Cuantificación Absoluta por RT-qPCR

Transcripción

1 Curso de actualización y perfeccionamiento Diseño, ejecución y reporte de experimentos de retrotranscripción seguida de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) Cuantificación Absoluta por RT-qPCR Parámetros y validación para aplicaciones diagnósticas Bioq. Germán R Perez Área Virología FCByF - UNR Laboratorio de Virología Humana IBR/CONICET

2 PCR en tiempo real es la recolección continua de señal fluorescente de una o más reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) en un intervalo de ciclo de amplificación. PCR en tiempo real cuantitativa (qpcr) es la conversión de las señales fluorescentes de cada reacción en un valor numérico para cada muestra.

3 NOMENCLATURA EN qpcr Línea de Base (baseline): se define como los ciclos de PCR en los cuales la señal fluorescente se acumula pero está por debajo de los límites de detección del instrumento (Ct 3 Ct 15). Rn: los programas calculan este parámetro usando la ecuación Rn = Rnf Rnb, siendo Rnf la emisión de la fluorescencia del producto a cada tiempo puntual y Rnb la fluorescencia de emisión de la línea de base. Durante los ciclos tempranos de la reacción, los valores Rn no superan la línea de base. Umbral (Threshold): los programas eligen arbitrariamente el umbral basado en la variabilidad de la línea de base. Se calcula como 10 veces la desviación estándar del promedio de la señal fluorescente. Ct: el número de ciclo de la PCR donde la emisión de fluorescencia es mayor que el nivel mínimo de detección (umbral). Siempre debería reportarse durante la fase exponencial de la amplificación, donde ninguno de los Arya et al, 2005 componentes de la reacción son limitantes. En estas condiciones, el valor de Ct es reproducible.

4 INSTRUMENTOS PARA Real Time-PCR Eurogentec

5 ETAPAS EN LA RT-qPCR Pfaffl, 2008

6 ETAPAS EN LA RT-qPCR Química de detección Wong et al, 2005 Colorantes de unión al DNA

7 ETAPAS EN LA RT-qPCR Obtención del ácido nucleico Producto final debe estar limpio y libre de cualquier residuo de buffers. Estos productos residuales pueden inhibir la acción de la enzima o modificar la concentración salina del buffer de reacción. Inhibidores en la muestra Columnas vs Técnicas manuales de extracción La calidad de la extracción influirá en la calidad de su detección y cuantificación. Asegurar la reproducibilidad si desea comparar muestras biológicas. Diseño general del ensayo

8 ETAPAS EN LA RT-qPCR Retrotranscripción Diferentes tipos de cebadores: - random primers - olido d(t) - cebadores específicos Cebadores específicos para G3PDH RNA 1/10 (Peters et al, 2004) RT con cebadores Fw y Rv RT con cebador Rv

9 ETAPAS EN LA RT-qPCR Diseño de Cebadores Específicos Herramientas bioinformáticas disponibles: Características: Longitud: bases Contenido de GC: % (ideal: 40 60%) Tm: C (ΔTm 4 ºC) Evitar missmatch especialmente en extremo 3' Evitar tramos de nucleótidos idénticos Evite T en extremo 3 Evite la complementariedad dentro del cebador para evitar formación de horquillas Evite las complementariedades entre los cebadores para evitar dímeros de cebadores, especialmente de 2 o más bases en los extremos 3'de los cebadores. Comprobar especificidad de los cebadores (

10 ETAPAS EN LA RT-qPCR Diseño de Sondas Longitud: bases (ideal 20 bases) Longitudes > 30 bases son posibles, pero se recomienda no posicionar el quencher en el extremo 3, sino internamente a bases del extremo 5 (normalmente acoplado a una T) Contenido de GC: % Tm: > 8 10 C que la mayor Tm de los cebadores Seleccionar la cadena que da la sonda con mayor cantidad de C que de G Colocar la sonda lo más cercano a los cebadores posible, sin que se superpongan Evitar missmatch entre sonda y target Evitar tramos de nucleótidos idénticos (> 4 Gs) Evite la complementariedad interna Evite G en extremo 5, especialmente con FAM Consideraciones en los productos de amplificación

