INFORME FINAL DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

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1 INFORME FINAL DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN TITULO: FRECUENCIA DE MUTACIONES GENÉTICAS ASOCIADAS A MULTIDROGORESISTENCIA EN Mycobacterium tuberculosis Autor Blg. Roger Iván Calderón Espinoza Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular. Instituto Nacional de Salud. Av. Defensores del Morro Chorrillos, Lima 9 - Peru Tlfn (511) Anx 424 Fax (511) Anx 541 Movil. (511) rcalderon@ins.gob.pe rivance@yahoo.com

2 RESUMEN Organización: Pacientes con diagnóstico de tuberculosis pulmonar procedentes de comunidades de alta incidencia de tuberculosis resistente en Lima. Objetivo: Determinar la frecuencia de las mutaciones involucradas a la resistencia a las principales drogas de M. tuberculosis y evaluar la capacidad predictiva de resistencia y multidrogoresistencia en pacientes nunca tratados y antes tratados. Diseño: Determinar la secuencia nucleotídica de regiones de los genes asociadas con resistencia antituberculosa en M. tuberculosis y analizar la capacidad predictiva de la presencia de mutaciones y su aplicabilidad en el diseño de estrategias de detección de multidrogoresistencia a partir de mutaciones alelo-específicas. Resultados: Se determino la secuencia nucleotídica en aislamientos de MTB procedentes de pacientes con diagnóstico de TB Pulmonar BK[+]. La frecuencia de mutaciones para el gen rpob (n= 88) fue 68.2% para el codón 531 (S531L), 17% para el codón 526 y 14.8% para el codón 516. En katg (n=95), 46.3% de los aislamientos resistentes a isoniacida presentaron la mutación S315T y en el gen rpsl (n=80) las mutaciones en el codon 43 (Lys Arg), 88 (Lys Thr) presentaron una frecuencia de 8,8 % cada una. Además se determino la variabilidad genética a 38 aislamientos de MTB MDR mediante Spoligotyping encontrándose 02 cepas con genotipo Beijiing, así como representantes del genotipo LAM (Latinoamericano 1 y 9), Harlem (1 y 3), y T1. Conclusión: Este trabajo permitió la determinación de cambios nucleotídicos responsables de la resistencia a tres drogas antituberculosas de primera linea, lo cual puede explicar las diferencias en los regímenes terapéuticos y tasas de cumplimiento de tratamiento en cada una de las regiones evaluadas. Estos resultados pueden orientar la aplicación de metodologías de detección de resistencia mediante el análisis alelo específico contribuirá con el control de la tuberculosis, identificando correcta y oportunamente a los pacientes infectados con bacilos resistentes y MDR, permitiendo la reducción de casos de TB y TB resistente en nuestro país. Palabras Clave: Tuberculosis multiresistente; validación, PCR UHG-Rif

3 INTRODUCCIÓN La resistencia antimicrobiana en Mycobacterium tuberculosis (MTB) emerge por subóptimos tratamientos y amenaza a los esquemas de tratamiento (DOTS: Direct Observed treatment short course), disminuyendo así la efectividad del control de la enfermedad. En nuestro país, la resistencia a drogas del MTB afecta al 17.8 % y 23.5% % de los casos de TB nunca tratados y antes tratados respectivamente. Los pacientes infectados con MTB resistente o MDR presentan una menor efectividad de curación, por lo que se busca un tratamiento alternativo, que pueda controlar efectivamente la TB MDR a pesar de la actual terapia cuyo proncipál objetivo es disminuir la emergencia de mutantes (Rattan y col., 1998) muy a pesar de la presión selectiva generada (Long, 2000). En el caso de pacientes en los que se ignora que contienen cepas resistentes, el régimen terapéutico inicial es inefectivo (Ramaswamy y Musser, 1998). Así la incapacidad de la detección temprana de pacientes con cepas resistentes se convierte en un factor principal de la generación de cepas de MTB-MDR (Rattan y col., 1998). La identificación temprana de los pacientes resistentes es una meta por lograr. La detección molecular de la resistencia por PCR-SSCP y PCR heteroduplex es rápida (Williams y col., 1995). Pero en TB, la resistencia es debida por cambios nucleotídicos en la secuencia nucleotídica de los genes blancos de las drogas. Dado que la aparición de mutaciones sigue un patrón característico, el presente trabajo intenta describir la frecuencia de mutaciones que representen el mayor porcentaje de aislamientos resistentes y MDR de dos zonas de Lima. La inespecificidad, inexactitud y demora en el diagnóstico tienen un serio impacto tanto para el paciente como para los programas de control. Los esquemas de tratamiento requieren de métodos diagnósticos que puedan determinar la resistencia primaria y adquirida, lo cual optimizaría el control de la enfermedad. Dado que los existentes sistemas de detección de resistencia son muy lentos, es necesario que el desarrollo e implementación de nuevas estrategias de detección

