TESIS. Doctor en Ciencias

Transcripción

1 Progrm de Estudios de Posgrdo ESTUDIO DE LA COLONIZACIÓN DE ROCAS POR Mmmillri frilen (Britt. y Rose) Boed. [Cctcee] Y EVALUACIÓN DE LA ASOCIACIÓN CON BACTERIAS ENDÓFITAS EN EL CRECIMIENTO VEGETAL Y SOBRE LA INTEMPERIZACIÓN DE ROCAS TESIS Que pr otener el grdo de Doctor en Ciencis Uso, Mnejo y Preservción de los Recursos Nturles ( Orientción Ecologí ) P r e s e n t Blnc Estel Romero López L Pz, Bj Cliforni Sur, Junio de 2009

2 ACTA DI! UIII!RACION DE TESi8 En l ciudd de L pz. S.C.S., slendo ls ~ hors del di /,,2 del me de JJ V\ i 0 del 2009, se procedlo por los Jo firmntes, mlemros de l Comlsl6n Revisor de Tesls. vlcl pr l Dlrecci6n de Estudios de Posgrdo del Centro de Investigciones Biol6gics del Noroeste. S. C. Ilerr I Tesis de Grdo tituld: Estudlo de Is colonizcion de rocpor Mmmillri frilen (Britt. & Rose) Bed. [CetceeJ y evluci6n de l socicl6n con cterls end6ftl en &1 creclmiento vegetl y sore l intemperizci6n de roes. Presentd por 18 lu...: Blnc EItel. Romero L6pez Asplrnte l Grdo de DOCTOR EN CIENCIAS EN EL USC, MANEJO Y PRESERVACIOH DE LOS RECURSOS NATURALES CON ORiENTACION EN Ecologl Despun de intercml. opiniones los mlemro de I ComisiGn mnifestron su APROBACION DE LA TEStS. en virtud de que stlsfce los requisites.eftldos por ls dlsposlclone reglmentrfs vjgentes. LA COMISION REVISORA Dr. Yov Bshn Co-Dlred:or de tesis {L ~~ 'e&~.jv'~ ~ ~ 1YZ ~ t~jv- 4?~t Or. Clr Tinoco ~~ Co-Tutor Or. Mrf Esther Puente Co..Tutor ej7~ Ph. D. Bernrd T. Bormnn Co-Tutor

3 COMITÉ TUTORIAL Dr. Yov Bshn (Centro de Investigciones Biológics del Noroeste) Co-Director de Tesis Dr. Mcrio Bcilio Jiménez (Centro de Investigciones Biológics del Noroeste) Co-Director de Tesis Dr. Clr Tinoco Ojnguren (Universidd Ncionl Autónom de México) Co-Tutor Dr. Mrí Esther Puente (Centro de Investigciones Biológics del Noroeste) Co-Tutor Ph. D. Bernrd Bormnn (Oregon Stte University) Co-Tutor COMITÉ REVISOR Dr. Yov Bshn Co-Director de Tesis Dr. Mcrio Bcilio Jiménez Co-Director de Tesis Dr. Clr Tinoco Ojnguren Co-Tutor Dr. Mrí Esther Puente Co- Tutor Ph. D. Bernrd Bormnn Co-Tutor JURADO DE EXAMEN DE GRADO Dr. Yov Bshn Dr. Mcrio Bcilio Jiménez Dr. Clr Tinoco Ojnguren Dr. Mrí Esther Puente Dr. José Luís León de l Luz SUPLENTE: Dr. Sr C. Díz Cstro

4 ii RESUMEN Entre ls relciones socitivs de plnts y microorgnismos el endofitismo represent un intercción sinergist con eneficio pr mos orgnismos. En l ctulidd se presume l presenci uicu en los vegetles superiores de ls cteris endófits y se vn encontrndo evidencis de l prticipción de estos microorgnismos en procesos que se creí ern llevdos co exclusivmente por ls plnts. Se hipotetizó que ls cteris endófits pueden representr un ppel importnte en el estlecimiento de plnts en rocs trvés de l promoción del crecimiento vegetl y l intemperizción de rocs. El presente estudio ordó desde enfoques de ecologí vegetl, microiologí y fisiologí vegetl, l importnci de lguns especies colonizdors de rocs, el islmiento, l identificción y crcterizción prcil de l microflor endofític sí como el efecto de su inoculción en l fisiologí de Mmmillri frilen, endémic de l Penínsul de Bj Cliforni. El estudio ecológico de l undnci de especies sxícols resltó l importnci de M. frilen como colonizdor de rocs e indicó que ls vriciones locles de su undnci se sociron con el tipo de roc, proporción de minerles, susceptiilidd l intemperizción y proporción de elementos en ls rocs. Sitios con j undnci de plnts fueron crcterizdos por l presenci de rech volcánic rics en C, Fe, Mg, Ti, Al y Mn, contenidos en minerles moderdmente intemperizles como plgiocls y piroxenos. Sitios con lt undnci de plnts presentron roc tipo riodcits-ndesits rics en minerles más fácilmente intemperizles y elementos como Si, K y N. Se sugiere que l intercción entre elementos, más que el efecto isldo de lguno de ellos puede ser l explicción más vile pr explicr vriciones locles de l undnci de M. frilen. En el enfoque microiológico se confirmó l presenci de cteris endófits de M. frilen trvés de métodos cultivo-dependientes y cultivo-independientes. Se proron diversos esquems de desinfección y medios de cultivo sin otener cteris cultivles en semills, frutos y plántuls. Sin emrgo, utilizndo técnics cultivo-independientes como mplificción del gen 16S rdna, hiridción fluorescente in situ (FISH) y tinción de cteris viles (FDA) se confirmó l presenci de cteris endófits en semills. Ls evidencis culittivs por microscopí electrónic de rrido tmién indicron l presenci de cteris en el interior de semills. Tmién se detectron cteris endófits cultivles en tllo y ríz. De ríz se islron 14 morfotipos cterinos, identificándose por secuencición totl del gen 16S rrna ls ceps Azotocter vinelndii M2Per, Bcillus megterium M1PC, Pseudomons putid M5TSA y Enterocter skzkii M2PFe. En prues in vitro se oservó que A. vinelndii M2Per fue l únic cep fijdor de nitrógeno. L cpcidd pr soluilizr fosftos inorgánicos fue comprod pr P. putid M5TSA, E. skzkii M2PFe y B. megterium M1PC mientrs que A.vinelndii M2Per P. putid M5TSA y B. megterium M2PC degrdron rocs riodcits trvés de l reducción del tmño de ls prtículs de rocs y cmios notles en el ph del medio. A los 3.5 meses de l inoculción con cteris endófits de ríz en plántuls de M. frilen se oservron colonizción y estlecimiento exitosos nivel intrcelulr del tejido vegetl. L inmunoloclizción fluorescente y microscopí electrónic de rrido indicron que l myor densidd cterin ocurre en l ríz y disminuye en sentido cropétlo. Se demostró que l intemperizción de rocs puede celerrse trvés del umento en l movilizción de elementos minerles hci plnts inoculds con cteris endófits. Ls ceps más eficientes en l movilizción de elementos fueron B. megterium, P. putid y E. skzkii. El umento en l movilizción de elementos minerles jo l cción de ls cteris endófits no produjo, en prienci, lgún efecto por toxicidd en ls plnts. En ls intercciones entre inóculos