11 ETAPAS EN LA RT-qPCR Perfil Térmico del Ensayo Ensayos con Sondas Ensayos con SYBR Green I

12 ETAPAS EN LA RT-qPCR Perfil Térmico del Ensayo Ensayos con SYBR Green I 83 C 87 C Ball et al, 2003

13 ETAPAS EN LA RT-qPCR Perfil Térmico del Ensayo Ensayos con SYBR Green I Roche Applied Science Technical Note No. LC 1/update 200 Sólo es una solución "estética" para la detección. No impide la formación de dímeros de cebadores. El aumento en la señal representa sólo el aumento por el producto específico ya que los dímeros de cebadores en la reacción son monocatenario y no contribuyen a la señal. Cuando se trabaja con sondas de hibridación, los dímeros de cebadores pueden estar presentes e influir en la reacción específica a pesar de que no son visibles. Por lo tanto, se recomienda optimizar inicialmente los nuevos ensayos con una reacción de SYBR Green I.

14 CONTROLES DEL ENSAYO Control de reactivos (NTC) Contiene la mezcla de reacción, cebadores y el agua (reemplaza al molde) No se debe observar amplificación. En ensayos de SYBR Green, es posible observar amplificación con Ct altos debido a dímeros de cebadores. El CtNTC debe estar 8 unidades de la última señal específica de amplificación. Se recomienda incluir al menos 2 NTC por ensayo. Control de amplificación (NAC) Contiene la mezcla de reacción, cebadores, RT y el molde pero sin Taq Polimerasa. Solo se recomienda cuando se utilizan MasterMix no comerciales. Si se usan MasterMix comerciales y en ensayos con sondas, se puede utilizar el NAC para corroborar la integridad de la sonda. Control de retrotranscripción (NRT) Contiene la mezcla de reacción, cebadores, Taq Polimerasa y el molde pero sin RT. Si se observa amplificiación (y no en NTC) se corrobora contaminación con DNA genómico.

15 CONTROLES DEL ENSAYO Control Positivo (PC) Permite detectar la calidad de los reactivos utilizados. Se recomienda el uso de una muestra previamente analizada o, en su defecto, un plásmido que pueda ser amplificado por el mismo par de cebadores usado para la muestra. Aporte información sobre la especificidad del ensayo pero no sobre el límite de detección del mismo. Control positivo de concentración baja (Control Cut-off): permite obtener información sobre la reproducibilidad en el límite de detección del ensayo. Control Interno (IC) Es una secuencia de DNA / RNA, presente en el mismo tubo de reacción, que se coamplifica junto a la secuencia de target. Permite validar el resultado negativo en el ensayo, descartando la presencia de inhibidores, fallas en la enzima, fallas en el termociclador, incorrecta preparación de la muestra, problemas en la extracción, etc.

16 CONTROLES DEL ENSAYO Control Interno No Competitivo (ICnoC) La secuencia target y el CI se amplifican con diferentes pares de cebadores. Son dos reacciones diferentes, con cinéticas distintas que deben producirse en las mismas condiciones, es decir, con iguales parámeteros de reacción. Controlando las concentraciones de los cebadores y del IC, se puede limitar la competencia por los dntps y la Taq polimerasa. La amplificación del ICnoC no refleja la amplificación del target ya que se utilizan cebadores distintos. Pueden utilizarse para diferentes ensayos en el mismo laboratorio. Control Interno Competitivo (ICC) La secuencia target y el CI se amplifican con los mismos pares de cebadores. Se realiza una única reacción, por lo cual, la cinética se produce en las mismas condiciones y con iguales parámeteros de reacción. Características similares en los productos de amplificación del target y ICC. La optimización en la concentración del ICC es crítica para no afectar el límite de detección del ensayo para el target. Específico para cada ensayo dependiendo del diseño del ICC. Pueden utilizarse como estándares para curvas de calibración.

