11 Número de publicación: Int. Cl.: 74 Agente: Carvajal y Urquijo, Isabel

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1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Número de publicación: Int. Cl.: A61K 48/00 (06.01) 12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación : Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: Título: Secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos del virus de la anemia infecciosa del salmón y sus usos como vacunas. Prioridad: GB GB GB Titular/es: Novartis AG. Lichtstrasse 3 6 Basel, CH 4 Fecha de publicación de la mención BOPI: Inventor/es: Griffiths, Steven; Ritchie, Rachel, Jane y Heppell, Joel 4 Fecha de la publicación del folleto de la patente: Agente: Carvajal y Urquijo, Isabel ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, Madrid

2 DESCRIPCIÓN Secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos del virus de la anemia infecciosa del salmón y sus usos como vacunas. La presente invención se relaciona con una vacuna para peces. Más específicamente la invención se relaciona con una vacuna para proteger al salmón contra el virus de la anemia infecciosa del salmón. El virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAV) causa la mortalidad del salmón atlántico de piscifactoría. Típicamente la rentabilidad de la acuacultura se reduce en más de un %. Por lo tanto, existe la necesidad de una vacuna efectiva contra el ISAV. Un objetivo de la presente invención es la de proveer una vacuna que sirva de protección contra la ISAV. 2 3 De acuerdo con la presente invención, se provee una composición que contiene al menos una secuencia de ácido nucleico y/o al menos una secuencia de aminoácidos, o un análogo del mismo preparado en forma sintética o una secuencia sustancialmente homóloga, en donde la composición se deriva de, o se basa en el virus de la anemia infecciosa del salmón y en donde al menos una de dichas secuencias de nucleótidos y/o de aminoácidos no causan anemia al salmón puede ser utilizada como o para preparar una vacuna para el ISAV. Una secuencia sustancialmente homóloga de ácido nucleico es una secuencia que se puede transcribir y/o traducir para proveer una secuencia de aminoácidos que sea sustancialmente homóloga al menos a una parte de un antígeno de superficie presente sobre el ISAV. Preferiblemente el aminoácido sustancialmente homólogo es al menos 70% homólogo con una parte de un antígeno de superficie del ISAV que es capaz de inducir una respuesta inmune. Más preferiblemente, la secuencia sustancialmente homóloga de aminoácidos es al menos 80% homóloga con una parte de un antígeno de superficie del ISAV y puede inducir una respuesta inmune. Lo más preferible, la secuencia sustancialmente homóloga de aminoácidos es al menos 90% homóloga con una parte de un antígeno de superficie del ISAV y puede inducir una respuesta inmune. Convenientemente, la secuencia de aminoácidos se escoge del grupo que contiene las Secuencias Identificadas con los números 2, 4, 6, 7, 8 ó como se las describe aquí. Alternativamente, la secuencia de aminoácidos puede contener al menos un fragmento de las Secuencias Identificadas con los números 2, 4, 6, 7, 8 ó Alternativamente, dicha secuencia de aminoácidos se puede truncar de una secuencia de aminoácidos de las Secuencias Identificadas con los números 2, 4, 6, 7, 8 ó como se las describe aquí, que pueden inducir una respuesta inmune. Preferiblemente, la secuencia sustancialmente homóloga de nucleótidos es al menos % homóloga con una parte de una secuencia de ácidos nucleicos de un antígeno de superficie del ISAV y el producto de la traducción del mismo es capaz de inducir una respuesta inmune. Preferiblemente, la secuencia sustancialmente homóloga de nucleótidos codifica al menos 70% de los homólogos con una parte de una secuencia de ácidos nucleicos de un antígeno de superficie del ISAV, cuyo producto de traducción es capaz de inducir una respuesta inmune. Más preferiblemente, la secuencia sustancialmente homóloga de nucleótidos codifica al menos 80% de los homólogos con una parte de una secuencia de ácidos nucleicos de un antígeno de superficie del ISAV, cuyo producto de traducción es capaz de inducir una respuesta inmune. Lo más preferible, la secuencia sustancialmente homóloga de nucleótidos codifica al menos 90% de los homólogos con una parte de una secuencia de ácidos nucleicos de un antígeno de superficie del ISAV, cuyo producto de traducción es capaz de inducir una respuesta inmune. Convenientemente, las secuencias de nucleótidos se escogen del grupo que contiene las Secuencias Identificadas con los números 1, 3, ó 9 como se las describe aquí. Alternativamente, la invención provee fragmentos de las secuencias descritas en las Secuencias Identificadas con los números 1, 3, ó 9 como se las describe aquí y en donde los productos de traducción de dichos fragmentos resultan en la inducción de una respuesta inmune. Adicionalmente, las secuencias pueden contener una forma truncada de las secuencias dadas como 1, 3, y 9. 2