5 iii y vrintes de sustrto se oservron diverss cominciones de elementos en proporciones vriles, sugiriendo que l movilizción es un proceso complejo que, entre otros fctores, depende de l composición químic de ls rocs, l proporción reltiv y l disponiilidd de los elementos minerles. Los ptrones de movilizción de elementos mostrron un grdo de socición con l undnci de M. frilen colonizndo rocs, siendo el N y P notlemente más movilizdos de ls rocs donde M. frilen crece en undnci, mientrs que el Fe fue myormente movilizdo de ls rocs con muy j undnci. Dd l mpli gm de respuests que presentn ls cctáces nte diferentes condiciones de nutrientes en el sustrto se recomiendn estudios específicos pr definir l función de ctiones como el Si, N y pr explicr l tolernci de ls cctáces elementos como el Cu y Zn que resultn tóxicos pr otrs plnts. El crecimiento de ls plnts crecids en sustrto rocoso fue intensificdo por l inoculción con cteris endófits. L inoculción con E. skzkii M2PFe produjo myor ioms sec en ls plnts mientrs que l inoculción con P. putid M5TSA incrementó significtivmente el nitrógeno totl en ls plnts. Por otro ldo P. putid y A. vinelndii M2Per incrementron l ctividd fotosintétic ví metolismo ácido crsuláceo (CAM). Se propone que el metolismo CAM puede prticipr ctivmente en l disolución de minerles medinte l producción y lierción de ácidos orgánicos como el mlto. Plrs clve: Bcteris endófits, cctáces, colonizción de rocs, intemperizción de rocs, cteris promotors del crecimiento vegetl (PGPB).

6 iv ABSTRACT Among ssocitive interctions etween plnts nd microorgnisms, endophytism represents synergistic interction enefitting oth orgnisms. Endophytic cteri occur in most plnts nd evidence is ccumulting tht endophytes prticipte in processes formerly elieved to e crried out exclusively y plnts. It is hypothesized tht endophytic cteri ply n importnt role in plnt estlishment through promoting plnt growth nd wethering rock. This study explored pproches in plnt ecology, microiology, nd plnt physiology to document the importnce of rock-colonizing plnts, its endophytic microflor, nd the effect of inocultion with endophytic cteri on plnt physiology. We used the smll cctus Mmmillri frilen, n endemic of the Bj Cliforni Peninsul, s model. The ecologicl survey of sxicolous (rock-dwelling) plnts highlighted the importnce of M. frilen s rock-colonizing plnt nd showed tht locl vritions in undnce were ssocited with the type of edrock, minerls, wethering chrcteristics, nd the proportion of elements. Sites with few plnts contin volcnic reccis contining high mounts of C, Fe, Mg, Ti, Al, nd Mn in modertely wetherle minerls, such s plgioclse nd pyroxene. Sites with rocks of rhyodcite, rhyolite, nd ndesite re rich in more wetherle minerls, such s volcnic glss nd minerls contining Si, K, nd N. These results suggest tht interctions of elements, rther thn the isolted effect of specific elements, could e the most relile explntion for locl vritions in the undnce nd dominnce of M. frilen. The microiologicl pproch confirmed tht endophytic cteri re present in M. frilen y using cultivtion-dependent methods nd cultivtion-independent methods. Severl techniques of disinfection nd culture medi were tested nd no culturle cteri were isolted from seeds, fruits, nd seedlings. The occurrence of endophytic non-culturle cteri in seeds ws demonstrted y mplifiction of 16S rdna, fluorescent in situ hyridiztion (FISH), nd vitl fluorescent stining (FDA). Evidence from electron scnning microscopy (SEM) lso indicted nturl occurrence of endophytic cteri in seeds. Culturle endophytic cteri were detected in stems nd roots. Among 14 strins isolted from roots, Azotocter vinelndii M2Per, Bcillus megterium M1PC, Pseudomons putid M5TSA, nd Enterocter skzkii M2PFe were identified y full sequencing of 16S rrna. In vitro tests showed tht only A. vinelndii M2Per is nitrogen fixer. Soluiliztion of inorgnic phosphte ws exhiited in P. putid M5TSA, E. skzkii M2PFe, nd B. megterium M1PC, while A. vinelndii M2Per, P. putid M5TSA, nd B. megterium M1PC degrded ryodcite y reducing the size of rock prticles nd y extensively chnging the ph of the liquid medi. After 3.5 months of inocultion with endophytic cteri of seedlings of M. frilen, intrcellulr coloniztion nd estlishment ws oserved. Fluorescent immuno-locliztion nd SEM showed tht densities of cteril popultions decresed from the root nd stem towrd the picl zones. Results demonstrted tht rock wethering is ccelerted y incresing moiliztion of elements to the plnts inoculted with endophytic cteri. The most efficient strins in moilizing elements to plnts were B. megterium M1PC, P. putid M5TSA, nd E. skzkii M2PFe. Incresed moiliztion did not seem to produce toxic effects in plnts inoculted with endophytic cteri. Among interctions etween inoculnts nd rock sustrtes, there were severl comintions of elements moilized to plnts t vrile proportions tht suggested tht moiliztion is complex process tht depends on chemicl composition of rocks nd vilility of elements nd their reltive proportion. Ptterns of element moiliztion showed ssocition to the undnce of M. frilen in the wild. N nd P were more moilized from rocks where low undnce of plnts occurred while Fe ws higher in plnts grown on rock sustrte with low