17 MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN Cuantificación absoluta relaciona la señal de PCR con el número de copias mediante una curva de calibración. Cuantificación relativa mide el cambio relativo en los niveles de expresión de mrna. Pfaffl, 2004

18 CUANTIFICACIÓN ABSOLUTA Normalización Las formas más comunes de normalización son: al número original de las células a la cantidad total de RNA a un calibrador interno o externo Curvas de Calibración permiten la generación de datos específicos, sensibles y reproducibles. Basados en DNA Producto purificado de RT-PCR (Einspanier et al, 1999) DNA recombinante o DNA plasmídico (recdna) (Bustin, 2000; Pfaffl & Hageleit, 2001) Oligonucleótidos sintéticos de DNA (Bustin, 2000; Bustin 2005) Genes sintéticos de DNA Basados en RNA RNA recombinante o por transcripción in vitro (recrna) (Pfaffl & Hageleit, 2001) Oligonucleótidos sintéticos de RNA (Bustin et al. 2000, 2004, etc ) mrna sintéticos Fagos recombinantes de RNA Basadas en los datos Copy & Paste (LC software; Roche Diagn.) Pfaffl, 2004

19 CUANTIFICACIÓN ABSOLUTA Normalización DNA recombinante (recdna) RNA recombinante (recrna) recrna y recdna Cuantificación por múltiples medidas ópticas (n = 10) Dilución seriada entre cop/ml Almacenado a - 80 C con inhibidor de RNasa hasta su uso. Pfaffl, 2001

20 CUANTIFICACIÓN ABSOLUTA Normalización Pfaffl, 2001

21 CUANTIFICACIÓN ABSOLUTA Normalización Características de los controles y estándares para RT-qPCR utilizadas en ensayos bioquímicos Estable: resistente a las ribonucleasas Homogéneo: único, trascripto definido por secuencia Cuantificable: número de copias conocidas Compatible: utilizable con ensayos de RNA Flexible: permite adicionarse a diversas matrices No infeccioso: facilidad en el manejo y trasporte Fagos recombinantes Control Interno No Competitivo (ICnoC) Control Interno Competitivo (ICC) estándares

22 CUANTIFICACIÓN ABSOLUTA Normalización Fagos con RNA recombinantes Tecnología Armored RNA HPLC Assay Phosphate assay Sistema de empaquetamiento Armored RNA in vivo Sistema de empaquetamiento Armored RNA in vitro

23 CUANTIFICACIÓN ABSOLUTA Fagos con RNA recombinantes Bacteriófago Q Familia Leviviridae, género Allolevivirus, grupos serológico III Infectan a cepas de E. coli F+ Cápside de geometría icosaédrica Genoma ARN (+) simple hebra de nucleótidos Proteína A1 Es incorporada en la cápside Esencial para el ensamblado y viabilidad Única región del genoma modificable sin afectar el ensamblado del fago. Reemplazo de secuencias fágicas por virales Presencia de sitios de restricción únicos en la región de A1 Distancia entre los cebadores ~ 200 pb

24 CUANTIFICACIÓN ABSOLUTA Fagos con RNA recombinantes genoma del bacteriófago Q clonado como ADNc bajo el control del promotor T7 en un vector de expresión derivado de pbr322 con resistencia a Ampicilina (pbrt7q ) Cebadores de 50 pb Incluyen: Secuencias de cebadores heterólogos (Fw y Rv) Secuencias fágicas de la región A1 Sitios de restricción únicos en el genoma de Q (Bst98 I y Nsi I)

25 CUANTIFICACIÓN ABSOLUTA Fagos con RNA recombinantes Construcción del cdna recombinante Sistema para la producción de partículas fágicas

26 CUANTIFICACIÓN ABSOLUTA Curvas de calibración con estándar Se recomienda preparar una curva estándar para cada gen a estudiar Proporciona datos para analizar el rendimiento de la qpcr. Debe cubrir todo el rango de cuantificación esperada. Debe incluir al menos 5 puntos de dilución, cada uno de ellos por triplicado. Linealidad Eficiencia de la reacción Rango dinámico Precisión Reproducibilidad Cinética de la reacción