4 temprana de la resistencia antituberculosa, ya que proporcionarán la información en el tiempo adecuado, lo cual permitirá dirigir con eficacia el tratamiento antituberculoso. En nuestro país no existen métodos de detección rápida, altamente sensibles y específicos para la detección de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistentes a medicamentos. Nuestros resultados servirán para detectar las mutaciones más frecuentes encontradas en los bacilos tuberculosos encontrados en una muestra poblacional de pacientes procedentes de regiones con alta incidencia de resistencia y drogoresistencia. Cada mutación genética frecuente puede consolidarse como un marcador de resistencia para los nuevos sistemas de tamiz en la detección de la resistencia a drogas en pacientes con tuberculosis. El tratamiento de enfermedades infecciosas con combinaciones de efectivos antibióticos es un método comprobado que limita la emergencia y la diseminación de nuevos o ya existentes patógenos antibiótico-resistentes (Williams y Gillis 1999). La resistencia a la rifampicina es resultado de mutaciones que ocurren en una discreta región central del gen rpob, de aproximadamente 69 pb ubicado entre los codones 507 al 533 (Musser, 1995), las cuales confieren cambios conformacionales que dirigen a una unión defectiva de la droga. Por su parte la resistencia a isoniacida está asociada con una variedad de mutaciones que afectan a uno o más genes tales como los que codifican a la catalasa-peroxidasa (katg), una proteína envuelta en la síntesis de ácido micólico (inha) y un gen recientemente descrito que codifica una alquil-hidroperóxido reductasa (ahpc), y que esta envuelto en la respuesta celular al estrés oxidativo (Telenti y col., 1997). La resistencia a etambutol y pirazinamida por su parte se caracterizan por la aparición de mutaciones en los genes emba-b y pnca-b, y por último, las mutaciones en los genes rpsl, gyra y rrs generan la resistencia a estreptomicina (Musser, 1995). Dado que la aparición de mutaciones sigue un patrón característico, el presente trabajo intenta describir la frecuencia de mutaciones que representen el mayor porcentaje de aislamientos resistentes y MDR de dos zonas de Lima. Para ello se hará un monitoreo de la secuencia nucleotídica de los genes asociados a la resistencia a las principales drogas antituberculosas y finalmente se evaluará la capacidad predictiva que tengan los distintos cambios nucleotídicos en la resistencia o MDR antituberculosa. La información obtenida será útil para el establecimiento de

5 nuevos métodos diagnósticos para la detección temprana y específica de Mycobacterium tuberculosis resistentes y MDR, los cuales sean útiles, a mediano plazo, para el mejoramiento y optimización del control de la enfermedad en el país.

6 OBJETIVOS Determinar la frecuencia de las mutaciones involucradas a la resistencia a las principales drogas a partir aislamientos de M. tuberculosis provenientes de pacientes con tuberculosis pulmonar resistente y multidrogoresistente. - Determinar las mutaciones en los principales genes implicados en la resistencia a drogas antituberculosas (rpob, katg y rpsl) en aislamientos resistentes y multidrogoresistentes de M. tuberculosis. - Determinar la frecuencia de mutaciones asociada a la resistencia y multidrogoresistencia - Evaluar la capacidad predictiva de resistencia y multidrogoresistencia, de las mutaciones encontradas en pacientes nunca tratados y antes tratados.

