11 kn. de publicación: ES kint. Cl. 5 : C12N 15/49 DE PATENTE EUROPEA

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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 kn. de publicación: ES kint. Cl. 5 : C12N 15/49 C12N 15/62 A61K 39/21 G01N 33/569 A61K 39/295 A61K 39/145 A61K 39/29 12 k TRADUCCION DE REIVINDICACIONES DE SOLICITUD T1 DE PATENTE EUROPEA 86 k Número de solicitud europea: k Fecha de presentación de la solicitud: k Número de publicación de la solicitud: kfecha de publicación de la solicitud: k 30 Prioridad: AT 987/ US k 71 Solicitante/s: Polimun Scientific Immunbiologische Forschungs GmbH Nussdorfer Lände, 11 A-1190 Wien, AT k 43 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 46 Fecha de publicación de la traducción de las reivindicaciones: k Inventor/es: Katinger, Hermann; Rüker, Florian; Himmler, Gottfried; Muster, Thomas; Purtscher, Martin; Maiwald, Georg; Steindl, Franz y Trkola, Alexandra 74k Agente: Roeb Ungeheuer, Carlos k 54 Título: Péptidos que inducen anticuerpos que neutralizan aislados de VIH-1 genéticamente divergentes. Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 REIVINDICACIONES 1. Un procedimiento para la fabricación de péptidos los cuales se unen a los anticuerpos, que muestran actividad neutralizante contra las cepas divergentes genéticamente y aíslados clínicos del VIH-1 y que inhiben la fusión de células originadas por VIH-1, caracterizado porque los oligonucleótidos correspondientes a uno de las secuencias de amino ácidos de SEQ ID NO: 1 hasta SEQ ID NO:25 son clonados, transformados y expresados en E. Coli, preferiblemente E. coli DH5 α. 2. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 1, caracterizado porque los péptidos son expresados como fusión de las proteínas con glutatión S-transferasa (GST), preferiblemente con dichos oligonucleótidos que son hibridizados y clonados entre locus Bam HI y Eco RI del plásmido pgex-2t (Pharmacia). 3. Un procedimiento de acuerdo con las Reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque después de la expresión de dichas secuencias de aminoácidos y/o de dichos péptidos las células E. coli sufren disrupción y dichas secuencias de aminoácidos y/o dichos péptidos se separan de la fracción líquida y se purifican. 4. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 3, caracterizado porque esa disrupción de las células E. coli se alcanza por sonicación. 5. Un procedimiento de acuerdo con las Reivindicaciones 3 ó 4, caracterizado porque la separación y purificación de las secuencias de aminoácidos y/o péptidos se llevan a cabo por la afinidad de cromatografía, preferiblemente usando una glutatión de sefarosa columna 4B, de donde las secuencias de aminoácidosy/o péptidos son eluídos, preferiblemente con una solución que contiene una glutatión NaCl y un tampón. 6. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 5, caracterizado porque el medio de elusión es una solución compuesta de glutatión 20 mm y 120 mm NaCl en 100 mm Tris-HCl, ph 8,0. 7. Un procedimiento para la fabricación de proteínas de fusión las cuales se unen a los anticuerpos que muestran actividad neutralizante contra distintas cepas y aislados clínicos del VIH- 1 los cuales inhiben la fusión de las células originadas por VIH-1, caracterizado porque 2 a) al menos una de las secuencias de aminoácido del SEQ ID NO: 1 hasta SEQ ID NO:25 está introducida en los locus antigénicos de la hemaglutinina del virus de la influenza A por mutagénesis in vitro, por lo tanto tendiendo a constructos quiméricas de ADN, b) dichos constructos quiméricos de ADN después son transfectados por RNP a los virus de la influenza HK/WSN, en donde los virus de la influenza quimérica/vih se crean exhibiendo propiedades antigénicas de dicha fusión de proteínas, dichos virus de la influenza quimérica/vih son capaces preferiblemente de inducir una respuesta inmune neutralizante contra las cepas genéticamente divergentes del VIH Un procedimiento para la fabricación de las proteínas de fusión las cuales unen los anticuerpos que muestran actividad neutralizante contra distintas cepas y aislados clínicos del VIH-1 y los cuales inhiben la fusión de las células originadas por el VIH-1, caracterizado porque a) se prepara una cadena sencilla de constructo Fv de un anticuerpo neutralizante anti- HIV-gp 120, b) al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 hasta SEQ ID NO: 25 se inserta en el enlace que conecta las regiones variables de la cadena pesada y ligera de una molécula inmunoglobulina, c) dichas proteínas de fusión son luego expresadas como parte de dicha molécula de inmunoglobulina que contiene la inserción de al menos una de dichas secuencias de aminoácidos. 9. Un procedimiento para la fabricación de proteínas de fusión las cuales se unen a anticuerpos que muestran una actividad neutralizante contra las distintas cepas y aislados clínicos de VIH-1 y las cuales inhiben la fusión de las células originadas por el VIH-1, caracterizadoporque una o más regiones hipervariables o partes de la misma de un anticuerpo monoclonal son substituídas por el menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 hasta SEQ ID NO: 25, usando procedimientos normales. 10. Un procedimiento según la Reivindicación 9, caracterizado porque dichas proteínas de fusión se expresan como una cadena sencilla de fragmentos Fv en E. coli, después se purifican y se inyectan al ratón, por consiguiente tiende a la formación de anticuerpos antiidioípicos que son capaces de inducir una respuesta inmuno neutralizante contra las cepas genéticamente divergentes del VIH Un procedimiento para la selección de anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpos que se unen al VIH-1 in vitro, caracterizado porque al menos una de las secuencias de aminoácidos del SEQ ID N : 1 hasta el SEQ ID NO: 25 se unen a dichos anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpos, después las moléculas resultantes se separan y se purifican según las técnicas normales. 12. Un procedimiento para la determinación del estado de infección del VIH-1 infectado en humanos y/o animales, caracterizado porque al menos una de las secuencias de aminoácidos del SEQ ID NO: 1 hasta el SEQ ID NO: 25 se añaden al suero de un paciente infectado y/o animal de experimentación, en donde la valoración de neutralización del VIH-1 se determina siguiendo los últimos avances de los procedimientos de la técnica. 13. Uso de los péptidos fabricados según cualquiera de las Reivindicaciones de la 1 a la 4 para la fabricación de preparaciones farmacéuticas para seleccionar anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpos que se unen con el VIH-1 in vitro. 14. Uso de las proteínas de fusión fabricadas según cualquiera de las Reivindicaciones 5

