Determinación del espermatocrito y efecto del volumen de la dosis seminante sobre la fertilidad en yamú (Brycon amazonicus)

Transcripción

1 14 Rev Col Cienc Pec Vol. 19:2, 26 Determinción del espermtocrito y efecto del volumen de l dosis seminnte sobre l fertilidd en ymú (Brycon mzonicus) Pblo E Cruz-Cslls 1, MVZ, MSc, PhD; Yohn M Velsco-Sntmrí 1, MV; Víctor M Medin-Robles 1, MVZ, cmsc 1 Grupo de Reproducción y Toxicologí de Orgnismos Acuáticos GRITOX, Instituto de Acuicultur, Fcultd de Ciencis Agropecuris y Recursos Nturles, Universidd de los Llnos, A.A. 11, Villvicencio, Met - Colombi. pecruz@telecom.com.co (Recibido: 18 bril, 25; ceptdo: 24 bril, 26) Resumen El ymú (Brycon mzonicus Spix & Agssiz 1829) es un pez omnívoro de rápido crecimiento y crne de lt clidd y ceptción comercil. Pr estndrizr el espermtocrito (SPCTO), 23 muestrs de semen fueron centrifugds 14 g durnte 1, 3, 5, 7 ó 1 min. El tiempo de centrifugción tuvo un efecto significtivo sobre el vlor del espermtocrito (SPCTO) (p<.5). Pr conocer l concentrción espermátic (CE) durnte l époc reproductiv y su relción con el SPCTO, l espermición de 4 mchos fue inducid con extrcto de hipófisis de crp (4. mg.kg -1 ). L CE fue evlud medinte cámr de Neubuer (dilución 1:12) y el SPCTO por centrifugción 14 g durnte 5 min. L relción entre SPCTO y CE fue positiv y ltmente significtiv (y= x; r 2 =.74; p<.1), pero no se observron diferencis estdístics (p>.5) entre los meses evludos (mrzo, bril y myo). Finlmente, pr determinr el efecto del volumen de l dosis seminnte sobre l fertilidd, 2 g de oocitos fueron semindos con 3, 15, 45, 9 o 18 ml de semen (n= 12), cuy CE fue previmente justd pr contener 5 espermtozoides (sptz)/oocito, utilizndo como diluyente plsm seminl homólogo. Los porcentjes de fertilidd fueron 83, 86, 86, 85 y 87%, respectivmente (p>.5). Plbrs clve: concentrción espermátic, dosis seminnte, espermtocrito, ymú. Introducción Brycon es un género de crácidos neotropicles, mplimente distribuido en ls gus continentles desde México hst Argentin (9). Brycon mzonicus (ymú) es un especie ntiv de l cuenc del río Orinoco de Colombi y Venezuel, de hábitos limenticios omnívoros, rápido crecimiento y crne de lt clidd, l cul es ctulmente considerd de importnci económic pr l piscicultur surmericn (14). En tods ls especies nimles, evlur l clidd espermátic es requisito indispensble pr segurr el éxito de l inseminción rtificil y pr monitorer los procedimientos de mnipulción del mteril seminl, tles como su lmcenmiento en fresco y l crioconservción (5). Junto con l movilidd y el tiempo de ctivción, l concentrción espermátic (CE) es un de ls vribles más utilizds pr determinr l clidd seminl en peces (2, 1), l cul consiste en l expresión del número de espermtozoides (sptz) por µl o ml. Vrios procedimientos hn sido utilizdos pr clculr l CE (1, 13), siendo el más común l utilizción del hemocitómetro o culquier otr cámr contdor de prtículs. Sin embrgo, este proceso es lborioso y consume mucho tiempo, lo cul reduce su prcticidd cundo el resultdo de vrios reproductores debe ser conocido en un corto periodo de tiempo.

