ turbio Turbio VLDL y LDL VLDL ( IDL) IV-HTG endógena Opalescente turbio Normal ó VLDL V-HTG mixta Turbio/ Lechoso Acum. Quilomicrones y VLDL

49 APOLIPOPROTEINAS FACTORES PREANALITICOS Apo B 100 Apo AI Diurnas 5 % 4 % Sexo Hombre > Mujer mujer>homb Edad Aumenta No varia Embarazo Aumenta 60 % Aumenta 30 % Alcohol No varia Aumenta Cigarrillo No Varia Disminuye Postura 5 % 9 % Oclusión venosa 5 % 5 % Conservación 7 % ---

50 APOLIPOPROTEINAS A-I Y B Métodos: RIA, RID, EIA, Nefelometría, Turbidimetría, Materiales de Referencia IFCC y OMS Calibradores: liofilizado para apo A-I líquido de LDL para apo B Controles CV % apoai CV % apo B Errores en apo B100 Estandardización WHO/IFCC Inmunonefelomertría ET 5.3 % % Inmunoturbidimetría ET 0.9% - 3.2% Métodos directos independientes de la heterogeneidad de las lipoproteínas

51 CONCENTRACION DE APOPROTEÍNA B EN LAS LIPOPROTEÍNAS Lipoproteína Concentración (apob mg/dl) Atherogenicidad Chylomicrons <0.5? Chylomicron remnants VLDL VLDL remnants IDL LDL Lp(a) Journal of Internal Medicine 2006; 259:

52 colesterol colesterol normal colesterol normal TG normal Triglicéridos normal TG Col 485 mg/dl 157 mg/dl 200 mg/dl TG 87 mg/dl 79 mg/dl 341 mg/dl Apo B 180 mg/dl 80 mg/dl 180 mg/dl Aumenta Aumenta Aumenta Tamaño número de Partículas Contenido de Colesterol Disminuye Aumenta Disminuye

53 Apo B/Apo A vs CT/C-HDL... ApoB/ApoA CT/C-HDL Ingelsson E, Schaefer E. Jama 2007,298 (7)

54 Apo B/ApoA vs CT/C-HDL Mujeres Hombres AMORIS study

55 INDICES LIPOPROTEICOS Cociente Prevención primaria Objetivo Prevención secundaria Objetivo Varones Mujeres Varones mujeres CT/C-HDL < 4.5 < 4.0 < 3.5 < 3.0 C-LDL/C-HDL < 3.0 < 2.5 < 2.5 < 2.0 Apo B/Apo A < 0.9 < 0.8 < 0.7 < 0.6

56 C-HDL Correlación C-HDL vs Apo AI R=0.61 p< Apo AI Importancia Clínica: Síndromes de deficiencia de HDL

57 LIPOPROTEINA (a)

58 Lipoproteína (a) g/l ISOFORMAS DE APO (a) _ _ 0.2 _ Isoformas B S1 S2 S3 S4 KDa Frecuencia 1 % 3 % 18 % 21 % 32 % Clinical hemistry,1990

59 LIPOPROTEINA (a) EN PACIENTES CORONARIOS _ + pre 1 Controles Coronarios n=29 n=138 PRESENTE 13,8 % 34,1 % PRE 1 Wikinski, Mosso, Paglione, 1974

60 DESEMPEÑO DE UN ENSAYO TURBIDIMETRICO PARA Lp(a) Clin. Chem. 2000, 46 (12)1956

61 LIPOPROTEINA (a) Se sugiere en pacientes con alto riesgo CHD borderline o alto C-LDL - alto apo B - CHD documentada-hc Fliar Baja respuesta a la reducción de C-LDL Pacientes diabéticos-con enfermedad renal-menopausia Pacientes con Lp(a) > 50 mg/dl mayor atención a los factores modificables

62 MECANISMO ATERO-TROMBOTICO Dieta Folato Tetrahidrofolato Metionina sintetasa + B 12 Metionina Homocisteína Metiltransferasa + Betaína N 5 -Metiltetrahidrofolato Peroxidación lipídica Daño de la matriz vascular Proliferación celular del músculo liso Homocisteína Valores de referencia 5-10 µm/l Objetivo terapéutico en alto riesgo < 10 µm/l E x c e s o C S + B 6 Cistationina Cisteína Excreción urinaria Injuria endotelial Regulación vasomotora dañada Superficie protrombótica

63 PRUEBA FUNCIONAL PARA EVALUAR HIPERTRIGLICERIDEMIA VLDL Inhiben la sitesis de AG PRUEBA FUNCIONAL ACIDOS GRASOS n-3 TG-VLDL

64 PRUEBA FUNCIONAL DIA 1 Muestra de sangre basal con 12 horas de ayuno, medir triglicéridos totales. DIA 1 a 5 Administración de un concentrado de aceite de pescado que provee 3.6 g/dia ácidos grasos n-3. DIA 6 Muestra de sangre con 12 hs de ayuno, medir triglicéridos totales

65 TRIGLICERIDOS mg/dl PRUEBA FUNCIONAL Efecto de los ácidos grasos n-3 sobre los TG PRE POST

66 EVALUACION DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS LIPOLITICAS MUESTRA: Plasma obtenido después de la inyección endovenosa de 60 UI de heparina / Kg de peso. LIPOPROTEINA LIPASA: Directa : Sustrato TRIOLEINA [con inhibidor de LH y con ó sin suero activador]. Producto GLICEROL ó FFA Indirecta: Se mide disminución de TG [mét.extractivo] ó aumento de FFA. LIPASA HEPATICA : Directa: Sustrato TRIOLEINA [con NaCl 1 M]. Producto GLICEROL ó FFA.