3 La secuencia de nucleótidos se puede incorporar en un plásmido. La secuencia de nucleótidos se puede incorporar en un vector de expresión apropiado. 2 Un aspecto adicional de la presente invención dispone el uso de una secuencia escogida del grupo que consiste de las Secuencias Identificadas con los números 1 a, como se describe en la presente invención en la preparación de una vacuna y/o de un medicamento terapéutico para la protección de los peces de la infección con el virus de la Anemia Infecciosa del Salmón. Las secuencias típicas de ácido nucleico son ISA2cd (previamente conocida como p1.38), ISA1mta (previamente conocida como p8.17), ISA3mx (previamente conocida como p6.28) e ISA4ha. Preferiblemente, las secuencias de péptidos se transcriben y se traducen ya sea a partir de uno, dos o todas las secuencias de ácido nucleico; ISA2cd, ISA1mta, ISA3mx o ISA4ha y se incorporan en una estrategia de vacunación dirigida a inducir una respuesta inmune en un antígeno de superficie del ISAV y por lo tanto en el virus de la anemia infecciosa del salmón en si mismo. La invención dispone el uso de secuencias de ácido nucleico o de secuencias de péptidos como las definidas aquí en la preparación de una vacuna para la protección del pez contra el ISAV. La invención dispone además de una vacuna para proteger al pez contra el ISAV en donde la vacuna incluye secuencias de ácido nucleico o de péptido como las definidas aquí. Caracterización de las Nuevas secuencias de la Invención Las figuras acompañantes describen la invención con más detalle, en donde: La Figura 1 es la secuencia de nucleótidos de ISA2cd, La Figura 2 es la secuencia de aminoácidos que se obtiene a partir de la traducción de la secuencia de ácido nucleico ISA2cd enlistada en la Figura 1, La Figura 3 es la secuencia de nucleótidos de ISA1mta, 3 La Figura 4 es la secuencia de aminoácidos que se obtiene después de la trascripción de la secuencia de ácido nucleico enlistada en la Figura 3, La Figura es la secuencia exacta de nucleótidos de ISA3mx, 4 0 La Figura 6a es la secuencia de aminoácidos (M1) que se traduce a partir de la secuencia no empalmada de ácido nucleico de ISA3mx mostrada en la Figura, La Figura 6b es la secuencia de aminoácidos (M2) que se traduce a partir de la secuencia empalmada de ácido nucleico de ISA3mx mostrada en la Figura, y La Figura 6c es la secuencia de aminoácidos (M3) que se traduce a partir de la secuencia no empalmada de ácido nucleico de ISA3mx como se muestra en la Figura. Además, la información que detalla el peso molecular específico (MW) y los puntos teóricos de enfoque isoeléctrico (pl) se da al pie del respectivo listado de secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos mostradas en las figuras se representan adicionalmente en el listado acompañante de secuencia generado por Patent-In, en donde: 6 El número de Identificación de Secuencia 1 es la secuencia de nucleótidos de ISA2cd, como la mostrada en la figura 1, El número de Identificación de Secuencia 2 es la secuencia de aminoácidos de ISA2cd, como la mostrada en la figura 2, El número de Identificación de Secuencia 3 es la secuencia de nucleótidos de ISA1mta, como la mostrada en la figura 3, El número de Identificación de Secuencia 4 es la secuencia de aminoácidos de ISA1mta, como la mostrada en la figura 4, El número de Identificación de Secuencia es la secuencia de nucleótidos de ISA3mx, como la mostrada en la figura, 3