2 Rev Col Cienc Pec Vol. 19:2, 26 El SPCTO es un procedimiento lterntivo pr medir l CE, el cul h sido utilizdo en peces (11, 13, 17). Vrios utores hn reportdo en lguns especies un relción positiv y estdísticmente significtiv entre el SPCTO y l CE (4, 12); sin embrgo, dich relción no siempre es lt, debido especilmente un deficiente estndrizción de ls condiciones de centrifugción pr l lectur del SPCTO o de l preprción y montje de l cámr de Neubuer (6, 13). En ymú, trbjos previos relizdos en nuestro lbortorio (6) mostrron un bj correlción (r 2 =.3) entre el SPCTO y l CE, por lo tnto es ún necesrio estndrizr ls condiciones de centrifugción pr obtener un empquetmiento espermático eficiente y que permit estblecer un myor relción entre l CE y el SPCTO. Aunque vrios trbjos hn sido relizdos con el propósito de conocer l proporción o número de sptz/ oocito necesri pr un seminción exitos, l informción disponible sobre los efectos del volumen de l dosis seminnte sobre l fertilidd ún no hn sido suficientemente estudidos. Los objetivos del presente trbjo fueron estndrizr l determinción del SPCTO, conocer l CE durnte l estción reproductiv y evlur el efecto del volumen de l dosis seminnte sobre l fertilidd. Mteriles y métodos Fueron utilizdos individuos dultos de ymú de tres ños de edd, sexulmente mduros, cridos y mntenidos en l estción piscícol del Instituto de Acuicultur (IALL) de l Universidd de los Llnos (UNILLANOS), con un peso corporl de 2. y 1.7 kg y un longitud totl de 52. y 49.4 cm, hembrs y mchos respectivmente. En ls hembrs l mdurción finl y l ovulción fueron inducids medinte l dministrción intrmusculr (IM) de 5.75 mg kg -1 de peso corporl de extrcto de hipófisis de crp (EHC, Stoller Fisheries, USA) distribuid en tres plicciones ls (.25 mg.kg -1 ), 24 (.5 mg.kg -1 ) y 36 (5. mg.kg -1 ) hors. L espermición fue estimuld dministrndo 4. mg.kg -1 de EHC, en un sol inyección IM, plicd simultánemente con l segund inyección de ls hembrs. L extrcción de los gmetos fue relizd medinte msje cráneo-cudl del bdomen, 6 7 hors y hors después de l últim inyección de l hormon, en hembrs y mchos, 141 respectivmente. Pr determinr el volumen totl de semen, el mteril seminl fue recolectdo directmente en tubos de vidrio fordos. Pr conocer el peso del desove, los oocitos se colectron en recipientes plásticos limpios y secos, los cules fueron inmeditmente pesdos en un blnz digitl (Scout Pro, Ohus Corportion, Pine Brook NJ. USA). Previo l obtención de los gmetos, los nimles fueron trnquilizdos por inmersión en un solución de 3 ppm de 2- fenoxietnol (Sigm Co, St Louis, Missouri), durnte 3 5 minutos. Inmeditmente después de perdido el eje de ndo, fueron retirdos de l solución nestésic, secdos cuiddosmente en l región bdominl y plicd un leve presión pr provocr l expulsión de orin, heces o bilis, pr reducir el riesgo de contminción de los gmetos. El trbjo comprendió tres experimentos: en el primero se determinó el tiempo de centrifugción necesrio pr obtener lecturs estbles del espermtocrito, efectundo l medición de l proporción del volumen celulr empcdo con relción l volumen totl de l muestr de semen, después de 1, 3, 5, 7 ó 1 min de centrifugción, conservndo un fuerz centrífug constnte de 14 g (12 r.p.m., Microcentrífug Ebb 12, Hettich, Tuttlingen, Alemni). Pr este propósito, se utilizron 23 muestrs de semen y tubos microcpilres de 75. mm de longitud y 1.1 mm de diámetro interno (Brnd, Alemni), los cules fueron llendos (c. 9%) con semen y uno de los extremos selldo con plstilin e inmeditmente sometido centrifugción, de cuerdo con el protocolo descrito nteriormente. En el segundo experimento se estudió l relción entre el espermtocrito y l concentrción espermátic, sí como el vlor de ests vribles durnte l estción reproductiv. El espermtocrito se obtuvo con bse en los resultdos del primer experimento, centrifugndo l muestr de semen 14 g durnte 5 min. El tiempo de cinco minutos de centrifugción fue elegido teniendo como criterio l presenci de menos de 5 espermtozides por cmpo microscópico (4X) en un muestr tomd de l column de plsm seminl. L concentrción espermátic fue clculd medinte l cámr de Neubuer (Bright Line, Optik Lbor, Alemni), contndo los sptz presentes en.2 mm 3, previ dilución (1:12) de l muestr con solución slin fisiológic (.9% NCl). Previo l conteo de ls céluls, l cámr de Neubuer fue mntenid durnte 1 min en un tmósfer húmed. El recuento de ls céluls espermátics fue relizdo con l yud de un