7 MATERIALES Y MÉTODOS Diseño experimental Se realizó un estudio observacional para determinar la frecuencia de mutaciones encontradas en los genes rpob, katg y rpsl de Mycobacterium tuberculosis resistente a drogas (rifampicina, isoniacida y streptomicina. La selección de aislamientos resistentes fue realizada siguiendo el resultado de susceptibilidad antituberculosa por el método de proporciones de Canetti y col. variante económica. Las muestras clínicas fueron obtenidas en los Laboratorios de Referencia de las Direcciones Regionales de Lima Este y de Lima Ciudad. Los procedimientos de cultivo y susceptibilidad antituberculosa fueron realizados en el Laboratorio de Referencia Nacional de Micobacterias; mientras que el PCR Secuenciamiento fue realizado en el Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular, del Instituto Nacional de Salud. Población y reclutamiento de los participantes La muestra fue conformada por pacientes procedentes de dos localidades de Lima, cuyos registros indicaron una elevada tasa de TB-resistente. Los casos incluidos fueron pacientes con diagnóstico de TB pulmonar con baciloscopía positiva, siendo nunca tratados pero con antecedente de contacto de tuberculosis resistente, o antes tratados (recaída, fracaso o abandono). Además de ello debieron presentar un resultado de resistencia a por lo menos una droga antituberculosa. Procedimientos Un volumen de 3 ml de cada muestra de esputo fue descontaminado con NaOH/N acetil L cisteína, neutralizada, resuspendida en buffer fosfato 9, una tercera parte fue separada e inactivada por calentamiento a 95 C dura nte 15 minutos. Luego para asegurar una máxima pureza y conservación, el ADN genómico fue purificado

8 mediante el protocolo para lisados celulares usando el QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Mediante el uso de un Termociclador PE Applied Biosystem 2400, un fragmento de 195 pb del gen rpob fue amplificado usando oligonucleótidos reportados por Whelen y col (1995). La amplificación de las regiones en el gen katg, involucrada en la resistencia a isoniacida fue realizada usando los oligonucleótidos reportados por Telenti y col, Por su parte la secuencia del gen rpsl fue amplificada usando los primers reportados por Victor y col., (1998). Usando 5 ng de ADN genómico de cada aislamiento como molde se realizaron las amplificacioines y luego los productos fueron purificados y su secuencia nucleotídica fue determinada en el secuenciador automático ALF Express de Amersham Pharmacia Biotech del Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular del Instituto Nacional de Salud e interpretadas en el software ALFWin TM Sequence Analyser Ensayo de genotipificación mediante Spoligotyping Fue usado un kit comercialmente disponible (Isogen Bioscience BV, Maarssen, The Netherlands) de acuerdo a como es descrito en el manual de procedimientos. En resumen, se amplificaron unas regions especiadores intergenicos con los primers DRa and DRb con un set de 43 oligonucleotidos spaciadores derivados de las secuencias especiadoras de M. tuberculosis H37Rv y M. bovis P3. Los productos fueron hibridizados en una membrane pre cubierta y las señales fueron detectadas por quimioluminiscencia. Analisis de los perfiles fue realizado por coparacion en la base de datos de spoligotipos (CDC) definiendo claramente los genotipos y lineajes.