7 v undnce of plnts. Given the wide rnge of responses of ccti to different nutrient conditions of sustrtes, specific studies intended to define the role of ctions, such s Si nd N nd to explin the tolernce of ccti to elements, such s Cu nd Zn, tht re toxic for most plnts should e preformed. Inocultion with E. skzkii M2PFe incresed the dry weight of plnts, while P. putid M5TSA incresed totl nitrogen of plnts. P. putid M5TSA nd A. vinelndii M2Per enhnced photosynthetic ctivity through crssulcen cid metolism (CAM). We suggest tht orgnic cids, such s mlte, produced during CAM my ctively prticipte in dissolving minerls. Key words: Endophytic cteri, ccti, coloniztion of rock, wethering of rock, plnt growthpromoting cteri (PGPB).

8 vi DEDICATORIA Al Dr. C.Y. Li Por el invlule poyo que me rindó después de su retiro como investigdor Por su ejemplr clidd humn * * * * * * * * * * *

9 vii AGRADECIMIENTOS Al Consejo Ncionl de Cienci y Tecnologí por l Bec con registro y por el poyo de l ec pr formción de doctores (periodo 2006). Al Centro de Investigciones Biológics del Noroeste por ls fciliddes otorgds. Al finncimiento de los proyectos, CONACYT-2002-C Reforestción del Desierto: El rol de los microorgnismos del suelo y roc y de ls isls de recursos en el estlecimiento de plnts pr l resturción de áres perturds, CONACyT Z Phytostiliztion of mine in northwestern México: The role of plnt soil microe interctions y CONACYT U43069-Z Mitigción del estrés slino en plnts de chile utilizndo cteris promotors del crecimiento vegetl y compost. A mi comité tutoril, Dr. Yov Bshn y Dr. Mcrio Bcilio Jiménez (co-directores), Dr. Clr Tinoco Ojnguren, Dr. Mrí Esther Puente y Dr. Bernrd Bormnn (tutores). Al Dr. Yov Bshn, por comprtirme su mpli visión como investigdor, por rindrme l oportunidd de vencer retos. Al Dr. Mcrio Bcilio Jiménez por ser constnte guí y poyo durnte l relizción de est tesis, por su poyo en cmpo y lortorio. Por su preocupción constnte en mi desempeño cdémico y humno. A l Dr. Clr Tinoco Ojnguren por su mle disposición pr despejr culquier dud, por dr orden mis ides. A l Dr. M. Esther Puente, por comprtirme su experienci en el tem de cteris endófits y su prticipción en el proceso de intemperizción, por su cordil entusismo y poyo pr l culminción de est tesis. Al Dr. Bernrd Bormnn por su poyo pr l relizción de l estnci de investigción en l Universidd Esttl de Oregon- USDA, Estción del Noroteste del ño 2006 l ño Al Dr. Li, por rindrme poyo logístico y sesorí durnte el desrrollo estnci de investigción en l Universidd Esttl de Oregon (OSU)-USDA durnte el ño 2006 l A l Dr. Zsuzsnn Blogh-Brunstd (Universidd Esttl de Wshington, USA) por su desinteresd prticipción en l relizción de los nálisis minerlógicos y micronálisis de rocs por fluorescenci de Ryos-X. A técnico Al Soeldner de l Universidd por su sesorí y entrenmiento técnico pr el uso del microscopio electrónico de rrido.

10 viii Al Dr. Michel Holmes por su entrenmiento en l relizción de l tinción fluorescente pr cteris viles. A Kthy Cook del Deprtmento de Botánic y Fitoptologí (OSU), por su invlule poyo durnte l ejecución técnics histológics, por su confinz y simptí. A l Dr. Lynd Ciuffetti del Deprtmento de Botánic y Fitoptologí (OSU) por ls fciliddes pr el uso del microscopio epifluorescente. A Viol Mnning del Deprtmento de Botánic y Fitoptologí (OSU) por vlios guí en l ejecución de l inmunotinción de cortes histológicos de plántuls. Al técnico Brett Morrisette por su poyo logístico durnte l relizción de l estnci de investigción en l Universidd Esttl de Oregon- USDA. A l Dr. Teres Terrzs del Colegio de Posgrdudos por rindrme ls fciliddes durnte l relizción de l estnci en el menciondo instituto y por el entrenmiento técnico pr l relizción de cortes histológicos en prfin y plástico. A l Dr. Luz Estel de Bshn por su vlios yud en l extrcción de DNA cterino de semills, por su sesorí en l relizción de l técnic de hiridción fluorescente in situ y por sus comentrios l presente escrito. Al Dr. Amury Cordero Tpi, responsle del Bioterio del CIBNOR por su sesorí pr l otención de nticuerpos policlonles. Por su constnte poyo y mistd. Al Técnico Ariel Villcort, responsle del lortorio de Microscopí Electrónic por su sistenci en l úsqued de cteris endófits en semills y plántuls. Por su pciente poyo pr l relizción de micronálisis por Ryos-X. Al Técnico Budilio Acost por su cordil poyo en los nálisis químicos por espectrofotometrí de sorción tómic. Al Técnico René Reollr del lortorio de Cromtogrfí por su poyo en l determinción de reducción de cetileno A l Técnico Soni Roch y personl del lortorio de Bromtologí por su poyo en l determinción de Nitrógeno totl en plnts. Al Dr. Med y l técnico Armndo Monge Q. del lortorio de ecofisiologí de orgnismos cuáticos por ls fciliddes otorgds pr l determinción de número de prtículs de roc.