3 142 Rev Col Cienc Pec Vol. 19:2, 26 microscopio óptico (4X). Pr cd muestr, l dilución fue preprd por duplicdo y pr cd un efectudos dos recuentos, el promedio de ls cutro lecturs se utilizó pr los cálculos subsecuentes. L concentrción espermátic fue expresd en millones de sptz por mililitro. Pr determinr l eventul vrición estcionl, los dtos obtenidos fueron clsificdos de cuerdo con el mes de muestreo, el cul comprendió el periodo desde mrzo hst myo de 23. El tercer experimento evluó el efecto del volumen de l dosis seminnte sobre l fertilidd de oocitos de ymú. Pr este propósito, 2 g de oocitos (c. 28) fueron semindos con cinco volúmenes diferentes de semen fresco diluido (n= 12), sí: 3, 15, 45, 9 y 18 µl, cuy concentrción espermátic fue justd pr mntener un relción de número de sptz/oocito (5:1) constnte en todos los csos. Pr justr l concentrción espermátic fue utilizdo plsm seminl de l mism especie, libre de sptz, el cul se obtuvo por centrifugción de muestrs de semen 243 g (5 r.p.m.) durnte 1 min. L ctivción espermátic fue inducid dicionndo l mezcl de semen y oocitos 5 ml de gu corriente. Después de hidrtdos, los oocitos semindos se incubron en recipientes plásticos de 2. L con flujo scendente. L fertilidd fue evlud seis hors postseminción y expresd en porcentje, clculdo prtir del número de oocitos fertilizdos (fse de cierre del blstoporo) sobre un totl de 1. Los porcentjes de fertilidd y de espermtocrito fueron trnsformdos en rcoseno. Los resultdos de est últim vrible y l concentrción espermátic fueron sometidos nálisis de regresión linel. Diferencis entre el espermtocrito y l concentrción espermátic durnte l estción reproductiv y en los tiempos de centrifugción fueron determinds por nálisis de vrinz de un ví (ANOVA). Los resultdos son mostrdos como medi ± error estándr de l medi (SEM). p<.5 fue considerdo significtivo. Pr todos los nálisis estdísticos fue utilizdo el softwre GrphPd Instt v 2.1 ( ) pr Windows. Resultdos L durción de l centrifugción tuvo efecto sobre el vlor del espermtocrito, unque mostrndo diferencis significtivs sólo cundo ls lecturs fueron comprds entre el primer tiempo de centrifugción (1 min) y los cutro tiempos restntes (p<.5). Entre estos últimos (3, 5, 7 y 1 min) no fue observd diferenci significtiv (15.1 ±.8%, 13.8 ±.7%, 13.4 ±.6%, 13. ±.6%, respectivmente) (vése Figur 1); sin embrgo, l centrifugción durnte tres minutos ún permitió detectr un número de espermtozoides por cmpo myor que cinco, mientrs que con 5, 7 y 1 min el plsm se encontró libre de céluls espermátics. Con bse en estos resultdos, un tiempo de centrifugción de cinco minutos 14 g fue considerdo suficiente pr obtener lecturs reles del espermtocrito en est especie. Espermtocrito (%) b b b b Tiempo de centrifugción (min) Figur 1. Efecto del tiempo de centrifugción (14 g) sobre el vlor del espermtocrito en ymú (Brycon mzonicus). Los vlores corresponden l medi ± SEM (n= 23). Brrs con letrs diferentes, difieren estdísticmente (p<.5). Durnte l estción reproductiv evlud, l concentrción espermátic fluctuó entre 4.8 x 1 6 y 14.2 x 1 6 sptz/µl y el espermtocrito entre 6. y 22.4 %. L relción entre ests dos vribles fue positiv y ltmente significtiv (p<.1, r 2 =.74) (vése Figur 2). L tbl 1 muestr ls principles crcterístics seminles, durnte l estción reproductiv de 23. Concentrción (x1 6 sptz/ l) y = x r 2 = Espermtocrito (%) Figur 2. Relción entre el espermtocrito (14 g x 5 min) y l concentrción espermátic determind por medio de cámr de Neubuer, en ymú (Brycon mzonicus) n= 4 (r 2 =.74, p<.1).

