11 kn. de publicación: ES kint. Cl. 5 : C12P 21/00. Número de solicitud europea: kfecha de presentación :

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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 kn. de publicación: ES kint. Cl. : C12P 21/00 A61K 39/39 C12N 1/00 G01N 33/77 A61K 47/00 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 k Número de solicitud europea: kfecha de presentación : k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Anticuerpos monoclonales contra la proteína E7 del papilomavirus humano tipo 16, procedimiento para su preparación, así como su empleo. kprioridad: DE k Titular/es: Behringwerke Aktiengesellschaft Postfach 11 D-01 Marburg, DE k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Oltersdorf, Tilman; Röwekamp, Walter; Seedorf, Klaus y Gissmann, Lutz k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Díez de Rivera y Hoces, Alfonso Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 1 ES T3 2 DESCRIPCION Los papilomavirus humanos (HPV) se descubrieron en relación con neoplasmas epiteliales benignos (verrugas; condilomas en la zona genital) y malignos (carcinoma de la piel y de la mucosa genital). Dado que los papilomavirus no se pueden desarrollar en cultivo, la obtención de cantidades dignas de mención de proteínas víricas presupone procedimientos de tecnología genética. Este método se utilizó recientemente para preparar anticuerpos policlonales contra algunas proteínas codificadas por HPV. Con estos anticuerpos policlonales se consiguió de nuevo la detección de algunas proteínas víricas en líneas de células HPVpositivas que se derivaban de carcinomas de la cerviz (Seedorf et al. (1987) EMBO J 6; , D. Smotkin y F.O. Wettstein (1986) Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 83, y D. Smotkin y F.O. Wettstein (1987); J. Virol. 61, ). El presente invento concierne a anticuerpos monoclonales (MAK), que están dirigidos contra la proteína E7 de 1 kd de tamaño de papilomavirus humano 16 (HPV 16 E7). Estos anticuerpos se pueden utilizar en calidad de agente de diagnóstico, principio activo o soporte de principio activo. Se podían obtener hibridomas, cuyos MAK segregados se caracterizaron (E7II-E7VI). Todos los MAK reaccionaban de forma positiva en un análisis con enzima unida a inmunosorbente (ELISA), a cuya fase sólida estaba adsorbida una proteína de fusión MS-2/HPV 16 E7 (véase más abajo). En la correspondiente transferencia de Western no se podía detectar ninguna reacción para E7III. En líneas de células con contenido de HPV 16, la proteína E7 se podía detectar en la transferencia de Western con E7II, E7IV, E7V y E7VI, en la inmunoprecipitacióncon E7II y E7IV, no sometiéndose a ensayo E7III y E7V (Tabla 1). En estudios de fijación competitivos, E7II, E7IV, E7V y E7VI mostraban fuertes propiedades inhibidoras, mientras que E7III inhibía de forma más débil pero significativa. Una mezcla de E7II, V, VI precipitaba HPV16 E7 a partir de una tanda de traducción in vitro de ARN específico de HPV-16-E7, lo que demuestra asimismo la especificidad de estos MAK. E7III reacciona de forma cruzada con HPV18 E7. La detección de HPV16 E7 adquiere adicionalmente importancia, ya que E7 es la proteína de máxima expresión en líneas de células con contenido de HPV16 óhpv18,ye7podría jugar un papel en el mantenimiento del fenotipo transformado. En lo que sigue, se describe la ejecución adicional del invento. 1.a. Expresión de la proteína de fusión MS- 2/HPV16 E7 utilizada para la inmunización En Seedorf et al. (1987), EMBO J. 6, se describen contrucciones de plásmidos, así como el aislamiento y la purificación de proteínas HPV16 expresadas. La proteína HPV16 E7 utilizada a continuación no posee los primeros 8 aminoácidos. Está fusionada con un péptido conductor N-terminal que consiste en 0 aminoácidos de la MS-2- polimerasay9aminoácidos de secuencias de polienzador y se empleó con una pureza de aproximadamente 70%. 