4 La Secuencia Identificada con el número 6 es la secuencia predicha de aminoácidos del producto no empalmado de ISA3mx, como la mostrada en la figura 6a, La Secuencia Identificada con el número 7 es la secuencia predicha de aminoácidos de ISA3mx empalmada, como la mostrada en la figura 6b, La Secuencia Identificada con el número 8 es la secuencia predicha de aminoácidos de ISA3mx empalmada, como la mostrada en la figura 6c, La Secuencia Identificada con el número 9 es la secuencia de nucleótidos de ISA4ha, como la mostrada previamente en la figura 7, y La Secuencia Identificada con el número es la secuencia de aminoácidos de ISA4ha, como la mostrada previamente en la figura 8. Las secuencias genéticas mostradas para ISA1mta e ISA2cd y las secuencias genéticas empalmadas y no empalmadas para ISA3mx se han derivado a partir del ADNc clonado, en donde los clones del ADNc se derivaron del material genómico del virus de la anemia infecciosa del salmón (ISAV). El material clonado se secuenció a partir de los sitios de inserción del extremo y del extremo 3 utilizando amplicones de superposición para producir una secuencia contigua. La veracidad de la secuencia contigua se confirmó por medio de la amplificación por medio de la Reacción en Cadena de la Polimerasa de la Transcriptasa Inversa (RT-PCR) de los amplicones de tamaño apropiado de tejido de salmón infectado con ISAV y de cultivos de tejido. Tales amplicones se obtuvieron sin embargo a partir de material de control no infectado, indicando que el material genético era originario del ISAV. Los marcos de lectura abierta (ORF) se completaron por medio de una amplificación rápida de los extremos del ADNc (RACE) a partir de la secuencia incompleta del cultivo de tejido infectado con el virus. Las correcciones fueron hechas para el ARNm trascrito in vivo que no fuera claro a partir de los ADNc originalmente clonados. El ORF de ISA2cd no tiene ninguna homología significativa en la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos con sometimiento previo a bases de datos accesibles por medio de BLAST. Sin embargo, las proteínas con pesos moleculares (Mw) y puntos isoeléctricos (pi) similares incluyen 14 proteínas virales en la base de datos Swiss-Prot tal como la hemaglutinina-neuraminidasa. El ORF de ISA1mta no tiene tampoco ninguna homología significativa con las proteínas previamente caracterizadas sometidas a las bases de datos investigables por BLAST. Sin embargo, es interesante que tenga características de peso molecular y de punto isoeléctrico (68-69 kda y pi 8,2) que son casi idénticas a las de una de las proteínas virales más predominantes identificadas por medio de electroforesis en dos dimensiones. La proteína parece estar integralmente asociada con las membranas de los cultivos de tejido infectados con el ISAV. Si el ORF produce tal proteína se lo consideraría valioso en cualquier estrategia de vacunación para reducir el nivel de infección del ISAV en cualquier especie salmonoide. Además, en las secuencias mostradas para ISA3mx, el ORF no empalmado (la base para la secuencia predicha de aminoácidos M1) no tiene ninguna homología significativa a nivel de la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos con el sometimiento previo a las bases de datos accesibles por medio de BLAST. Sin embargo, las proteínas con pesos moleculares y puntos isoeléctricos similares incluyen a varias proteínas de envoltura y recubrimiento viral enlistadas en la base de datos Swiss-Prot. Tanto las proteínas predichas M1 como M2 (obtenidas a partir de los ORF después del empalme de la secuencia de nucleótidos) se predice que son proteínas asociadas a la membrana y si los ORF codificados por ISA3mx producen tales proteínas se consideraría valioso en cualquier estrategia de vacunación para reducir el nivel de infección del ISAV en cualquier especie salmonoide. La traducción predicha de la proteína de M3 (mostrada en la figura 6c y el listado de secuencia acompañante) muestra homología con una proteína de fusión del paromixovirus asociada con la membrana celular y se piensa que está involucrada en la adhesión celular. En vista de esta homología exhibida, M3 es potencialmente valioso en cualquier estrategia de vacunación dirigida a reducir el nivel de infección del ISAV en cualquier especie salmonoide. La secuencia adicional relacionada con la secuencia de nucleótidos de ISA4ha se obtuvo por medio del siguiente procedimiento. La proteína de ISA4ha se detectó por medio de anticuerpos policlonales después de hibridación. Se encontró que la proteína se presenta en dos formas alternativas. Estas dos formas alternativas son de diferentes tamaños, y pueden ser vistas donde las proteínas se cultivan sobre diferentes líneas celulares, por ejemplo shc y chse. Ya que estas dos formas alternas fueron detectadas ambas por medio del anticuerpo y variaron en tamaño dependiendo de la forma en que se cultivaron, la proteína es potencialmente una buena candidata para virulencia. Se aisló y se secuenció, resultando en la producción de un fragmento de 24 aminoácidos. Cuando se sometió esta secuencia a las bases de datos investigables por BLAST, mostró similitudes con las secuencias de las cepas británica y noruega del ISAV. 4

5 Posteriormente, se diseñaron los cebadores con base en la secuencia de aminoácidos obtenida, junto con la referencia a las secuencias conocidas para las cepas similares británica y noruega. Los cebadores fueron entonces posteriormente utilizados en la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el fragmento relevante de ADN, que fue posteriormente secuenciado y traducido en la codificación de aminoácidos. Los listados del marco de lectura abierta obtenidos en la presente invención, tienen valor comercial particular por las siguientes razones: 1. Existen suficientes razones para creer que las secuencias de aminoácidos que corresponden a los nucleótidos tienen origen en el ISAV. Por lo tanto, su incorporación dentro de las vacunas de ácido nucleico puede tener impacto sobre la reducción de la mortalidad del salmón atlántico de piscifactoría causado por el ISAV que como se estableció anteriormente, puede reducir típicamente el rendimiento de la acuacultura por encima del %. 2. La caracterización del producto génico conducirá a la identificación de elementos clave en la patogénesis de la infección y al diseño de pruebas de diagnóstico más seguras que ayudarán también en estudios epidemiológicos que documenten la diseminación de diferentes cepas de la enfermedad. Cuando las secuencias de nucleótidos de ISA1mta, ISA2cd, ISA3mx, ISA4ha y los derivados asociados de las mismas se traducen en secuencias de proteína que están compuestas ya sea de aminoácidos idénticos o equivalentes, deben inducir una respuesta por medio del sistema inmune del huésped. Este principio puede extenderse adicionalmente para utilizar estas proteínas en pruebas diagnósticas y en procedimientos de vacunación

