CONTROL DE CALIDAD MICROBIOLOGICA DE PLANTAS MEDICINALES Y PRODUCTOS FITOFARMACEUTICOS
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- Rafael José Ramón Castellanos Correa
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1 CONTROL DE CALIDAD MICROBIOLOGICA DE PLANTAS MEDICINALES Y PRODUCTOS FITOFARMACEUTICOS Armando Cáceres Facultad de CCQQ y Farmacia, Univ. de San Carlos y Laboratorio de Productos Naturales Farmaya, Comisión Asesora de Productos Naturales (CAPRONAT) Guatemala. acaceres46@hotmail.com VIII Curso Iberoamericano sobre Tecnología Fitofarmacéutica Prof. Nikolai Sharapin Universidad Nacional de Rosario Rosario, 26 de julio 06 de agosto de 2010
2 IDENTIDAD Etnobotánica Articulación PRODUCCION Agrotecnología BP VALIDACION Biomedicina UTILIZACION Fitoterapia Regulación TRANSFORMACION Fifofarmacia FITOTERAPIA: Cadena de servicios multidisciplinarios
3 FACTORES DETERMINANTES DE CALIDAD DE PLANTAS MEDICINALES VARIABLE EJEMPLOS DE AGENTES g Genotipo Especies, cultivar g Desarrollo Crecimiento, floración g Morfogénesis Órgano, tejido g Ambiente natural Fertilidad del suelo, luz, temperatura, competencia época de corte (fase lunar) g Ambiente humano Manejo de desechos, hábitos g Proceso Secado, destilado, extracción g Contaminación Física, biológica, química A apartir de Máthé A & Franz C (1999) J Herbs, Species & Med Plan 6:
4 PLANTAS SILVESTRE Y CULTIVADAS Ventajas y Desventajas Problema: 80% de plantas compradas en Europa son silvestres. FACTOR Disponibilidad Manipulación agro Adulteración Identificación Aprovicionamiento Mejoramiento genético Control de calidad Manejo postcosecha SILVESTRE Disminuyendo No Frecuente Poco confiable Inestable No Pobre Pobre CULTIVADA Aumentando Si Rara Inquestionable Constante Si Alto Bueno Ref.: Capasso et al. (2000) Fitoterapia 71:S58-S65
5 BUENAS PRACTICAS AGRICOLAS para las Plantas Medicinales Identificación precisa de la materia vegetal. Cultivo en condiciones ajustada a requerimientos. Destrucción de plantas enfermas o muertas. Cosecha en el máximo contenido del ingrediente. Control de la contaminación en todo momento. Procesamiento, lavado y oreado en condición aséptica. Proceso de secado a la brevedad, rápido y homogéneo. Envase y almacenamiento adecuados. Personal con capacitación en las operaciones. Documentación rigurosa de los procesos y actividades. Ref.: Harnischfeger, G. Training Course on Phytomedicines, Panama, CYTED, 1997.
6 DESHIDRATADO VEGETAL Parámetros a controlar Temperatura del aire de secado. Velocidad del aire de secado. Altura de la capa del producto. Tamaño del producto. Humedad dentro y fuera del sistema. Temperatura del producto. Intensidad de luz que entra al sistema. Contaminación microbiana.