1.b. Análisis con enzima unida a inmunosorbente (ELISA)-realización Placas de ensayo ELISA (Nunc, Dinamarca) se incubaron durante una noche a temperatura ambiente con 0,2-0, µg por pocillo de la proteína MS-2, MS-2/HPV16 E7 ó MS-2/HPV18 E7 purificada en 0 µl de urea 7M (durante 12 horas a temperatura ambiente). Después de lavar por dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), las placas se saturaron durante una hora 37 Cconsolución de albúmina de suero bovino al 2% en PBS y, por consiguiente, estaban listas para ser empleadas después de lavar 3 veces en PBS. En cada caso µl de materiales sobrenadantes de células de hibridoma a ensayar por pocillo se incubaron durante una hora a temperatura ambiente, se eliminaron componentes no fijados lavando 4 veces con PBS que contenía 0,0% de Tween (PBS/ Tween), y se incubaron de nuevo durante una hora con una inmunoglobulina anti-ratón de cabra (IgG, IgM) conjugada mediante peroxidasa de rábano picante (Dianova, Hamburgo) en una dilución de 1:00 (1 hora, temperatura ambiente). Después de lavar cuatro veces con PBS/ Tween para eliminar los reaccionantes no fijados, se detectó la peroxidasa fijada mediante incubación con solución de H 2 O 2 /cromógeno (0,01% de H 2 O 2, 1 mg/ml de ortofenilendiamina en tampón fosfato 0,1 M, ph,) y medición de la extinción a 492 nm, tras lo cual, después de minutos, se había detenido la reacción enzimática mediante adición de 0 µl deh 2 SO 4 1M. 2. Aislamiento del hibridoma De manera en sí conocida (G. Köhler y C. Milstein (197), Nature 26, ) se obtenían aproximadamente 00 hibridomas a partir de fusiones de células del bazo de ratones inmunizados Balb/c con células de mieloma. En este caso, se han fusionado células de mieloma NS-1 (Kearny et al. (1979), J. Immunology 123, ) con células del bazo procedentes de ratones Balb/c. Estos ratones Balb/c de seis semanas de edad se habían inmunizado previamente a intervalos de 2 semanas dos veces por vía subcutánea y, a continuación, una vez por vía intraperitoneal tres días antes de la fusión, en cada caso con - µg de la proteína de fusión MS-2/HPV16 E7 descritaenelapartado1. Los hibridomas que segregaban anticuerpos contra HPV16 E7 se podían detectar mediante ensayo paralelo en dos análisis con enzima unida a inmunosorbente (ELISA). Con ello, en la fase sólida de un ELISA estaba adsorbida la proteína de fusión MS- 2/HPV16 E7 y en la fase sólida del otro

3 3 ES T3 4 sólolaproteína MS-2. Los anticuerpos fijados de materiales sobrenadantes del hibridoma se detectaron mediante incubación con anticuerpos anti-ratón de cabra que estaban conjugados con peroxidasa de rábano picante. En los aproximadamente 00 hibridomas antes mencionados, aproximadamente clones eran positivos en la evaluación con el ELISA de MS-2 y clones eran adicionalmente positivos con el ELISA de MS-2/HPV16 E7. De estos clones, 6 eran estables después de dos tandas de clonación para producir clones individuales en una capa de alimentación de macrófagos de ratón peritoneales (Tabla 1). 3. Caracterización de MAK específicos de HPV16 E7 En la transferencia de Western, realizada en esencia según Towbin et al. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 76, 4-434, los MAK segregados de 4 hibridomas (E7 II, E7 IV, E7 V, E7 VI) reaccionaban con la proteína de fusión MS-2/HPV16 E7 y no sólo con la proteína MS-2. Para someter a ensayo la especificidad del tipo, se investigaron los 4 hibridomas mencionados con un ELISA análogamente a como se describe en el apartado 2., estando sin embargo adsorbida la MS-2/HPV18 E7 a la fase sólida. Los MAK del hibridoma E7 IV reaccionaban de forma positiva, pero los valores de extinción en este ELISA eran menores que el 0% de los valores con el correspondiente ELISA de MS-2/HPV16 E7. Se llevaron a cabo ensayos de fijación competitivos para el análisis adicional de los MAK, tal como se describe en el apartado 1.b (proteína MS-2/HPV-16 E7 en la fase sólida). En este caso, se emplearon MAK de E7 IV, E7 V y E7 VI como conjugados de peroxidasa de rábano picante (Ishikawa et al. (1983), J. Immunoassay 4, 9-327) en cada caso con