27 CRITERIOS ANALÍTICOS EN LA OPTIMIZACIÓN DE LA RT-qPCR Linealidad Coeficiente de correlación El r ² es un parámetro que indica linealidad de los puntos de datos. Si el r ² < 0,95, indica que no existe una relación lineal entre el Ct y log [C], por falta de precisión en el pipeteo o presencia de inhibidores. El r ² debe ser mayor que 0,985 para que sea aceptable la linealidad de los datos. Rango dinámico Rango de concentraciones donde el ensayo cumple la linealidad. No es válido extrapolar resultados. Indica la menor y mayor concentración de cuantificación del ensayo.

28 CRITERIOS ANALÍTICOS EN LA OPTIMIZACIÓN DE LA RT-qPCR Precisión Desviación standard Un conjunto de datos con un número suficiente de repeticiones forma una distribución ~ normal (teorema central del límite). 1SD ~ 68% de los valores 2SD ~ 95% de los valores 3SD ~ 99% de los valores E = máxima (100%) Ct = 1 para las medias de 2 muestras de concentraciones sucesivas en una dilución serial al 1/2. Para ser capaz de cuantificar ambas muestras en el 99,7% de los casos: SD < 0,167 (1 Ct / 6SD) Para ser capaz de cuantificar ambas muestras en el 95% de los casos: SD < 0,250 (1 Ct / 4SD)

29 CRITERIOS ANALÍTICOS EN LA OPTIMIZACIÓN DE LA RT-qPCR Eficiencia de la qpcr Nn = No. En siendo 1 < E < 2 Nn = No. (1 + E)n siendo 0 < E < 1 n : número de ciclos de la reacción No : cantidad de cebadores al inicio de la reacción Nn : cantidad de producto de reacción al ciclo n. E : factor de eficiencia de la reacción Métodos para determinar la Eficiencia de la reacción Diluciones seriales y= a.x+b E = 101/a

30 CRITERIOS ANALÍTICOS EN LA OPTIMIZACIÓN DE LA RT-qPCR Eficiencia de la qpcr Métodos para determinar la Eficiencia de la reacción Incremento de la fluorescencia absoluta E se determina mediante el segmento exponencial de la curva y simples técnicas de aproximación de datos. Fase II de la reacción y= c.x+d E = 101/c Si los segmentos rectos de la gráfica logf vs Ct son paralelos, entonces, los valores de E para estas reacciones son idénticos.

31 CRITERIOS ANALÍTICOS EN LA OPTIMIZACIÓN DE LA RT-qPCR Eficiencia de la qpcr Métodos para determinar la Eficiencia de la reacción Modelo matemático ajustado a f = yo e [(x xo) / b ] yo : Fluorescencia basal a : diferencia de fluorescencia entre máx y min. x : número de ciclos de la reacción xo : valor máximo de la primera derivada b : pendiente de la curva Aunque este enfoque no permite obtener el valor de la eficiencia de la reacción que se calcula, se hace una comparación de los valores de E obtenidos de dos o más reacciones. Cuanto menor sea el valor del parámetro b, mayor es la eficiencia.

32 CRITERIOS ANALÍTICOS EN LA OPTIMIZACIÓN DE LA RT-qPCR La señal fluorescente es proporcional a la cantidad de moléculas de DNA en el tubo de reacción. Las curvas de un mismo experimento en tubos absolutamente idénticos pueden no ser exactamente iguales. F=. Nn =. No. En El factor depende de: - la configuración del instrumento - los tubos de amplificación (tipo, la transparencia y limpieza) - los reactivos utilizados - la elección del sistema de visualización (intercalantes, sondas, etc) La comparación de los datos derivados de experimentos distintos (o tubos dentro del mismo experimento) no se puede realizar directamente, porque los valores del factor α pueden variar considerablemente. Normalización del Factor Rebrikov & Trofimov, 2005