7 PROCESO HISTORICO DEL SECADO DE PLANTAS MEDICINALES SECADO AL SOL O SOMBRA Preocupaba únicamente la apariencia 70s SECADO EN ESTUFA Y CIRCULACION Límite de temperatura y evaluación de composición química 80s SECADO EN SECADORES ESPECIALES Evaluación de temperatura, velocidad del aire, altura de camada y consumo energético (evaluación química e ingeniería de proceso)
8 PROCESAMIENTO POSTCOSECHA Y PÉRDIDA DE PRINCIPIOS ACTIVOS Los procesamientos poscosecha tienen por objeto la conservación de las características físicas, químicas, organolépticas y farmacológicas de la droga vegetal. Los factores que inciden en la pérdida son: Degradación por procesos metabólicos Hidrólisis de principios activos Descomposición por la luz y por enzimas Degradación de substancias termolábiles por calor Volatilización de los aceites esenciales Contaminación por hongos y bacterias
9 ECOLOGIA MICROBIANA Efecto en la industria farmacéutica Atmósfera Recuentos microbianos Reducción del recuento Desinfección química Irradiación UV Aire comprimido Agua Fuentes de agua Calidad del agua usada Desagües y aguas negras Ablandamiento de agua Sistema de distribución Almacenaje de agua Flora respiratoria/dérmica Transferencia de operarios Diseño de áreas Materias primas Empacado Edificios Paredes y cielos Equipos Material de colecta Lavado y desinfección Chequeo microbiano Equipos de limpieza Hugo & Russell - Pharmaceutical Microbiology, pp
10 MATERIA MEDICA/ DROGA VEGETAL Características de la materia prima g Completamente seca (<10% humedad) g Con su color natural g Con su olor característico g Libre de material indeseable n Otros órganos de la planta n Otros materiales y contaminantes g Tamaño lo más entero posible (2-6 cm) g Libre de contaminación fecal n Coliformes totales 10 4 NMP/g n Coliformes fecales 10 1 (sin Salmonella) n Bacterias aeróbicas 10 5 n Mohos y levaduras 10 5
11 CALIDAD MICROBIOLOGICA Riesgos de contaminación durante el proceso ETAPA Precultivo Cultivo en el campo Cosecha Almacenaje intermedio Transporte Tratamientos Producto final NIVEL DE RIESGO Ninguno a bajo Alto Alto Bajo a mediano Ninguno a bajo Bajo a mediano Generalmente ninguno Kneifel W et al. Planta Med. 2002; 68:5-15.
12 CALIDAD MICROBIOLOGICA Factores determinantes INTRINSECOS Naturaleza de la planta y barreras naturales. Estructura de la planta Composición de la planta (compuestos antimicrobianos) Contaminación intracelular microbiana EXTRINSECOS Clima Humedad Ubicación/Posición Método de cosecha Poscosecha Estado físico Tratamiento tecnológico Empaque/almacenaje Contaminación bacteriana exógena Kneifel W et al. Planta Med. 2002; 68:5-15.
13 VALIDACION DE METODOLOGIA Cepas y medios selectivos recomendados Para validar el método, cultive las cepas de referencia en los medios de cultivo sugeridos a C durante horas (Candida spp C por 48 horas), diluya en solución salina amortiguada a una suspensión de 10 3 microorganismos/ml. MICROORGANISMO CEPA MEDIO Bacillus subtilis ATCC 6633 Soya-Caseina Candida albicans ATCC 2091 Caldo Sabouraud Escherichia coli ATCC 8739 Caldo lactosado Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Soya-Caseina Salmonella abony NCTC 6017 Caldo lactosado Staphylococcus aureus ATCC 6538 Soya-Caseina WHO, Quality Control Methods Rev., pp. 31.
14 CUANTIFICACION DE MICROORGANISMOS TECNICA Recuento en cámara Citometría de flujo Número más probable Siembra cuantitativa Filtración por membrana Fluorometría Fluorocult/cromocult CARACTERISTICAS esporas, protozoos equipo sofisticado determinación en tubo en tubo o en placa proceso en serie equipo sofisticado rapidez, alto costo
15 PRUEBA DE PUREZA Recuento total de aeróbicos viables en placa g g g g g Pretratar el material con amortiguador y diluir adecuadamente. Filtración: Esterilizar el equipo con filtro <0.45 µm, transferir 10 ml de la dilución y filtrar; lavar cada membrana y colocar una en placa de agar caseina-soya (ACS) y otra en agar Sabouraud (AS). Incubar 5 días a C y a C. Recuento en placa (bacterias): En placas de Petri agregar 1 ml de material pretratado a 15 ml de ACS líquido o repartirlo en su superficie. Incubar a C por 5 días. Recuento en placa (hongos): En placas de Petri agregar 1 ml de material pretratado a 15 ml de AS o repartirlo en su superficie. Incubar a C por 5 días Contar y calcular el número de colonias.