3 a 10 para la fabricación de preparaciones farmacéuticas para producir los anticuerpos neutralizantes del VIH-1 en los humanos. 15. Uso de las proteínas de fusión de acuerdo 5 con cualquiera de las Reivindicaciones 5 a 10 para el tratamiento profiláctico de las personas potencialmente en peligro por el VIH NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluída en la mencionada reserva. 3

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5 Determinación de las valoraciones del anticuerpo péptido específico en el suero de personas infectadas por VIH Valoración del anticuerpo específico al péptido ELDKWA La valoración de los anticuerpos fue determinada por ELISA. El péptido se usó enformadepéptido de fusión (en combinación con glutatión - S - - transferasa). El péptido de fusión fue revestido en 96 placas de microvaloración 100µl/cavidad (2,5µg/ml) e incubado durante la noche a 4 C. Después de lavar tres veces con un tampón - lavado el suero positivo de VIH - 1 se diluyó 2 veces (1:40-1:81920) en un tampón - - dilución y partes alícuotas se transfirieron a las placas - ensayo (100µl/cavidad) e incubado durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego las placas fueron lavadas de nuevo tres veces con el tampón - lavado. Como un segundo anticuerpo una cadena γ antihumana de cabra, conjugada con peroxidasa de rábano picante, se usó (diluida 1:1000, 100µ/cavidad). Después de una hora de incubación a temperatura ambiente las placas fueron lavadas tres veces con el tampón - lavado. Luego las placas fueron teñidas usando o - fenilen - diamina - dihidrocloruro como substrato. La reacción se interrumpió con 2,5 M H 2 SO 4 y las placas fueron medidas (longitud de onda de medida 492 nm, longitud de onda de referencia de 620 nm) y evaluadas. Corte = el valor medio (4 - veces) de un suero negativo de VIH - 1 (1:40) + 3 veces la desviación estándar. Los donantes de suero números 20, 25, 29, 35, 41, 44, 46 son VIH - 1 positivos durante al menos cinco años y todavía permanecen asintomáticos. Figura 2: Gráfico de las valoraciones específicas de anticuerpos a un péptido con la secuencia de aminoácido ELDKWA de 65 sueros de donantes VIH - 1 positivos. 5