33 CRITERIOS ANALÍTICOS EN LA OPTIMIZACIÓN DE LA RT-qPCR Normalización del Factor Métodos de pretransformación de las curvas Las curvas se igualan utilizando sondas fluorescentes presentes en los tubos. Aplicado en el icycler iq (BioRad). Se basa en el uso del punto inicial. Información insuficiente. Las curvas se igualan utilizando un colorante (ROX) en los tubos. Se basa en el uso de un fluoróforo libre. Las curvas se igualan con el nivel de la meseta al final de la reacción. Reduce los niveles de la meseta a un mismo valor para todas las curvas. Solo puede aplicarse cuando las curvas tienen valores de E idénticos e igual concentración de DNA en los tubos. Métodos de comparación directa de resultados por la forma de la gráfica Utiliza el máximo de la primera y/o segunda derivada. Su ventaja los máximos no cambian ( E constante). Aplicado por LightCycler (Roche). Rebrikov & Trofimov, 2005

34 CRITERIOS ANALÍTICOS EN LA OPTIMIZACIÓN DE LA RT-qPCR La señal fluorescente es proporcional a la cantidad de moléculas de DNA en el tubo de reacción. F=. Nn =. No. En - la fluorescencia residual del colorante - las diferencias en los plásticos - el ruido electrico F=. Nn =. No. En + b + k. n background donde: b : componente constante del background k : componente variable del background Substracción del background Rebrikov & Trofimov, 2005

35 CRITERIOS ANALÍTICOS EN LA OPTIMIZACIÓN DE LA RT-qPCR Substracción del background INCORRECTO CORRECTO Rebrikov & Trofimov, 2005

36 CRITERIOS ANALÍTICOS EN LA OPTIMIZACIÓN DE LA RT-qPCR Selección del valor umbral (threshold) Selección mediante algoritmos complejos o visualmente por el operador. Criterio a menudo dirigido por el equipo y/o software asociado con el equipo: fijar el valor umbral en varias desviaciones estándar por encima de la línea de base media de fluorescencia. Verificar que se alcanza la fase log-lineal de amplificación. Aunque el valor umbral influye en el valor de Ct, el operador se centra principalmente en la discriminación entre valores de Ct.

37 CRITERIOS ANALÍTICOS EN LA OPTIMIZACIÓN DE LA RT-qPCR Resumen Linealidad Coeficiente de correlación (r2) > 0,985 Rango dinámico 5 puntos en diluciones seriadas 1/10 (Variación 8%) Eficiencia 0,95 < E < 1,10 Precisión mínimo de 3 réplicas por punto con SD < 0,167

38 CRITERIOS ANALÍTICOS EN LA OPTIMIZACIÓN DE LA RT-qPCR Especificidad en la amplificación Análisis de curvas de disociación SYBR Green vs EvaGreen EvaGreen EvaGreen SYBR Green Fluorescence (norm) Fluorescence (norm) SYBR Green Threshold: (Noiseband) Baseline settings: automatic, Drift correction OFF Cycle Threshold: (Noiseband) Baseline settings: automatic, Drift correction OFF Cycle

39 CRITERIOS ANALÍTICOS EN LA OPTIMIZACIÓN DE LA RT-qPCR Análisis de curvas de disociación dímeros de cebadores di / dt (%) - di / dt (%) Temperature [ C] 100 Threshold: 100% Threshold: % Temperature [ C] 61 Threshold: 100% Temperature [ C] Temperature [ C] Temperature [ C] Threshold: 100% Temperature [ C] di / dt (%) - di / dt (%) Threshold: 100% di / dt (%) - di / dt (%) Threshold: 100%

40 CRITERIOS ANALÍTICOS EN LA OPTIMIZACIÓN DE LA RT-qPCR Análisis de curvas de disociación optimización de la [cebadores] di / dt (%) - di / dt (%) Temperature [ C] Threshold: 100% Temperature [ C] Temperature [ C] Threshold: 100% Threshold: 100% Threshold: 100% di / dt (%) di / dt (%) Temperature [ C]