16 TUBOS MULTIPLES Equipo y materiales EQUIPOS Y MATERIALES Incubadora a 35 o C Incubadora a 44 o C Campana bacteriológica Mechero Autoclave Gradillas Asas bacteriológicas Campanas de Durham FUNGIBLES Pipetas estériles de 1 ml en 0.1 ml Agua peptonada 0.1% en frascos de 9 a 90 ml Tubos con 9 ml de caldos: Lactosado, Caldo Bilis Verde Brillante y EC Agar MacConkey
17 TUBOS MULTIPLES DE FERMENTACIÓN Fundamentos y Prueba Presuntiva Fundamento: Se basa en la observación de la producción de gas a partir de la fermentación de lactosa por bacterias viables y la estimación de la densidad de coliformes empleando tablas del NMP. Procedimiento: Homogenizar y diluir el material (1:10) Prueba presuntiva: Inocular una serie de tubos con caldo lactosado, con cantidades decimales (1, 0.1, 0.01 ml). Incubar a 35 o C durante 24 hrs. Examinar la presencia o ausencia de gas. Reincubar si no hay gas y examinar a las 48 hrs. Presencia de gas = Prueba Presuntiva Positiva Ausencia de gas = Prueba Presuntiva Negativa
18 TUBOS MULTIPLES DE FERMENTACIÓN Pruebas Confirmativa y Complementaria PRUEBA CONFIRMATIVA Sembrar una asada de los tubos positivos en la prueba presuntiva en tubos con caldo Bilis Verde Brillante e incubar a 35 o C por 24 hrs para coliformes totales. Sembrar otra asada a tubos con caldo Bilis Verde Brillante o EC e incubar a 44 o C por 24 hrs para colifromes fecales. Interpretación: La presencia de gas se interpreta como prueba confirmativa positiva. PRUEBA COMPLEMENTARIA Sembrar en estrías una asada del 10% de tubos positivos en agar MacConkey e identificar. Interpretación: La combinación de tubos positivos se busca en las tablas de Número Más Probable (NMP) para obtener el NMP por 100 ml de muestras analizada.
19 RECUENTO MICROBIANO Cálculo del número más probable (NMP) 0.1 ml/ tubo 0.01 ml/ tubo ml/tubo NMP/g o ml 3* 3 3 >1, , ml/ tubo 0.01 ml/ tubo ml/tubo NMP/g o ml * Número de tubos con crecimiento microbiano; los caldos pueden variar de acuerdo con el microorganismo cuyo crecimiento queremos cuantificar. WHO. Quality Control Methods Rev, pp. 31. Geneva, 2005.
20 FILTRACIÓN POR MEMBRANA Materiales necesarios EQUIPO Y MATERIALES Incubadora a 35 o C Contador de colonias Campana bacteriológica Filtro para membrana (acero o vidrio) Bomba de vacío Mechero Pinzas planas FUNGIBLES Y REACTIVOS Membrana de <0.45 mm de nitrato o acetato de celulosa Cajas de petri estériles Agar Plate Count o Agar Caseína-Soya Agar Endo C
21 FILTRACIÓN POR MEMBRANA Principio y procedimiento PRINCIPIO. Es la estimación del número de bacterias viables en muestras líquidas de baja turbidez. Se basa en la suposición que las células microbianas presentes forman colonias separadas en membranas colocadas sobre medios de cultivo que pueden ser: PCA: Para recuentos totales de bacterias. Endo: Para recuento de coliformes totales y fecales. Saboraud: Para recuento de hongos. PROCEDIMIENTO Esterilizar el aparato de filtración flameando el interior. Dejar que se enfríe el aparato y colocar la membrana (0.45 µ). Agregar el material de la muestra y filtrar. Colocar la membrana con la parte inferior hacia abajo sobre la superficie del Agar PCA, Endo o Sabouraud en cajas de Petri. Incubar a 35 o C por 24 hrs.
22 1.0g o ml FILTRACIÓN POR MEMBRANA Cálculo del recuento de enterobacterias 0.1g o ml 0.01g o ml > 10 2 Número más probable por gramo (NMP/g) < 10 2 pero más de < 10 pero más de Menos de 1 WHO. Quality Control Methods Rev., pp. 33. Geneva, 2005.
23 PRUEBA DE PUREZA Confirmación del Control Sanitario g Cuantificación. Inocular en caldo Mossel el material homogenizado, diluir (1, 0.1 y 0.01 g/ml), sembrar en Agar bilis violeta con glucosa/lactosa. Incubar a 35 C por h. Estimar recuento de colonias bien desarrolladas color rojizo (Gramnegativo). g E. coli. Transferir material homogenizado en caldo lactosado a 100 ml de caldo MacConkey (MC), incubar a 44 C por 24 h, inocular subcultivos a placas de Agar MC y reincubar. Estimar la colonias rojas, no mucoides, rodeada de zona rojiza. Confirmar por formación de indol a 44 C.