6 REIVINDICACIONES Una composición que contiene al menos una secuencia de aminoácidos escogida del grupo que consiste de las Secuencias Identificadas con los números 2, 4, 6, 7, 8 y ; secuencias sustancialmente homólogas siendo al menos 70% homólogas a ellas, y fragmentos de las Secuencias Identificadas con los números 2, 4, 6, 7, 8 y en donde dicha secuencia de aminoácidos es capaz de inducir una respuesta inmune. 2. Una composición de acuerdo a la reivindicación 1 en donde al menos una secuencia de aminoácidos es una forma truncada de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las Secuencias Identificadas con los números 2, 4, 6, 7, 8 y. 3. Una composición de acuerdo a la reivindicación 1 en donde al menos una secuencia de aminoácidos es la Secuencia Identificada con el número 2, o una secuencia sustancialmente homóloga siendo al menos 70% homóloga a ella, o un fragmento de la Secuencia Identificada con el número Una composición de acuerdo a la reivindicación 1 en donde dichas secuencias sustancialmente homólogas son al menos 80% homólogas.. Una composición de acuerdo a la reivindicación 1 en donde dichas secuencias sustancialmente homólogas son al menos 90% homólogas. 6. Una composición de acuerdo a la reivindicación en donde dicha secuencia de aminoácidos es la Secuencia Identificada con el número y las secuencias sustancialmente homólogas siendo al menos 90% homólogas a ella. 7. Una composición que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico escogida del grupo que consiste de las Secuencias Identificadas con los números 1, 3, y 9; secuencias sustancialmente homólogas siendo al menos 70% homólogas a ellas, y fragmentos de las Secuencias Identificadas con los números 1, 3, y 9 en donde el producto de la traducción de dicha secuencia de ácido nucleico es capaz de inducir una respuesta inmune. 8. Una composición de acuerdo a la reivindicación 7 en donde al menos una secuencia de ácido nucleico es una forma truncada de cualquiera de las Secuencias Identificadas con los números 1, 3, ó Una composición de acuerdo a la reivindicación 7 en donde al menos una secuencia de ácido nucleico es la Secuencia Identificada con el número 1, o una secuencia sustancialmente homóloga siendo al menos 70% homóloga a ella, o un fragmento de la Secuencia Identificada con el número 1.. Una composición de acuerdo a la reivindicación 7 o a la reivindicación 9 en donde dichas secuencias sustancialmente homólogas son al menos 80% homólogas. 11. Una composición de acuerdo a la reivindicación en donde dichas secuencias sustancialmente homólogas son al menos 90% homólogas. 12. Una composición de acuerdo a la reivindicación 11 en donde dicha secuencia de ácido nucleico es la Secuencia Identificada con el número 9 y las secuencias sustancialmente homólogas siendo al menos 90% homólogas a ella. 13. Una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 en donde la secuencia de ácido nucleico se incorpora en un plásmido. 14. Una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13 en donde la secuencia de ácido nucleico se incorpora en un vector de expresión.. El uso de una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en la preparación de una vacuna y/o de un medicamento terapéutico para la protección de los peces de la infección con el Virus de la Anemia Infecciosa del Salmón. 16. El uso de una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en la preparación de una prueba diagnóstica para detectar la presencia en los peces de la infección con el Virus de la Anemia Infecciosa del Salmón. 17. Una vacuna que contiene la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a

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17 LISTA DE SECUENCIAS 2 <1> Aqua Health (Europe) Limited Griffiths, Steven Ritchie, Rachael <1> Secuencia <1> P24268-/GST/RMC <0> GB <1> <0> GB <1> <0> GB <1> <1> <170> Patentin versión 3.0 <2> 1 <211> 1821 <212> ADN <213> Virus de la Anemia del Salmón <0>

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20 2 <2> 2 <211> 78 <212> PRT <213> Virus de la Anemia del Salmón <0>

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22 <2> 3 <211> 18 <212> ADN <213> Virus de la Anemia del Salmón 6 6

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25 <2> 4 <211> 616 <212> PRT <213> Virus de la Anemia del Salmón 6 9

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28 <2> <211> 0 <212> ADN <213> Virus de la Anemia del Salmón <0> 6 12

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