11 ix A l M. en C. Crmen Rodríguez responsle del lortorio de histologí del CIBNOR, por su guí pr l otención de cortes histológicos en prfin. Al M. en C. Jun Plo Hernández por su poyo técnico y logístico durnte el desrrollo de est tesis. A l técnico M. en C. Ptrici Vázquez por su poyo en cmpo pr l recolección de semills 2008 y por su colorción en l cosech de plántuls. Al técnico Bernrdo Slzr por su poyo en cmpo pr ls mediciones de plnts en cmpo. A Joel Hirles del Deprtmento de Geologí de l Universidd Autónom de Bj Cliforni Sur, L Pz, B.C.S., México por su poyo en l identificción de rocs. A mis entrñles compñers Aly y Chio por su poyo en l minucios cosech de plnts. A Chio, por su poyo en cmpo. A los compñeros que me sistieron durntes sus estncis profesionles, Lirio, Emmnuel, Enrique y Liz. A mi fmili, en especil mi esposo Alfonso Medel por su solidrio poyo y motivción pr culminr est tesis. A mis pdres Mrth López y Fernndo Romero por estr en mi vid. A mis hermnos Georgin y Alejndro, mis cuñdos y sorinos, por poyrme l distnci. A l memori de mi hermno Dvid, por permnecer conmigo. A mis tíos y fmil en generl por estr l tnto de mi formción cdémic. A Luis por motivrme y estr siempre l tnto de mí. A ls persons que me poyron en diverss forms, Luren e In Courter por hcerme prte de su fmili durnte mi estnci en Corvllis, OR. A Cludi y Frnciso por su poyo. En generl l grupo de Microiologí mientl. A los que hn comprtido su conocimiento desinteresdmente.

12 x CONTENIDO INTRODUCCIÓN GENERAL... 1 CAPÍTULO I... 3 Plnts colonizdors de rocs: Aundnci de Mmmillri frilen (Britt. & Rose) Boed. [CACTACEAE] en relción con el tipo y composición de ls rocs en el sur del Desierto Sonorense ANTECEDENTES JUSTIFICACIÓN OBJETIVOS Ojetivo generl Ojetivos específicos HIPÓTESIS MÉTODOS Rsgos otánicos del viejito M. frieln (Britt. & Rose) Boed Áre de estudio Aspectos geológicos y litológicos Vegetción Sitios de estudio Mediciones de undnci Identificción de los tipos de rocs Análisisis minerlógico Composición de elementos en ls rocs Efecto del NCl en l supervivenci de plántuls de M. frilen Análisis estdístico ) Importnci de ls plnts colonizdors de rocs ) Vrición espcil de l undnci ) Vrición espcil de l composición químic de rocs en los sitios de estudio ) Correlción de l undnci de plnt y l composición químic del sustrto ) Efecto del NCl en l supervivenci de plántuls de M. frilen RESULTADOS Importnc reltiv de ls plnts colonizdors de rocs Vriciones espciles en l undnci de M. frilen Litologí y minerlogí Vrición espcil de l composición químic de rocs en los sitios de estudio Correlcion entre l undnci de M. frilen y l composición químic de ls rocs Efecto del NCl en l supervivenci de plántuls de M. frilen DISCUSIÓN CONCLUSIONES PARCIALES CAPÍTULO II Bcteris endófits de M. frilen: Inoculntes con cpcidd pr promover el crecimiento vegetl y/o degrdr rocs ANTECEDENTES El término endófito Definición de cteris endófits Evolución de ls relciones endofítics Ls semills como fuente de endófits Vís de entrd y proceso de colonizción de ls cteris endófits Espectro cteris endófits y especies vegetles Niveles de undnci de cteris endófits cultivles Procedimientos pr l detección, islmiento y cultivo de cteris endófits... 51