24 PRUEBA DE PUREZA Demostración de Salmonella g Incubar material pretratado a 36 C por 5-24 h. g Prueba primaria. Transferir 10 ml a 100 ml de caldo tetrationato-bilis verde brillante, incubar a 42 C por h. Subcultivar en dos de cualquier Agar: desoxicolato citrato, xilosa, lisina o verde brillante. Incubar a 36 C por 24 h. g Prueba secundaria. Subcultivar colonias en TSI en siembra profunda. La prueba es positiva si se presenta cambio de color en profundidad con formación de gas y ácido sulfhídrico. Confirmar por bioquímica o serología.
25 PRUEBA DE PUREZA Pseudomonas y Staphylococcus g Pretratar material en amortiguador peptonado. g Pseudomonas aeruginosa n Inocular 100 ml de Medio Soya-Caseina. n Incubar a 35 C por h. n Subcultivar en Agar Cetrimida e incubar. n Si no hay crecimiento la prueba es negativa. g Staphylococcus aureus n Inocular Agar Blair-Parker n Incubar a 35 C, por h. n Si no hay crecimiento la prueba es negativa.
26 PRUEBA DE PUREZA Shigella y Clostridia g n n n n g n n n n n n Shigella Pretratar material en amortiguador peptonado. Inocular Medio MacConkey+1 µg de telurito de potasio. Incubar a 35 C, h. Confirmar XLD o desoxicolato, seguido de inoculación en TSI o KIA Si no hay crecimiento la prueba es negativa. Clostridia Inocular 2x100 ml de Medio de Carne Cocida con 10 g Sellar uno con una capa de parafina estéril Calentar el otro a 65 C por 30 min y sellar. Incubar a 37 C, examinar cada 24 h/4 días Sin crecimiento en ninguno, la prueba es negativa. Identificar los esporoformadores
27 FLUOROCULT/CROMOCULT Equipo y materiales Mechero Gas propano Campana bacteriológica LUV Pipetas estériles de 1 ml en 0.1 ml Autoclave Agua peptonada 0.1% en recipientes de 9 a 90 ml CALDO FLUOROCULT Tubos con 9 ml de Caldo Fluorocult AGAR CROMOCULT Cajas de petri estériles Agar para Coliformes Incubadora a 35 C Reactivo de Kovacs
28 MONOTUBO PARA COLIFORMES Caldo Fluorocult LMX Combina dos técnicas, una cromogénica y otra fluorogénica, en la que se requiere un solo medio de cultivo. Permite la detección rápida de E. coli y coliformes usando el compuesto cromogénico 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-Dgalactopiranosido (XGal) y el compuesto fluorogénico 4- metilumbeliferil-β-d-glucoronido (MUG). Este medio contiene una enzima que detecta la β-d-galactosidasa (BGal) y la β-d-glucoronidasa (BGud). Cuando XGal es roto por BGal, el caldo se torna verde azulado por la conversión de las agliconas liberadas a indigo. En presencia de BGud el compuesto fluorescente 4 metil-umberilferona se rompe del MUG. La luz azul fluorece en el caldo bajo luz UV (365 nm), la cual indica la presencia de E. coli. Para confirmar la presencia de E. coli, se demuestra la producción de indol usando el reactivo de Kovack. La formación de un anillo rojo en la superficie indica la prueba positiva.
29 MONOTUBO PARA COLIFORMES Procedimiento e interpretación PROCEDIMIENTO Homogenizar y diluir la muestra Inocular 9 tubos con caldo Fluorocult: los primeros 3 con 1 ml de la dilución, los siguientes 3 con 0.1 ml y los últimos 3 con 0.01 ml. Incubar a o C por 24 hrs. INTERPRETACIÓN Negativo: No existe cambio de color en el tubo de ensayo Positivo: Viraje de coloración de amarillo a verde-azulado confirma la presencia de CT, según tabla de NMP. CF y E. coli: Exponer los tubos positivos a LUV de longitud de onda larga para fluorescencia. Una fluorescencia azul indica la presencia de E. coli y por lo tanto de CF. Confirmar la presencia de E. coli en los tubos con fluorescencia positiva, agregar dos gotas de reactivo de Kovac, un cambio de coloración a rojo confirma la presencia de E. coli.