41 CRITERIOS ANALÍTICOS EN LA OPTIMIZACIÓN DE LA RT-qPCR Análisis de curvas de disociación especifidad de amplificación di / dt (%) Temperature [ C] Temperature [ C] Temperature [ C] Threshold: 100% di / dt (%) Threshold: 100% di / dt (%) Threshold: 100%

42 CRITERIOS ANALÍTICOS EN LA OPTIMIZACIÓN DE LA RT-qPCR Análisis de curvas de disociación caracterización Subtipo F Subtipo B

43 Relative frequency (%) CRITERIOS ANALÍTICOS EN LA OPTIMIZACIÓN DE LA RT-qPCR Distribución de Valores de Ct de diferentes concentraciones de muestras positivas Distribución de Valores de Ct de muestras negativas Relative frequency (%) PCR cycles Fin de la qpcr PCR cycles

44 DETERMINACIÓN DEL VALOR DE CORTE (Cut-off) EN RT-qPCR Enfoque analítico Protocolo basado en número de ciclos Técnicamente, en la qpcr se utiliza un punto de corte para los valores de Ct al limitar el número de ciclos de amplificación. Por lo cual, aumentos hipotéticos de la señal del último ciclo de la reacción no se detectan y se consideran negativos. El número de ciclos de amplificación se establece en el supuesto de que, si una sola copia del target está presente en la muestra analizada, entonces los amplicones deben ser generados en cantidad suficiente para ser detectados antes del último ciclo. Convencionalmente, los protocolos de RT-qPCR se establece un máximo de 40 ciclos, lo que corresponde a 1012 copias (E = 100%).

45 DETERMINACIÓN DEL VALOR DE CORTE (Cut-off) EN RT-qPCR Enfoque analítico Protocolo basado en el límite de detección Durante el desarrollo se debe determinar el rango operativo lineal del método (rango dinámico). El Límite Inferior de Detección (LID) se define como la mínima concentración de analito detectado a una certeza conocida. Un punto de corte analítico (Ctcut-off) podría ser justificado por la selección de un valor de Ct que corresponde al LID del ensayo. Cualquier valor de Ct por debajo del LID se considerará como no confiable. La Sensibilidad Analítica se define como la dilución a la cual el xx% de las muestras son positivas. Método de la Sensibilidad Analítica experimental: determina la última dilución en serie donde al menos el 95% de las muestras dieron positivas. No se estima la concentración exacta que corresponde al 95% de detección. El factor de dilución utilizado afectará la precisión de la estimación (cuanto menor sea el factor de dilución, más precisa será la estimación). Mínimo de 6 repeticiones por dilución seriada. Método de la Sensibilidad Analítica teórica: utiliza un análisis estadístico basado en un modelo de regresión en el que se estima la dilución exacta que corresponde al 95% de las muestras positivas. Es más sensible al número de repeticiones por cada concentración. El Ctcut-off será el valor de Ct determinado por la SeAt.

46 DETERMINACIÓN DEL VALOR DE CORTE (Cut-off) EN RT-qPCR Enfoque analítico Sensibilidad Analítica experimental 1000 geq/ml Probit regression analysis. Sensibilidad Analítica teórica 831 geq/ml [ geq/ml] con un intervalo de confianza del 95%. Drosten et al, 2001

47 DETERMINACIÓN DEL VALOR DE CORTE (Cut-off) EN RT-qPCR Enfoque epidemiológico Uso de herramientas epidemiológicas para la selección del Ct cut-off : reducción de la probabilidad de clasificación errónea control de los costos asociados a errores de clasificación Precisión Diagnóstica La Sensibilidad Diagnóstica (DSE) se refiere a la probabilidad que el ensayo sea positivo cuando el individuo muestreado esté enfermo/infectado (D+). La Especificidad Diagnóstica (DSP) se refiere a la probabilidad que el ensayo sea negativo cuando el individuo muestreado esté no-enfermo/no-infectado (D-). Índice de Youden (J): expresa la tasa media de éxito del ensayo (diferencia entre la proporción de clasificados correctamente y clasificados incorrectamente) en la población D+ y D-. J = DSE + DSP 1 Si J > 0: el ensayo es de utilidad en discriminar entre D+ y D-. Eficiencia del ensayo (EF): expresa la proporción de muestras clasificadas correctamente y depende de la prevalencia (P) de D+ en la población. EF = P. DSE + (1 P). DSP