13 Técnics de desinfección superficil pr otención de cteris endófits Cultivo del mteril vegetl en medio de cultivo Detección de cteris endófits por métodos cultivo-independientes Aplicciones de ls cteris endófits Bcteris Promotors del Crecimiento Vegetl (PGBP) y cteris degrddors de rocs JUSTIFICACIÓN OBJETIVOS Ojetivo Generl Ojetivos específicos HIPÓTESIS MÉTODOS Otención de ncos de semill Detección, cuntificción y islmiento de cteris endófits de tllos, ríces, frutos y semills de M. frilen Endófits cultivles de frutos y semills Bcteris endófits cultivles de frutos Bcteris endófits cultivles de semills Bcteris endófits cultivles de plántuls Presenci nturl de cteris endófits no-cultivles en semills de M. frilen Bcteris endófits no-cultivles de semills Detección y cuntificción de cteris viles en semill por tinción fluorescente Detección de cteris por Hiridción fluorescente in situ (FISH) Detección de cteris endófits de semill por Microscopí electrónic de rrido (MEB) Detección de cteris endófits de semill por mplificción del 16 sdna Bcteris endófits cultivles de tllos de plnts dults Bcteris endófits cultivles de ríces de plnts dults Higienizción de ríces Identificción de ls cteris endófits de M. frilen Evlución del potencil de ls cteris islds como PGPB (prues de soluilizción de fosftos de Clcio y fijción de Nitrógeno) ) Aislmiento de ceps cterins de endófits cultivles de M. frilen con potencil pr fijr nitrógeno...75 ) Reducción de cetileno por cteris endófits de ríz c) Prues de remoción de fosftos inorgánicos de clcio c.1) Análisis estdístico d) Degrdción de rocs por cteris endófits de M. frilen d.1) Análisis estdístico RESULTADOS Detección, cuntificción y islmiento de cteris endófits de tllos, ríces, frutos y semills de M. frilen Endófits cultivles de frutos y semills Bcteris endófits cultivles de frutos Bcteris endófits cultivles de semills Bcteris endófits cultivles de plántuls Presenci nturl de cteris endófits no-cultivles en semills de M. frilen Detección y cuntificción de cteris viles en semill por tinción fluorescente Detección de cteris por Hiridción fluorescente in situ (FISH) Detección de cteris endófits de semill por Microscopí Electrónic de Brrido Detección de cteris endófits de semill por mplificción del 16 sdna Bcteris endófits cultivles de tllos de plnts dults Bcteris endófits cultivles de ríces de plnts dults Identificción de ls cteris endófits de M. frilen Evlución del potencil de ls cteris islds como PGPB xi

14 xii Aislmiento de ceps cterins de endófits cultivles de M. frilen con potencil pr fijr nitrógeno Reducción de cetileno por cteris endófits de ríz Remoción de fosftos inorgánicos de clcio por cteris endófits de ríz Degrdción de rocs por cteris endófits de M. frilen ) Efecto de l inoculción de cteris endófits de M. frilen en el ph del medio conteniendo roc pulverizd en suspensión ) Dinámic polcionl de ls polciones de endófits de M. frilen incuds en medio líquido con roc pulverizd c) Efecto de ls cteris endófits de M. frilen en el número de prtículs de roc pulverizd en suspensión DISCUSIÓN Presenci nturl de cteris endófits en l cctáce M. frilen Bcteris endófits cultivles de M. frilen con potencil pr fijr nitrógeno Degrdción de rocs riodcit por cteris endófits de M. frilen y soluilizción de fosftos inorgánicos CONCLUSIONES PARCIALES CAPÍTULO III Efecto de l inoculción con cteris endófits en l intemperizción de ls rocs y en el crecimiento de M. frilen ANTECEDENTES Bcteris endófits promotors del crecimiento vegetl Mecnismos iológicos prticipntes en l intemperizción de rocs OBJETIVOS Ojetivo generl Ojetivos prticulres HIPÓTESIS MÉTODOS Efecto de ls cteris endófits en l ioms y en l movilizción de elementos minerles hci M. frilen Diseño experimentl Preprción del sustrto Otención de plántuls Trsplnte y climtción de ls plnts l inverndero Inoculción Determinción de producción de ioms de plnts de M. frilen Análisis estdístico Determinción de l proporción reltiv de elementos minerles en plnts Análisis estdístico Loclizción de ls cteris endófits inoculds en plnts de M. frilen y su distriución dentro de ls plnts Desinfección superficil de plnts pr detección de cteris endófits reintroducids Cpcidd de colonizción y estlecimiento de ls cteris endófits inoculds en plnts de M. frilen Conteo de cteris endófits reintroducids en plántuls de M. frilen Preprción de plnts pr loclizción de cteris endófits por microscopí electrónic de rrido Purificción de nticuerpos pr inmunoloclizción de cteris endófits Preprción histológic de plnts pr inmunoloclizción fluorescente de cteris endófits reintroducids en M. frilen Inmunotinción fluorescente de secciones de plnts con cteris endófits Inmunoloclizción de cteris por microscopí confocl y microscopí epifluorescente Efecto de l intercción cteris endófits en el crecimiento de plnts de M. frilen

15 xiii Diseño del experimento Preprción del sustrto y diseño de cámrs de crecimiento Otención de plántuls Inoculción Efecto de cteris endófits en l ctividd fotosintétic de plnts M. frilen Determinción de l cidez titulle en tejido fresco de plnts de M. frilen Análisis estdístico Efecto de l intercción cteris endófits en l producción de nitrógeno Análisis estdístico RESULTADOS Movilizción de minerles hci M. frilen como resultdo de su socición con cteris endófits Efecto de los inoculntes cterinos en plnts crecids en perlit y regds con solución nutritiv Efecto de los inoculntes cterinos en plnts crecids en condiciones deficientes de nutrientes Efecto de los inoculntes cterinos en plnts crecids en roc riodcit Efecto de los inoculntes cterinos en plnts crecids en roc de rech volcánic Ptrones de movilizción de elementos minerles en sustrtos donde vrí l undnci de M. frilen en su háitt nturl Efecto de l inoculción de cteris endófits de ríz de M. frilen en l producción de ioms de plnts crecids en sustrto con roc Loclizción de ls cteris endófits inoculds en plnts de M. frilen Cpcidd de colonizción y estlecimiento de ls cteris endófits inoculds en plántuls de M. frilen Efecto de cteris endófits en el crecimiento de M. frilen Efecto en l ctividd fotosintétic de M. frilen Efecto en l producción de nitrógeno totl en plnts DISCUSIÓN Colonizción y estlecimiento de cteris endófits reintroducids en M. frilen Efecto de ls cteris endófits como potenciles promotors del crecimiento vegetl Efecto en l producción de ioms Efecto en l ctividd fotosintétic Efecto en el nitrógeno totl en plnts Efecto de l inoculción con cteris endófits en l movilizción de elementos de rocs pr l intemperizción de rocs Prticipción de los exuddos rdicles en l intemperizción de rocs pr l formción de suelos CONCLUSIONES FINALES LITERATURA CITADA