30 LMX FLUOROCULT
31 AGAR CROMOCULT Fundamento y Procedimiento Agar selectivo para la detección simultanea de CT y E. coli en muestras de agua y comida. La interacción de peptonas seleccionadas, piruvato, sorbitol y amortiguador de fosfato garantizan el rápido crecimiento de colonias, incluso de coliformes subletalmente dañadas. Las bacterias G+ y algunas G son inhibidas por el contenido de Tergitol-7 que no tiene efecto negativo sobre el crecimiento de coliformes. Una combinación de dos sustratos cromogénicos permite la detección simultanea de CT y E. coli. PROCEDIMIENTO Inocular el medio por el método de vertido en placa o por esparcido de la muestra en la superficie de la placa. La técnica de filtración por membrana también puede usarse. Incubar a o C por 24 hrs.
32 AGAR CROMOCULT Identificación e interpretación IDENTIFICACIÓN DE COLIFORMES La enzima característica de coliformes, BGal se adhiere al sustrato GAL-Salmón y causa una coloración de salmón a roja de las colonias de coliformes. IDENTIFICACIÓN DE E. coli El sustrato X-glucurónido es usado para la identificación de β- D-glucoronidasa, que es una enzima característica de E. coli. E. coli se adhiere a GAL-Salmón y X-glucorónido tomando las colonias positivas una coloración de azul oscuro a violeta. Para la confirmación de E. coli, demostrar la producción de indol con reactivo de Kovac. INTERPRETACIÓN E. coli: colonias azul oscuro a violetas Coliformes totales: Colonias salmón a rojas y colonias de color azul oscuro a violetas.
33 AGAR CHROMOCULT
34 LIMITES MICROBIANOS Contaminación máxima aceptada g Material vegetal crudo colectado en condiciones higiénicas que tendrá un procesamiento posterior (físico o químico): Escherichia coli, 10 4 /g Propágulos de mohos, 10 5 /g g Materiales que han sido pretratados o para uso tópico: Bacterias aeróbicas, 10 7 /g Levaduras y mohos, 10 4 /g Escherichia coli, 10/g Otras enterobacterias, 10 3 /g Salmonella, Shigella y Clostridia, ausente/1g g Otros materiales para uso interno (tisanas): Bacterias aeróbicas, 10 5 (10 7 )/g Levaduras y mohos, 10 3 (10 4 )/g Escherichia coli, 10 0 (10 1 )/g Otras enterobacterias, 10 3 /g Salmonella y Shigella, ausente WHO. Quality Control Methods Rev., p. 37. Geneva, 2005.
35 CALIDAD MICROBIOLOGICA de las preparaciones farmacéuticas g g g g g g Categoria 1. Preparaciones que requieren esterilidad Prueba de esterilidad Categoría 2. Preparaciones para uso tópico y transdérmico Bacterias aeróbicas, 10 2 /g Enterobacterias, 10 1 /g Pseudomonas, ausente Staphylococcus, ausente Categoría 3A. Preparaciones para uso oral/rectal Bacterias aeróbicas, 10 2 /g Enterobacterias, 10 1 /g Categoría 3B. Preparaciones para administración oral sin tratamiento. Bacterias aeróbicas, 10 4 /g Enterobacterias, 10 2 /g Escherichia coli, Salmonella y Staphylococcus, ausentes Categoría 4A. Preparaciones a las que se les agregará agua hirviendo. Bacterias aeróbicas, 10 7 /g Escherichia coli, 10 2 /g Categoría 4B. Preparaciones a las que no se les agregará agua hirviendo. Bacterias aeróbicas, 10 5 /g Enterobacterias, 10 3 /g Escherichia coli, Salmonella y Staphylococcus, ausentes Gaedcke & Steinhoff. Herbal Medicinal Products, p. 105, 2003.
36 CALIDAD MICROBIOLOGICA Evaluación de 10 especies de uso medicinal Estudio: Control de calidad y sanitario en muestras de plantas medicinales distribuidas en la ciudad de Guatemala. Muestra: 13 muestras de las plantas de mayor frecuencia de uso compradas en 8 centros naturistas y 6 de infusiones comerciales. Métodos: Observación macroscópica y físico-organoléptica y recuento de CT y CF por la técnica del NMP. Resultados: Organoléptico: Solamente 3 según norma (<10% materia extraña). CT y CF: 5 (38.5%) de las hierbas de centros naturistas y 2 (40%) de las infusiones comerciales con recuentos >10 2 NMP/g. Discusión: Los resultados evidencian deficiencias en la calidad físico-organoléptica y microbiológica de las infusiones de hierbas medicinales. Girón LM et al. (1986) Simposio sobre Biología de Salud Tropical. Guatemala, 7 p.