6 Influenza/VIH neutralización IIIB de la inhibición del VIH - 1 valoración de la neutralización residual IIIB en % después de la incubación con: Anticuerpos monoclónicos Mock Influenza WSN Influenza/VIH 2F5 100% 100% 10% 2F12 100% 100% 100% Figura 3a: Influenza/VIH inhibición de la neutralización del VIH - 1. Los resultados se expresan como recíprocos de la dilución del suero produciendo > 90% de reducción de la valoración del VIH que sigue a la preincubación de la mabs 2F5 y 2G12 con medio de cultivo (Mock), influenza WSN o influenza/vih. 2F5 es un anticuerpo monoclónico específico para el antígeno determinante diferente en gp160. El VIH residual - actividad neutralizante fue determinado incubando diluciones de la mezcla anticuerpo/virus con 10 3 unidades infecciosas (TCID 50 )devih-1iiibdurante1ha37 C. Partes alícuotas (100µl) del medio quecontiene10 4 células C8166 se añadieron y la presencia de sincitia se registró después de 48 h como una indicación de la infección del VIH. Inmunógeno: Valoración anticuerpo: K1 <10 K2 <10 K3 <10 F F F3 800 SMI 3200 SM2 400 SM3 800 VI 3200 V V ra1 <10 ra2 400 ra3 800 Figura 3b: Valoración del anticuerpo. Cada uno de los tres ratones Balb/c fueron inmunizados con ya sea 100µg GST (K), 100µg proteína de fusión (F), 100µg dela supermolécula inmunológica. 100µg de anticuerpo antiidiotípico recombinante (ra) ó 4,0 log 10 TCID 50 de virus (V) recombinante influenza/vih y fueron enriquecidos después de 2 y 4 semanas. Una semana después de la última inmunización se determinaron los anticuerpos por ELISA. Los resultados se facilitan como valores recíprocos que produjeron valores positivos significativos. El corte fue el valor doble de un suero de ratón normal. El recombinante gp41 se usó comoantígeno. 6

7 Valoración de neutralización recíproca de aislados VIH - 1 Antisuero IIIB RF MN P P P V V <10 V SM SM SM3 <10 <10 <10 ra ra ra Figura 3c: Neutralización de la infección VIH - 1. Las valoraciones de neutralización fueron determinadas incubando 10µl de antisuero inactivado calentado con 40µl de virus del líquido que sobrenada que contiene 10 3 unidades infecciosas de VIH - 1 a 38 C durante 1 h. El grado de infección VIH - 1 fue determinado como se describió en la fig. 3a. Abreviaturas: P... péptido de fusión, V... influenza quimérica/virus VIH. SM... supermolécula inmunológica. ra... anticuerpo recombinante. Las valoraciones de neutralización recíprocas de todos los controles estuvieron por debajo de 10. 7

8 Fig. 4: Inhibición de neutralización por péptidos. Péptido sintético (PEP), péptido de fusión (FP) y glutatión - S - transferasa (GST) fueron preincubados con humab 2F5 ó1b1durante1ha37 C, y luego se realizó un ensayo de inhibición de sincitia. Los anticuerpos fueron diluidos en 2 - pasos duplicados comenzando con 5 µg/cavidad. PEP, péptido sintético ELDKWA (péptido que corresponde a SEQ ID NO: 1) a 25 µg, b 5 µg por cavidad; FP, péptido de fusión ELDKWA con GST: a 25 µg, b 5 µg por cavidad; GST, glutatión-s-transferasa: a 25 µg, b 5 µg por cavidad; 1B1, neutralizante anti gp120 humab. 8