16 xiv LISTA DE FIGURAS Fig. 1. Fisonomí del viejito Mmmillri frilen... 7 Fig. 2. Uicción de los sitos de estudio. Izquierd mcroloclizción del áre de estudio. Derech, uicción de los sitios A, B y C sore lders de cerros dycentes Fig. 3 Indice de Vlor de Importnci (IVI). El IVI es el resultdo de l sum de l dominnci reltiv y l frecuenci reltiv, el máximo vlor posile pr un especie es Fig. 4 () Fisonomí de ls plnts creciendo sore rocs en el sitio A (ls flechs indicn conglomerdos de M. frilen), () M. frilen creciendo sore roc ndesitic, (c) Ríces expuests de M. frilen ls cules pueden ser oservds después de l remoción de frgmentos de roc Fig. 5 Rocs volcánics crcterístics en los sitios de estudio. Ls flechs indicn los individuos de M. frilen. () Sitio A, compuesto por rocs Providenci Riodcit. () Sitio B compuesto por rocs Providenci Riodcit. (c) Sitio C compuesto primordilmente de rech ndesític. RD=Providenci Riodcit, VB=Brech Volcánic Fig. 6 Análisis de Componentes Principles. () Ordención de sitios de estudio. Los ovlos representn ptrones de grupmiento denomindos 1 y 2, A1 A10, B1 B10, o C1 C10 indicn uniddes de muestreo ( ) en el Sitio A, B, o C, respectivmente. () Ordención de elementos sd en sus pesos (lodings) en cd Componente Principl Fig. 7 Concentrción de elementos en los Sitios A, B y C con comprciones pr: () Sílice, () luminio, (c) fierro, (d) mngneso, (e) clcio y (f) mgnesio. Ls columns mrcds con letrs minúsculs diferentes indicn diferencis significtivs (p<0.05) (comprción Tukey). Se present l medi ±ES (N=30) Fig. 8 Concentrción de elementos en los Sitios A, B y C con comprciones pr () Sodio, () Potsio, (c) Fósforo, (d) Titnio, (e) Vlor cumultivo pr los mcronutrientes K+P, (f) Vlor cumultivo pr fierro+mngneso+clcio+mgnesio y (g) Vlor cumultivo pr elementos tóxicos: luminio+zinc+core+niquel. Ls columns mrcds con letrs minúsculs diferentes indicn diferencis significtivs (p<0.05, comprción Tukey, N=30) Ls rrs indicn error estándr (ES). Ausenci de rrs indic que ES insignificnte Fig. 9 Efecto del NCl en l superviveci de plántuls de Mmmillri frilen. () Curvs de supervivenci, () Prue de comprción de medis Tukey pr ls curvs de supervivenci l finl del experimento (semn cutro). Vlores de supervivenci en cd semn (Fig. 9) señldos con diferentes letrs minusculs expresn diferencis significtivs determinds por ANOVA de un vi y prue Tukey (p<0.05). Columns con letrs minusculs diferentes indicn diferencis significtivs determinds por ANOVA de un vi y comprción Tukey (p<0.05). Brrs indicn Error Estándr (ES) Fig. 10. Tinción de cteris endófits viles teñids por el método de tinción fluorescente con dicetto de fluorescein (FDA) Fig. 11. Microgrfí de epifluroescenci pr l detección de cteris endófits de semills de M. frilen. Ls semills fueron desinfectds superficilmente y se les retiró l test. El tejido interno se presionó hst formr un delgd cp y posteriormente se sometió hiridción fluorescente in situ FISH utilizndo l sond EUB338 pr el dominio Bcteri y el fluorocromo CY3. ) Tejido vsculr (ls flechs indicn los cuerpos de ls cteris y l orgnizción del tejido vsculr) de l semill previo l germinción, ) Tejido del interior de l semill los 8 dís de imiición. Escl de referenci: 5 µm Fig. 12. Microgrfí de Microscopí Electrónic de Brrido del interior de l semill de M. frilen. Ls semills fueron desinfectds superficilmente y se les retiró l test. El tejido interno se presionó hst formr un delgd cp. ) Oservción en fresco de semill sin test presiond mecánicmente hst formr un delgd cp de tejido. L semill con test mide proximdmente 0.5 mm, ) y d) Tejido del interior de l semill (sin test) los 8 dís de imiición de l semill. Se señln cteris en form cilr expuests sore un memrn que cure internmente l semill. Est muestr fue procesd previmente por FISH, c) Tejido interno de l semill los 8 dís de imiición de l semill. Osérvese l form cilr de l cteri. Est muestr fue procesd previmente por FISH. 85