9 RESULTADOS 95 muestras de esputo frotis positivos fueron analizadas mediante secuenciamiento de los genes katg, 88 muestras fueron analizadas para el gen rpob y 80 para el gen rpsl. Estas muestras de esputo fueron obtenidas de pacientes con tuberculosis pulmonar analizando sólo aquellas muestras en las cuales los resultados presentaron resistencia a por lo menos las drogas rifampicina, isoniacida y estreptomicina y en las que pudieron completarse la amplificación por PCR. El perfil de susceptibilidad antituberculosa encontrada en los aislamientos procedentes de los pacientes de Lima Ciudad y Lima Este muestra que la resistencia a isoniacida se presentó en un 59.4%, a rifampicina en 56.1%, a estreptomicina en 52.2% y la multidrogoresistencia se presento en 53.9%. En los pacientes nunca tratados se encontro que la resistencia a isoniacida se presentó en 35.6%, rifampicina en 28.9%, estreptomicina en 33.3% y la MDR 28.9%. Por su parte en los pacientes antes tratados se encontró que la resistencia a isoniacida se presentó en 67.4%, a rifampicina en 65.2%, estreptomicina en 58.5% y la MDR 62.2%. El análisis de la secuencia del gen katg mostró que el codon 315 presento mutaciones en el 46.3% de las muestras analizadas. El cambio nucleotídico S315T presentó una frecuencia del 44.2%, mientras que el cambio nucleotídico S315N presentó sólo una frecuencia del 2.1%. El análisis de la secuencia del gen rpob mostro que el codon 531 presento mutaciones en el 68.2% de las muestras analizadas. El cambio nucleotídico S531L presentó una frecuencia del 67.05%, mientras que el cambio nucleotídico S531W presentó una frecuencia del 1.14%. Así mismo el codon 526 presentó mutaciones en el 12.5% de las muestras analizadas, teniendo el cambio nucleotidico H526R una frecuencia de 5.68%, el cambio H526L presentó una frecuencia de 3.41%.Por su parte el codon 516 presento mutaciones en el 14.8% de las muestras analizadas, teniendo el cambio nucleotídico D516V una frecuencia del 9.09%, y los cambios D516G y D516Y una frecuencia de 3.41% y 2.27% respectivamente.

10 El análisis de la secuencia del gen rpsl mostró que los codones 43 y 88 presentaron mutaciones en una frecuencia de 8.8% cada una. Es importante señalar que una pequeña proporción de muestras analizadas no presentaron mutaciones (< 2%) en la región analizada mientras que fueron resistentes por el método estándar de determinación de susceptibilidad antituberculosa. El análisis de spoligotyping fue realizado en 38 aislamientos seleccionados de acuerdo a su resultado de susceptibilidad antituberculosa. Los aislamientos analizados fueron multidrogoresistentes que procedían indistintamente de Lima Ciudad y Lima Este. Los patrones geneticos mostrados por el análisis mencionado se muestran en la Fig. Nº 1. En ella se pueden observar la variabilidad geneática de los perfiles obtenidos, tales que comparados con las base de datos internacionales mostraron los lineajes LatinoAmericano (LAM3, LAM9); T1, Haarlem (Haa1 y Haa3) y el linaje Beijing (02 individuos).

11 DISCUSIÓN El análisis nucleotídico de los genes rpob, katg y rpsl han permitido explicar ampliamente el mecanismo asociado a la resistencia tanto a rifampicina, isoniacida y estreptomicina, respectivamente. En este trabajo, la mayor parte de los individuos analizados ha mostrado una adecuada concordancia entre la presencia de mutaciones en esos genes y la aparicion de resistencia a los fármacos antituberculosos mencionados. Un muy bajo porcentaje de casos analizados no ha presentado mutaciones en la region analizada pudiendo entonces localizarse en diferentes lugares o fuera de las denominadas regiones calientes, fuertemente asociadas a fármaco-resistencia. Tal es el caso de la presencia de mutaciones en el gen rpob, el 1% de los casos analizados no mostraron mutaciones en la region de 81pb, pudiendo corresponder con mutaciones en los codones 176 y otras fuera del cluster I, tal y como es reportado en trabajos anteriores. En el caso de isoniacida, la presencia de otros genes asociados a resistencia, tales como los genes ahpc, el gen inha así como su región reguladora, el gen kasa, entre otras presentan responsabilidad alguna en la determinación de la resistencia. Sin embargo tambien existe la posibilidad de encontrar mutaciones en el codon 463 en el gen katg que podría explicar la baja tasa de mutagénesis del codon 315 para el caso de resistencia a este fármaco antituberculoso de suma importancia en la terapia. La presencia de mutaciones en los codones 516, 526 y 531 en el gen rpob es completamente excluyente entre ellas. Sin embargo se han encontrado acompañadas por mutaciones silenciosas o aquellas que no conducen a un cambio aminoacidico en la proteína blanco del fármaco, en los codones 532 y 533. Es importante anotar que la presencia de mutaciones en el codon 315 del gen katg es mas frecuente en la población multidrogoresistente en antes tratados (46.8%) que en nunca tratados (37.5%). Asi tambien el cambio S315N se dio solo en el 2.5% de los casos antes tratados.