37 CALIDAD MICROBIOLOGICA Análisis de 10 especies medicinales en Guatemala Especie/órgano Prove. %MV Q/g útil Calidad NMP/g Albahaca/hoja A Hierbabuena/hoja A Hierba del gato/hoja A <3 Hierba del gato/hoja H <3 Ajenjo/hoja B <3 Anís/fruto B ,100 Verbena/hoja B Verbena/hoja C Té de limón/hoja D ,400 Llantén/hoja E Manzanilla/flor F ,100 Manzanilla/flor H Pericón/hoja G <3
38 CALIDAD MICROBIOLOGICA Evaluación de dos especies de uso medicinal Estudio: Análisis microbiológico de dos infusiones de hierbas medicinales en Costa Rica. Muestra: 24 muestras de materia vegetal de menta y de anís estrella. Métodos: Recuento total aeróbico, CT, CF y P. aeruginosa, por la técnica de recuento en placa. Resultados: Recuento Total: El 85.7% de las muestras de menta y 8.3% de las de anís presentaron recuentos totales que sobrepasan la norma internacional. CT y CF: El 100% de las muestras de menta incumplieron la norma para CT y el 41.7% para CF; en el anís estrella, el 100% cumple con la norma internacional. Discusión: Los resultados evidencian serias deficiencias en la calidad microbiológica de las infusiones de hierbas medicinales, aunque es de considerar que la menta es cultivada en Costa Rica y el anís importado. Arias ML et al. (2003) Análisis microbiológico de algunas infusiones de hierbas medicinales. Rev. Biomed. 10:1-10.
39 Contaminación fúngica en Portugal Se colectaron 62 muestras de 7 plantas medicinales (manzanilla, naranja, tilo, estigmas de maíz, algas marinas, menta y salvia Prácticamente todas las muestras (96.8%) estaban contaminadas con Bacillus cereus; ; 19.2% con límites l mayores de 10 3 esporas/g. Los niveles mas altos se encontraron en estigmas de maíz z (>10 7 esporas/g). Se detectaron esporas de Clostridium perfringens (83.9%), pero solo19.2% con niveles >10 3 /g. La media de poblaciones fúngicas f fue de ufc/g. Los estigmas de maíz z fueron los mas contaminados (>10 6 ufc/g). Fusarium spp., Penicillium spp.,, Aspergillus flavus y A. niger fueron predominantes en todas las muestras con excepción n de salvia. Varias levaduras se encontraron en manzanilla, tilo, estigmas de maíz, menta y salvia, predominando especies de Cryptococcus laurentii (28.1%) y Rhodotorula mucilaginosa (22.8% ). Los niveles medio de C. laurentii en estigmas de maíz z fue >10 4 ufc/g. Martins HM et al. (2001) Internat J Food Microbiol 68:
40 CALIDAD MICROBIOLOGICA Tamizaje en drogas vegetales Universo y muestra: 138 muestras escogidas al azar de 31 drogas vegetales, provenientes de 9 proveedores de Austria y Alemania. Metodología: Parámetros estándar: Recuento aeróbico mesofílico, enterobacterias, coliformes, esporoformadores aeróbicos, levaduras y mohos, enterococos, lactobacilus y pseudomonadales y aeromonades. Selectivos: E.coli EH, Salmonella, Campylobacter jejuni, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Estafilococo coagulasa +, Candida albicans, mohos potencialmente aflatoxigénicos. Czech E et al. Planta Med. 2001; 67:
41 CALIDAD MICROBIOLOGICA Resultados en drogas vegetales Recuento aeróbico mesofílico: El grado de contaminación varia considerablemente, de 100 UFC/g (semilla de Linum) hasta >10 8 UFC/g (hierba Passiflora). Coliforme y enterobacterias: No se detectaron en varios casos, se detectó en algunos (mo > de 6.5 log UFC/g). Levaduras y mohos: valores menores de < UFC/g. En 12 (8.7%) hubo sobrecrecimiento de mohos. Bacterias esporoformadoras: Detectadas en todas las muestras con rangos muy variables ( log UFC/g). Estafilocos y enterococos: Recuentos de fueron <10 2 Pseudomonas-Aeromonas: 30% de recuentos entre Patógenos: E. coli 4 (2.3%), C. jejuni 2 (1.4%), estafilococo coagulasa + 1 (0.7%), ninguno otro patógeno fue demostrado. Czech E et al. Planta Med. 2001; 67:
42 CONTROL MICROBIOLOGICO Valor indicativo de grupos de MOs GRUPO Recuento total mesofílico Enterobacterias Coliformes Enterococos Pseudo- y aeromonadas Estafilococos coagulasa + Bacterias esporoformadoras Lactobacilos Levaduras y mohos Microorganismos patógenos SIGNIFICADO Parámetro general de higiene Indica contaminación n fecal Indica contaminación n fecal Indica contaminación n fecal Presagia descomposición Patógeno de origen humano Microflora del suelo Indica plantas descompuestas Micotoxigenicidad potencial Alto riesgo Kneifel W et al. Planta Med. 2002; 68:5-15.