17 Fig. 13. Imgen de un gel de gros l 2% en el que se muestr l presenci del 16S rdna cterino. Crril 1=Mrcdor GeneRuler 100 p DNA, crriles 2, 3, 4=Amplificdo del 16S rdna cterino utilizndo los primers 518 F, 1070, 5= Blnco (H 2 O) Fig. 14. Soluilizción de CPO 4 in vitro por cteris endófits de M. frilen. ANOVA (F= 30.77; p<0.0001) y comprción Tukey pr CPO 4 (mg L -1 ) de medio líquido Pikosky después de 30 dís de incución. Columns denotds con diferentes letrs minúsculs indicn diferencis significtivs (p<0.05) en el fósforo soluilizdo por cultivo. Ls rrs indicn Error estándr (SE), l usenci de rr indic SE insignificnte. El número rri de cd column expres l eficienci de soluilizción de fósforo por unidd formdor de coloni (UFC) (mg de P 2 O 5 UFC). El eje secundrio del eje Y indic el Log de UFC (uniddes formdors de coloni) socids l vlor de soluilizción por morfotipo. El vlor de UFC pr el trtmiento sin cteri prece grficdo con vlor 0 indicndo usenci de cteris Fig. 15. Curvs de vrición del ph del medio líquido con roc pulverizd e inoculdo con diferentes endófits de M. frilen. * Trtmientos control Fig. 16. Vrición del ph del medio liquido con roc pulverizd e inoculdo con diferentes endófits de M. frilen. Los vlores son el resultdo de l diferenci entre el vlor inicil y el finl ponderdo respecto l trtmiento sin cteri. Letrs minúsculs diferentes indicn diferencis significtivs entre trtmientos * Trtmientos control Fig. 17. Vrición de ls polciones de endófits de M. frilen incuds en medio líquido con roc pulverizd durnte 32 dís. Los trtmientos control se encuentrn mrcdos con sterisco. El trtmiento sin cteris no mostró crecimiento en el medio Fig 18. Reducción del tmño de prtículs de roc en suspensión por cteris endófits de M. frilen. Letrs minúsculs diferentes indicn diferencis significtivs (p 0.05) entre el número de prtículs del tiempo inicil y el tiempo finl comprdos medinte l prue t-student. Los vlores rri de cd column indicn el porcentje ruto de umento en el número de prtículs respecto l trtmiento sin cteris, por lo tnto vlores negtivos indicn porcentjes menores que el trtmiento no inoculdo. Ls rrs representn el error estándr (SE). Ausenci de rr represent SE insignificnte Fig. 19. Distriución verticl de prtículs de sustrto en ls mcets y diseño de microcámrs de crecimiento Fig. 20. Otención de plántuls superficilmente estériles y su trsplnte cámrs de crecimiento xénics. ) Plántuls de un mes de edd creciendo en gr nutritivo l 1%, ) Plántuls trnsplntds perlit los 2.5 meses de edd Fig. 21. Cámrs de crecimiento utilizds pr determinr el efecto de l intercción cteris endófitsplnts en el crecimiento de M. frilen. ) Cjs Petri de poliestireno (23cm 23cm 1cm) constituyeron microcámrs de crecimiento. ) Visulizción de ls plnts en el interior de ls cjs Petri Fig. 22. Efecto de l intercción plnt-endófits en l movilizción de elementos minerles del sustrto hci ls plnts M. frilen crecids en perlit enriquecid con solución nutritiv Hoglnd l 10%. ANOVA de un ví (p<0.05) y comprción de Tukey (α=0.05) entre trtmientos de inóculos. Letrs minúsculs diferentes indicn diferencis significtivs entre trtmientos de inóculo Fig. 23. Efecto de l intercción plnt-endófits en l movilizción de elementos minerles del sustrto hci ls plnts de M. frilen crecids en riodcit + perlit. ANOVA de un ví (p<0.05) y comprción de Tukey (α=0.05) entre trtmientos de inóculos. Letrs minúsculs diferentes indicn diferencis significtivs entre trtmientos de inóculo Fig. 24. Efecto de l intercción plnt-endófits en l movilizción de elementos minerles del sustrto hci plnts de M. frilen crecids en rech volcánic + perlit. ANOVA de un ví (p<0.05) y comprción de Tukey (α=0.05) entre trtmientos de inóculos. Letrs minúsculs diferentes indicn diferencis significtivs entre trtmientos de inóculo Fig. 25. Efecto de l intercción plnt-endófits en l movilizción de elementos minerles del sustrto hci plnts de M. frilen crecids en perlit. ANOVA de un ví (p<0.05) y comprción de Tukey (α=0.05) entre trtmientos de inóculos. Letrs minúsculs diferentes indicn diferencis significtivs entre trtmientos de inóculo xv