12 Algunos estudios con modelos animales han determinado la importancia de aislamientos pertenecientes al lineaje Beijing, debido a su alto grado de virulencia, sin embargo la investigación de las características de diseminación y epidemiología de estos lineajes se ha encontrado restringida debido a que la metodología de determinación de perfiles mediante RFLP presenta algunas limitaciones. Sin embargo, el spoligotyping se presenta como una estrategia rápida en la determinacion de lineajes, lo cual puede establecer prevalencia y entender la dinamica de diseminación de cepas. La prevalencia de Beijing es muy baja en Sudamérica (2%); de 3 a 5% en Centro América, Europa y África; 10% en el medio Oriente; 13% en Oceanía; 16% en Norte America y entre el 45 y 86% en los países del asiaticos. Por su parte existe tambien una importante diseminación del genotipo Haarlem (H), en países de Europa, mientras que en Sud America en donde el genotipo T y LAM tienen una prevalencia superior (30 y 50% respectivamente), sugiriéndose que el lineaje H pudo haber ingresado a Sudamérica luego de la colonización europea. El ingreso de estos genotipos y su elevada diseminación en estos últimos tiempos puede explicar fenómenos aun no bien definidos como la alteración e incremento de los niveles de multidrogoresistencia en el país, por lo que es necesario construir nuevas investigaciones orientadas a vigilar, prevenir y controlar la transmisión de cepas pertenecientes principalmente a genotipos como Beijing, ya que pueden desestabilizar el éxito obtenido por los actuales programas de tratamiento de la tuberculosis en el país. Finalmente, mediante este trabajo estaría demostrando la potencial utilidad de los ensayos basados en la determinación de la susceptibilidad antituberculosa mediante el screening o tamizaje de mutaciones en los genes asociados a resistencia. Sólo la deteccion de mutaciones en los codones 516, 526 y 531 del gen rpob puede detectar al 95.5% de los casos resistentes a rifampicina, mientras tanto que el barrido de deteccion en la region completa desde el codon 507 a 542 podría identificar al 98.9% de los casos resistentes a la droga y perfectamente a todos los MDR.

13 El desarrollo de ensayos como Inno LiPA y PCR Alelo-específico presentarán sus diferencias en la identificación de pacientes con TB MDR en laboratorios de países en desarrollo, colocando al PCR-UHG Rif o Deteccion por hibridación alelo específica en una adecuada posición como herramienta de laboratorio aplicada al diagnóstico de TB resistente. La implementación podría permitir la correcta identificación y diagnóstico de pacientes con TB MDR en pacientes con alta sospecha de tuberculosis resistente en la comunidad, tales como los pacientes antes tratados y contactos de pacientes con tuberculosis resistente que provengan de algunas zonas de los distritos de Lima y Callao, en donde se hayan ubicado bolsones de TB y TB resistente, así también como aquellos pacientes hospitalizados, presidiarios, VIH positivos, que conforman reconocidos grupos de riesgo para TB MDR, favoreciéndose la oportunidad de recibir un optimo tratamiento que permita la disminución de la transmisión de esta enfermedad en países en desarrollo como el Perú.

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18 Fig. Nº 01: Patrones de aislamientos de Mycobacterium tuberculosis multidrogoresistentes procedentes de pacientes con diagnóstico de tuberculosis pulmonar de Lima Ciudad y Lima Este, período Marzo a Setiembre del M.tb H37Rv M. bovisp3 Haarlem 3 Haarlem 1 Unico T1 Haarlem 3 T1 LAM5 LAM9 T1 LAM3 T1 X1 T1 Haarlem 3 Negativo Haarlem 3 1 Haarlem 3 Beijiing Unico LAM5 Beijiing LAM9 Unico 1 Haarlem 3 Unico 1 T1 Unico