43 CONTROL MATERIA VEGETAL Fisicoquímico-Sanitario g FISICOQUÍMICAS n Color n Sabor n Olor n Aspecto n Forma n Humedad (%) n Aceite esencial (%) CONTROL SANITARIO Recuento aeróbico en placa Mohos y levaduras Coliformes (totales y fecales), ausencia de Salmonella, Shigella y Clostridia
44 CONTROL PRODUCTO: LIQUIDO Fisicoquímico-Sanitario g FISICOQUIMICO n Color n Sabor, olor n Aspecto y forma n Densidad n ph n Viscosidad n Alcohol (%) g CONTROL SANITARIO n Recuento en placa n Mohos y levaduras n Coliformes (totales y fecales), ausencia de Salmonella, Shigella y Clostridia g CONTROL QUIMICO n Capilografía n TLC/HPLC
45 CONTROL PRODUCTO: SEMISOLIDO Fisicoquímico-Sanitario g FISICOQUIMICO n Color, n Sabor, olor n Densidad n ph y viscosidad n Humedad (%) g SENSIBILIDAD g FUNDICION g CONTROL SANITARIO n Recuento en placa n Mohos y levaduras n Coliformes (totales, fecales), ausencia de E. coli, Salmonella y Shigella n Ausencia de Pseudomonas ni Staphylococcus g FITOQUIMICA
46 CONTROL DE ACTIVIDAD Bioensayos farmacológicos g Problemas de los ensayos químicos n Desconocimiento de los constituyentes activos n Correlación con la actividad biológica n Equipamiento necesario (excesivo uso de HPLC) g Bioensayos como estándares g Problemas de los bioensayos como estándares n Falta de reproducibilidad en sistemas automatizados n Falta de modelos para ciertas enfermedades n Actividad consecuencia de una mezcla de efectos n Correlación in vitro in vivo g Algunos ejemplos de bioensayos como estándares n Actividad antimicrobiana Actividad antiinflamatoria n Citototoxicidad Inmunomoduladores Antioxidantes
47 CONTROL DE CALIDAD Textos de apoyo 1991 WHO. Guidelines for the assessment of herbal medicines WHO. Quality Control Methods for Medicinal Plant Materials. Geneva Martínez et al. Fundamentos de Agrotecnología de Cultivo de Plantas Medicinales Iberoamericanas. Bogotá, SECAB-CYTED. Sharapin. Fundamentos de Tecnología de Productos Fitoterapéuticos. Bogotá, SECAB-CYTED. Mazza & Oomah. Herbs, Botanical & Teas. Lancaster 2002 Mukherjee. Quality Control of Herbal Drugs. New Dehli. Rajpal. Standardization of Botanicals. Neh Dehli, Eastern Pub Gaedcke & Steinhoff. Herbal Medicinal Products. Stuttgart. Verpoorte & Mukherjee. GMP for Botanicals. New Dehli WHO. Directrices de la OMS sobre buenas prácticas agrícolas y de recolección (BPAR) de plantas medicinales, Ginebra 2005 WHO. Quality Control Methods for Medicinal Plant Materials. Revised Update, QAS/ Rev. 1
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