67 COMO EVALUAR LA DISLIPEMIA POSPRANDIAL Medida de TG sin ayuno (posprandiales): Potencialmente buen indicador Un valor <180 mg/dl es aceptable, >200 mg/dl requiere evaluación adicional Sin embargo: falta estandarización respecto al tiempo desde la última ingesta La variación intra-individual en TG es 15-30% y aumenta durante el día

68 COMO EVALUAR LA DISLIPEMIA POSPRANDIAL Cálculo del colesterol de Remanentes en estado posprandial: Col-remanentes: Col-total- [col-ldl+col-hdl] Varbo A et al, J Am Coll of Cardiol, 2013 Por cada 1 mmol/l (39 mg/dl) de aumento de col-remanentes, se asocia con 2,8 veces mayor riesgo de enfermedad isquémica. El cálculo se presenta como un parámetro útil para la predicción del riesgo

69 COMO EVALUAR LA DISLIPEMIA POSPRANDIAL

70 TRIGLICERIDOS SIN AYUNO VS LIPOPROTEINAS REMANENTES Nakajima K, et al. Clin Chim Acta, 2009; 404: La medida de TG a 4hs de la última ingesta, podría reemplazar la medida directa de remanentes para evaluar hiperlipemia postprandial y el riesgo CV.

71 COMO EVALUAR LA DISLIPEMIA POSPRANDIAL

72 COMO EVALUAR LA DISLIPEMIA POSPRANDIAL Prueba de Tolerancia oral a grasas: Se ha propuesto para evaluar la dinámica del metabolismo lipídico, en paralelo con la PTOG. Se recomiendan 75 g de grasa luego de 8 hs de ayuno En sujetos normales se observa aumento de TG entre los 3 y 4 horas y se mantienen elevados hasta las 8 hs. Medida de apob48 (ELISA): La baja concentración plasmática de apob48 dificulta su evaluación

73 Relación entre RLP y TG sin ayuno Nordestgaard BG et al, JAMA, 298:

74 Curvas de sobrevida (Kaplan-Meier)- Comparación de desarrollo de eventos coronarios en diferentes niveles de remanentes- Seguimiento: 3 años Nakamura T, et al Curr Atheroscler Rep. 8, 2006

75 Valor predictivo de RLP-col como indicador de estenosis coronaria en pacientes con triglicéridos normales Con estenosis coronaria Sin estenosis coronaria p Total Chol (mg/dl) 195±33 89± LDL-chol (mg/dl) 134±33 116± HDL-chol (mg/dl) 41±11 53±15 < TG (mg/dl) 106±25 97± Lp (a) (mg/dl) 22.8± ± RLP-chol (mg/dl) 5.9± ± Uric acid (mg/dl) 5.7± ± Glucose (mg/dl) 109±33 95± BMI (Kg/m 2 ) 23.8± ± Masuoka H, Internal Med, 2000

76 Remanentes TRL Aumento del flujo al subendotelio Retención en la íntima LPL LPL LPL LOX-1 Partículas grandes son rapidamente hidrolizadas Penetran y se retienen, sin modificación previa LOX-1 Estimulan expresión de LOX-1- O 2 - Aumenta la expresión de citoquinas pro-inflamatorias O 2 - Disfunción endotelial

77 Sexo Masculino 40 años Ingresa a Emergencia por cuadro de abdomen agudo Se observa suero lechoso Se deriva al LACMI para estudio de lipidos Tipo de Hiperlipemia? Causa probable? Como continua el estudio desde el laboratorio? Manifestaciones clínicas? Riesgo aterogenico?

78 Sexo Masculino 40 años Servicio de Emergencia Debut Diabético Mecanismo de Hiperlipemia?

79 Paciente de 54 años Sexo masculino Infarto Agudo de Miocardio Tipo de Hiperlipemia? Fenotipos de HLP probables? Formas primarias de HLP? Manifestaciones clínicas? Riesgo aterogénico?

80 Mujer de 55 años Acude al médico por chequeo anual Fenotipo de Hiperlipemia? Causas de Hiperlipemia Secundaria? Causas de Hiperlipemia Primaria? Manifestaciones clínicas? Compromiso Fliar? Riesgo aterogénico?

81 Mujer de 40 años Asiste al médico para control clínico Fenotipo de Hiperlipemia? Causas Secundarias? Causas Primarias? Riesgo aterogénico?