4 Rev Col Cienc Pec Vol. 19:2, Tbl 1. Crcterístics seminles de ymú (Brycon mzonicus) durnte l époc reproductiv (mrzo - myo) de 23. Los vlores corresponden l medi ± SEM. Crcterístic seminl Medi ± SEM Volumen (ml) 8.9 ±.5 Movilidd (%) 9 ±.1 Tiempo de ctivción (seg) 42 ± 1 Concentrción (sptz x 1 6.µL -1 ) 9.5 ±.4 Espermtocrito (%) 13.6 ±.6 L concentrción espermátic y el espermtocrito, registrdos durnte l estción reproductiv (mrzo, bril y myo), son ilustrdos en l figur 3. No se observron diferencis significtivs pr ningun de ls vribles (p>.5), cundo se comprron los tres meses evludos. Espermtocrito (%) Espermtocrito Concentrción Mrzo Abril Myo Figur 3. Concentrción espermátic y espemtocrito de reproductores de ymú (Brycon mzonicus) sometidos inducción hormonl (4. mg.kg -1 de EHC ví IM) durnte l estción reproductiv (mrzo myo) de 23. Los vlores corresponden l medi ± SEM. Brrs con letrs igules son estdísticmente igules (p>.5). L figur 4, ilustr los porcentjes de fertilidd de 2 g de oocitos semindos con cinco volúmenes diferentes de dosis seminnte (3, 15, 45, 9 y 18 µl). Pr cd uno de los trtmientos los porcentjes de fertilidd fueron 83, 86, 86, 85 y 87%, respectivmente, sin mostrr diferencis significtivs entre ellos (p>.5). Fertilidd (%) Figur 4. Porcentjes de fertilidd de oocitos de ymú (Brycon mzonicus), semindos con diferentes volúmenes de semen fresco, conservndo constnte l relción del número de sptz/ oocito (5:1). Los vlores corresponden l medi ± SEM. Brrs con letrs igules son estdísticmente igules (p>.5) Volumen de dosis seminnte ( l) (x1 6 sptz/ml) Concentrción Discusión El tiempo de centrifugción influyó sobre l lectur del volumen celulr empcdo, y que los menores tiempos de centrifugción (1 y 3 min) generron un vlor no rel del espermtocrito, debido que ún permitieron l presenci de espermtozoides en l column de plsm seminl. Tvedt et l (18) en Hippoglossus hippoglossus requirieron de un tiempo considerblemente myor (4 min) l determindo en el presente estudio, lo cul fue tribuido principlmente l myor densidd espermátic en est especie y l menor fuerz centrífug utilizd (55 g). Se observó un correlción significtiv entre el espermtocrito y l concentrción espermátic (r 2 =.74, p<.1), lo cul permitirí utilizr l ecución de regresión obtenid como un lterntiv simple y rápid pr estimr l concentrción espermátic en ymú. Aunque un correlción similr hbí sido reportd previmente pr slmónidos (3) y Pirctus mesopotmicus (7), trbjos previos relizdos en ymú (6), revelron un correlción inferior, lo cul fue tribuido un deficiente estndrizción de ls condiciones de centrifugción y l reducido número de muestrs evluds. Considerndo tods ls muestrs recolectds, l concentrción espermátic promedio pr est especie fue de 9.5 x 1 6 ±.4 sptz.µl -1, vlor muy próximo l reportdo por Silveir (15) pr Brycon cephlus. Estudios nteriores relizdos en ymú (6), hbín reportdo un concentrción superior (13.9 ± 4. x 1 6 sptz.µl -1 ); sin embrgo, ést correspondió nimles sin previo trtmiento hormonl, siendo mplimente conocido que l dministrción de Extrcto de Hipófisis de Crp (EHC) en los peces ument el volumen de semen, pero disminuye l concentrción espermátic (19). A pesr que vrios utores hn reportdo clr vrición estcionl en ls crcterístics seminles de diferentes especies de peces (8, 13), los vlores observdos, tnto pr el espermtocrito como pr l concentrción espermátic, no vriron significtivmente. Este hllzgo puede explicrse debido que el período de muestreo coincidió con l époc nturl de myor ctividd reproductiv de l especie (febrero - junio). Por lo tnto, es recomendble relizr un número myor de observciones durnte los meses de febrero y junio, pr considerr posibles vriciones durnte el inicio y el finl de su estción reproductiv. Adicionlmente, unque no fueron