µg/ml, mientras que los MAK de E7 II, III, IV, V, VI no conjugados se pasaron a emplear en diluciones en seriede0µg/ml (= 0% de inhibición del conjugado de MAK homólogo). En estos ensayos (figura 1) todos los MAK que reaccionaban en la transferencia de Western con HPV16 E7 (MAK de E II, E IV, E V, E VI) se inhiben mutuamente. El MAK de E7 III, que sólo reaccionaba en el ELISA específico de HPV16 E7, inhibe claramente de forma menor a los otros MAK, pero todavía de forma significativa frente a un anticuerpo testigo de otra especificidad (figura 1, columnas C). En la figura 1 se representa en ordenadas la extinción relativa (% A 492) con respecto a las diferentes combinaciones de ensayos de fijación competitivos en abscisas, significando 0 ninguna adición de MAK no marcado (correspondiente a 0% de A 492). Estos resultados sugieren que los MAKdeE7II,E7IV,E7VyE7VIreaccionan con epítopes topológicamente muy similaresperonoidénticos, tal como lo demuestra también la reacción cruzada de E7 IV con HPV18 E7. Posiblemente, E7 III reacciona con un epítope muy contiguo. 4. Detección de HPV16 E7 por MAK en líneas de células que contienen HPV16 a) Transferencia de Western Se llevaron a cabo transferencias de Western de forma conocida (Towbin et al. véase cita anterior), después de haber separado los extractos de células de la línea de células CaSKi (R.A. Patillio (1977), Science 196, 146-8) o de la línea de células SiHa (Friedl, F. et al. (1979), Proc. Soc. Experiment. Biol. and Med. 13, 43-4) previamente en electroforésis en gel de poliacrilamida con SDS al %, en esencia como se describe (Laemmli, V.K. (1970), Nature 227, ). Con E7 II, E7 IV, E7 V y E7 VI se podía detectar la proteína HPV16 E7 de 1 kd de tamaño en las dos líneas de células. b) Inmunoprecipitación Se llevaron a cabo inmunoprecipitaciones según N. Koch y G.J. Hämmerling (1982), J. Immunol. 128, E7 II y E7 IV precipitaban HPV16 E7 a partir de células CaSKi, mientras que en el caso de células testigo sin HPV no se obtenían ningunos precipitados específicos. En la Tabla 1 están recopiladas las propiedades de los MAK obtenidos (E7 I - E7 VI). TABLA 1: isotipos de los MAK específicos de HPV16 E7 y su reactividad. Reactividad con Isotipo MS-2/ Proteína E7 MAK de anti /HPV16 (células CaSKi cuerpos E7 en ósiha)en ELISA A A B E7 I IgG inespecífica E7 II IgG 2a E7 III IgG nd E7 IV IgG 2a E7 V IgG nd E7 VI IgG Siendo: ) nollevadaacabo. A Transferencia de Western B Inmunoprecipitación Los números de depósito de la Colección EuropeadeCultivosdeCélulas Animales (ECACC) para los MAK antes mencionados, que se depositaron en forma de los hibridomas, son como sigue (E7 II - E7 VI): , , , ,

4 ES T3 6 REIVINDICACIONES 1. Procedimiento para la preparación de anticuerpos monoclonales E7II, E7III, E7V y E7VI, caracterizado porque se cultivan hibridomas con el número de depósito ECACC , ECACC , ECACC , ECACC yECACC yse aíslan los anticuerpos segregados. 2. Procedimiento para la detección in vitro de papilomavirus humanos, caracterizado porque se emplea uno o varios de los anticuerpos monoclonales preparados según la reivindicación Empleo de un anticuerpo monoclonal preparado 1, en un agente de diagnóstico. 4. Empleo de un anticuerpo monoclonal preparado según un procedimiento según la reivindi- 1 cación 1, para un principio activo farmacéutico.. Empleo de un anticuerpo monoclonal preparado 1, para la preparación de un medicamento para empleo terapéutico. 6. Empleo de un anticuerpo monoclonal según la reivindicación3o,caracterizado porque el anticuerpo está marcado. 7. Empleo de un anticuerpo monoclonal preparado 1, para la preparación de un agente de diagnóstico para el análisis de tejidos y fluidos corporales y para el radioinmunocentelleo. 8. Empleo de un anticuerpo monoclonal preparado 1, para la preparación de un agente terapéutico para la radioinmunoterapia o para la quimioinmunoterapia NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluída en la mencionada reserva. 4

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