48 DETERMINACIÓN DEL VALOR DE CORTE (Cut-off) EN RT-qPCR Enfoque epidemiológico Precisión Diagnóstica Valor Predictivo Positivo (PPV): se refiere a la probabilidad que un individuo sea D+ cuando la muestra es positiva en el ensayo. DSE. P PPV = DSE. P + (1 DSP). (1 P) Valor Predictivo Negativo (NPV): se refiere a la probabilidad que un individuo sea D- cuando la muestra es negativa en el ensayo. DSP. (1 P) NPV = (1 DSE). P + DSP. (1 P) Likelihood Ratio Positivo (LR+): refleja cuanto más probable los individuos D+ son positivos en el ensayo en comparación con los individuos D-. DSE LR+ = (1 DSP) Likelihood Ratio Negativo (LR-): refleja cuanto más probable los individuos D- son negativos en el ensayo en comparación con los individuos D+. (1 DSE) LR- = DSP Diagnostic Odds Ratio (DOR): medida de la exactitud de la prueba de diagnóstico que es igual al cociente de las probabilidades de infección y/o enfermedad en los resultados positivos del ensayo sobre las probabilidades de infección y/o enfermedad en los resultados negativos del ensayo. LR+ DSE / (1 DSE) PPV / (1 PPV) DOR = = = LR(1 DSP) / DSP (1 NPV) / NPV Si DOR > 1: el ensayo es de utilidad ( DOR, utilidad). Si 0 > DOR < 1: los individuos testeados tienen mayor chances de ser clasificados erróneamente por el ensayo.

49 DETERMINACIÓN DEL VALOR DE CORTE (Cut-off) EN RT-qPCR Enfoque epidemiológico Curvas TG-ROC (Two graph Receiver Operating Characteristic) A CD B A C B A: mejor especificidad diagnóstica (DSP) A: mejor LR de un test positivo (LR+) B: mejor sensibilidad diagnóstica (DSE) B: mejor LR de un test negativo (LR-) C: mejor combinación de DSP y DSE C: mejor DOR D: mejor índice de Youden (J)

50 DETERMINACIÓN DEL VALOR DE CORTE (Cut-off) EN RT-qPCR Enfoque epidemiológico Curvas TG-ROC (Two graph Receiver Operating Characteristic) PPVmax NPVmax

51 DETERMINACIÓN DEL VALOR DE CORTE (Cut-off) EN RT-qPCR Enfoque epidemiológico Minimización de la probabilidad de clasificación errónea Un ensayo debe ser validado y certificado de acuerdo a su rendimiento para un propósito específico. Propósito del ensayo Demostración de la ausencia de infección en una población definida. Certificación de libre de infección o la presencia del agente en animales o productos con fines comerciales. Erradicación de enfermedad o eliminación de infección en poblaciones definidas. Confirmar el diagnóstico de casos sospechosos o clínicos. Estimación de la prevalencia de infección o exposición. Probabilidades de clasificación errónea Según los resultados del ensayo Según el status de la infección / enfermedad

52 DETERMINACIÓN DEL VALOR DE CORTE (Cut-off) EN RT-qPCR Enfoque epidemiológico Minimización de la probabilidad de clasificación errónea Considerando las DSP y DSE Demostración de la ausencia de infección en una población definida. Ensayo debe priorizar DSP PPV (A) Certificación de libre de infección en animales o productos con fines comerciales. Ensayo debe priorizar DSE NPV (B) Erradicación de enfermedad o eliminación de infección en poblaciones definidas. Si el agente tiene consecuencias zoonóticas: Ensayo debe priorizar DSE NPV (B) Si el agente tiene consecuencias económicas directas: Ensayo debe priorizar DSP PPV (A) Confirmar el diagnóstico de casos sospechosos o clínicos. Ensayo debe priorizar DSP PPV (A) Estimación de la prevalencia de infección o exposición. Ensayo debe priorizar la mejor combinación de DSP y DSE (C)