5 144 Rev Col Cienc Pec Vol. 19:2, 26 observdos cmbios estcionles en ests dos vribles dentro de l mism époc reproductiv, recientemente hn sido observds diferencis significtivs entre épocs de diferentes ños (dtos sin publicr). En términos generles, l vrición en los resultdos de ls pruebs de fertilidd puede tribuirse diferencis en l clidd de los gmetos o en ls condiciones de l seminción y/o incubción (16); por lo tnto, l estndrizción del protocolo de seminción es requisito pr relcionr ls crcterístics seminles con l cpcidd fecundnte del semen. El conocimiento del efecto del volumen de l dosis seminnte reviste importnci, prticulrmente cundo se utiliz semen conservdo, y que el costo de lmcenmiento del mteril seminl es directmente proporcionl l volumen de ls dosis conservds. Podrí esperrse que dosis de pequeños volúmenes redujern los porcentjes de fertilidd debido l menor posibilidd de intercción entre los gmetos (16); sin embrgo, en el presente estudio, dosis de 3 µl mostrron porcentjes de fertilidd similres dosis de volumen 6 veces myor. En conclusión, el espermtocrito constituye un lterntiv pr determinr l concentrción espermátic del ymú y puede ser determindo emplendo un fuerz centrífug de 14 g durnte 5 min. Aunque est vrible mostró estr ltmente correlciond con l concentrción espermátic, un número myor de muestrs puede ser necesrio pr umentr est correlción y estblecer posibles vriciones durnte l époc reproductiv. Finlmente, no se observron efectos del volumen de l dosis seminnte sobre el porcentje de fertilidd, lo cul permitirí l formulción de dosis seminntes de pequeño volumen, más fáciles de lmcenr en los contenedores de nitrógeno líquido comerciles. Agrdecimientos Este trbjo contó con el poyo finnciero de COLCIENCIAS y el Instituto de Investigciones de l Orinoquí Colombin (IIOC) - Universidd de los Llnos. Proyecto código: Summry Determintion of spermtocrit nd effect of volume of insemintion dose on fertility in ymú (Brycon mzonicus) Ymú (Brycon mzonicus - Spix & Agssiz 1829) is n omnivorous, fst- growing fish with excellent met qulity, given it commercil importnce. To stndrdize the spermtocrit (SPCT), 23 smples of semen were centrifuged t 14 g during 1, 3, 5, 7 or 1 min. The centrifugtion time hd significnt effect on SPCT vlue (p<.5). With the im to know the sperm concentrtion (SC) throughout the reproductive seson nd its reltionship with the SPCT, 4 mles were treted with crp pituitry extrct (4. mg.kg -1 ). The SC ws evluted by Neubuer chmber (dilution 1:12) nd SPCT by centrifugtion t 14 g during 5 min. The reltionship between SPCT nd SC ws positive nd highly significnt (y= x; r 2 =.74; p <.1), but sttisticl differences were not observed (p>.5) mong the months evluted (mrch, pril nd my). Finlly, to determine the effect of volume of seminnt dose on fertility, 2 g of eggs were seminted with 3, 15, 45, 9 or 18 µl of semen (n= 12). The SC ws previously djusted to contin 5 sptz/egg, using s extender seminl plsm homologous. The fertiliztion rte were 83, 86, 86, 85 nd 87%, respectively (p>.5). Key words: seminnt dose, spermtocrit, sperm concentrtion, ymú. Referencis 1. Brt AN, Dunhm RA. Effects of sperm concentrtion nd egg number on fertiliztion efficiency with chnnel ctfish (Ictlurus puncttus) eggs nd blue ctfish (I. furctus) spermtozo. Theriogenology 1996; 45: Billrd R, Cosson J, Crim LW, Suquet M. Sperm Physiology nd Qulity. In: Bromge NR, Roberts RJ, editors. Broodstock mngement nd eggs nd lrvl qulity. Cmbridge: Blckwell Science; 1995, p Bouck GR, Jcobson J. Estimtion of slmonid sperm concentrtion by microhemtocrit technique. Trns Am Fish Soc 1976; 15:

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