18 Fig. 26. Movilizción de Al, K, Si y Mg hci ls plnts por efecto de l intercción de l endófit Pseudomons putid y M. frilen jo cutro diferentes sustrtos. ANOVA de un ví (p<0.05) y comprción de Tukey (α=0.05) entre trtmientos de inóculos. Letrs minúsculs diferentes indicn diferencis significtivs entre trtmientos de inóculo. L column de l izquierd viene como referenci de l Fig Fig. 27. Movilizción de P hci ls plnts por efecto de l intercción de ls endófit Pseudomons putid o Bcillus megterium y M. frilen jo cutro diferentes sustrtos. ANOVA de un ví (p<0.05) y comprción Tukey (α=0.05) entre trtmientos de inóculos. Letrs minúsculs diferentes indicn diferencis significtivs entre trtmientos de inóculo. L column de l izquierd viene como referenci de l Fig Fig. 28. Movilizción de Cu hci ls plnts por efecto de l intercción de ls endófit Enterocter skzkii y M. frilen jo cutro diferentes sustrtos. ANOVA de un ví (p<0.05) y comprción Tukey (α =0.05) entre trtmientos de inóculos. Letrs minúsculs diferentes indicn diferencis significtivs entre trtmientos de inóculo. L column de l izquierd viene como referenci de l Fig Fig. 29. Movilizción de N hci ls plnts por efecto de l intercción de ls endófit Bcillus megterium y M. frilen jo cutro diferentes sustrtos. ANOVA de un ví (p<0.05) y comprción de Tukey (α=0.05) entre trtmientos de inóculos. Letrs minúsculs diferentes indicn diferencis significtivs entre trtmientos de inóculo. L column de l izquierd viene como referenci de l Fig Fig. 30. Movilizción de C hci ls plnts por efecto de l intercción de ls cteris Pseudomons putid, Bcillus megterium, Bcillus pumilus ES4 y Enterocter skzkii con M. frilen jo cutro diferentes sustrtos. ANOVA de un ví (p<0.05) y comprción Tukey (α=0.05) entre trtmientos de inóculos. Letrs minúsculs diferentes indicn diferencis significtivs entre trtmientos de inóculo. L column de l izquierd viene como referenci de l Fig Fig. 31. Movilizción de N hci ls plnts por efecto de l intercción de ls endófit Bcillus megterium y M. frilen jo cutro diferentes sustrtos. ANOVA de un ví (p<0.05) y comprción Tukey (α = 0.05) entre trtmientos de inóculos. Letrs minúsculs diferentes indicn diferencis significtivs entre trtmientos de inóculo. L column de l izquierd viene como referenci de l Fig Fig. 32. Movilizción de Al, Cu, N y C hci ls plnts por efecto de l intercción de ls endófit Bcillus megterium y M. frilen jo cutro diferentes sustrtos. ANOVA de un ví (p<0.05) y comprción Tukey (α=0.05) entre inoculntes. Letrs minúsculs diferentes indicn diferencis significtivs entre trtmientos de inóculo. L column de l izquierd viene como referenci de l Fig Fig. 33. Movilizción de Si hci ls plnts por efecto de l intercción de ls endófit Azotocter vinelndii y M. frilen jo cutro diferentes sustrtos. ANOVA de un ví (p<0.05) y comprción Tukey (α =0.05) entre trtmientos de inóculos. Letrs minúsculs diferentes indicn diferencis significtivs entre trtmientos de inóculo. L column de l izquierd viene como referenci de l Fig Fig. 34. Movilizción de N hci ls plnts por efecto de l intercción de ls endófit Enterocter skzkii y M. frilen jo cutro diferentes sustrtos. ANOVA de un ví (p<0.05) y comprción Tukey (α =0.05) entre trtmientos de inóculos. Letrs minúsculs diferentes indicn diferencis significtivs entre trtmientos de inóculo. L column de l izquierd viene como referenci de l Fig Fig. 35. Efecto de l producción de ioms de plnts de M. frilen inoculds con cteris endófits y crecids en cutro diferentes sustrtos. ANOVA de un ví (p<0.05) y comprción Tukey (α=0.05). Letrs minúsculs diferentes indicn diferencis significtivs entre trtmientos de inóculo Fig. 36. Ejemplo de colonizción endofític de Pseudomons putid en plnts de M. frilen después de 3.5 meses de l inoculción. El ptrón de distriución mostró un myor densidd cterin en l se del tllo y ríz, nivel intrcelulr en epidermis y primers cps del clorénquim (tllo). ) Microgrfí epifluorescente, ) y d) Microgrfis otenids por Microscopí Confocl Fluorescente, c) Microgrfí de Microscopí Electrónic de Brrido. El resto de ls ceps inoculds mostrron un ptrón de distriución semejnte xvi

19 xvii Fig. 37. Cpcidd de colonizción y estlecimiento de cteris endófits después de 3.5 meses de inoculción en plnts de M. frilen crecid en sustrtos de roc. Los trtmientos control se indic con signo + pr ls ceps control positivo PGPB y con signo pr el control negtivo. Letrs minúsculs diferentes indicn diferencis significtivs entre trtmientos (ANOVA p<0.001, Tukey α=0.05) Fig. 38. Incremento de cidez nocturn (cidez nocturn menos cidez diurn) por efecto de l intercción cteris endófits y plnts de M. frilen crecids en roc riodcit. Los trtmientos control se indic con signo + pr l cep control positivo PGPB y con signo pr los controles negtivos. Letrs minúsculs diferentes indicn diferencis significtivs entre trtmientos (ANOVA de un ví p= y Tukey α=0.05) Fig. 39. Nitrógeno totl (%) por efecto de l intercción cteris endófits y plnts de M. frilen crecids en roc riodcit. Los trtmientos control se indic con signo + pr l cep control positivo PGPB y con signo pr los controles negtivos. Letrs minúsculs diferentes indicn diferencis significtivs entre trtmientos (p=0.04, Tukey α=0.05)

20 xviii LISTA DE TABLAS Tl 1 Prue no prmetric de Dunn pr comprciones múltiples respecto l volumen de M. frilen en tres sitios de estudio (p 0.05) Tl 2 Composicón minerl de ls rocs en los tres sitios de estudio Tl 3 Concentrción elementl de ls rocs en los tres sitios de estudio, sdo en nlisis de Fluorescenci de Ryos X Tl 4 Coeficientes de correlción entre l undnci de M. frilen y l concentrción de elementos en ls rocs de tres sitios de estudio. Negrits indicn correlciones ltmente significtivs (p<0.001) Tl 5 Ejemplos de cteris endófits y ls especies vegetles que ls lergn Tl 6 Niveles de undnci de ls polciones de cteris endófits islds del cilindro vsculr de ríz de M. frilen Tl 7 Crcterizción de lguns cteris endófits islds de ríz de M. frilen Tl 8 Identidd txonómic de ls cteris endófits de M. frilen islds de ríz Tl 9 Cpcidd de fijción de nitrógeno de ls cteris endófits de ríz medid por l reducción de cetileno in vitro Tl 10 Diseño experimentl pr evlur el efecto cteris endófits-plnt en l movilizción de elementos minerles Tl 11 Concentrción de los nticuerpos purificdos Tl 12 Elementos minerles movilizdos hci plnts de M. frilen por l intercción de cteris endófits-plnts Tl 13 Movilizción de elementos minerles desde los sustrtos de cultivo provenientes del miente nturl hci M. frilen en condiciones de cultivo