53 DETERMINACIÓN DEL VALOR DE CORTE (Cut-off) EN RT-qPCR Enfoque epidemiológico Minimización de la probabilidad de clasificación errónea Considerando las LR+ y LR Selección del Ctcut-off utilizando LR+ Ensayo se ajusta a que la probabilidad de ser clasificado incorrectamente es igual a la probabilidad de ser clasificado correctamente LR+ = 1 DSE = (1 DSP) Ensayo se ajusta a que la probabilidad de ser clasificado correctamente (VP) en comparación con la probabilidad de ser clasificado incorrectamente (FP) es tan grande como sea posible LR+ = máx. (A) Selección del Ctcut-off utilizando LR- Ensayo se ajusta a que la probabilidad de ser clasificado incorrectamente (FN) en comparación con la probabilidad de ser clasificado correctamente (VN) es tan pequeña como sea posible LR- = min. (B) Selección del Ctcut-off utilizando DOR Ensayo se ajusta para maximizar la probabilidad clasificación correcta en comparación con la probabilidad clasificación incorrecta DOR = máx. (C)

54 DETERMINACIÓN DEL VALOR DE CORTE (Cut-off) EN RT-qPCR Enfoque epidemiológico Minimización de la probabilidad de clasificación errónea Considerando los PPV y NPV Selección del Ctcut-off utilizando PPV Ensayo se ajusta a que la probabilidad de clasificación correcta (PPV) es menor que la probabilidad de clasificación incorrecta (1 - PPV), para un dado resultado positivo de la prueba PPV = máx. Selección del Ctcut-off utilizando NPV Ensayo se ajusta a que la probabilidad de clasificación correcta (NPV) es mayor que la probabilidad de clasificación incorrecta (1 - NPV), para un dado resultado negativo de la prueba NPV = máx.

55 Selección Ctcut-off Enfoque Analítico Protocolo basado en número de ciclos Protocolo basado en el Límite de Detección Número limitado de ciclos de reacción Determinación de la Sensibilidad Analítica Experimental o Teórica Enfoque Epidemiológico Estimación de curvas TG-ROC Monitoreo de los cambios de DSE y DSP con el Ct Enfoque basado en la probabilidad de clasificación errónea Dado el resultado del ensayo Dado un resultado positivo (PPV) PPV máximo PPV > 50% Dado un resultado negativo (NPV) NPV máximo NPV > 50% Comparación de clasificación correcta e incorrecta DOR máximo (independiente de la prevalencia) Caraguel et al, 2011 Enfoque basado en Costos Dado el status de infección/enfermedad Priorización del propósito del ensayo DSE DSP DSE & DSP (J) Mejor combinación de DSE & DSP Intersección de las curvas DSE & DSP Comparación de clasificación correcta e incorrecta LR+ máximo LR- mínimo DOR máximo LR+ máximo LR+ o LR- o DOR = 1

56 CUANTIFICACIÓN ABSOLUTA Carga Viral en individuos HIV(+) Metodología disponible

57 CUANTIFICACIÓN ABSOLUTA Detectable pero no cuantificable (Hit rate 50%) Límite de detección cuantitativa (Hit rate 95%) Rango activo de medición 25 cps/ml (~ 14.4 IU/ml) NucliSENS EasyQ HIV-1 v ,000,000 cps/ml ~ 5,700,000 IU/ml 48 cps/ml (~ 27.3 IU/ml) CAP/CTQ HIV-1 Roche 10,000,000 cps/ml ~ 5,700,000 IU/ml m2000 real time Abbott 10,000,000 cps/ml ~ 5,700,000 IU/ml k PCR Versant 11,000,000 cps/ml ~ 6,200,000 IU/ml 40 cps/ml (~ 22.8 IU/ml) 35 cps/ml (~ 21.1 IU/ml) ,000 10, ,000 1,000,000 10,000,000

58 Gracias por su atención Preguntas