11 knúmero de publicación: kint. Cl. 6 : A23J 1/20. k 72 Inventor/es: Stack, Francis Martin; k 74 Agente: Durán Moya, Carlos

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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 6 : A23J 1/ k 12 TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 k k k k 86 Número de solicitud europea: Fecha de presentación : Número de publicación de la solicitud: Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Procedimiento para el fraccionamiento de los componentes del suero de la leche. k Prioridad: IE 0489/94 k 73 Titular/es: DAIRYGOLD TECHNOLOGIES LIMITED Stapleton House, 89 South Mall Cork, IE k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Stack, Francis Martin; Hennessy, Mark; Mulvihill, Daniel y O Kennedy, Brendan Thomas k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Durán Moya, Carlos ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 1 ES T3 2 DESCRIPCION Procedimiento para el fraccionamiento de los componentes del suero de la leche. La presente invención se refiere a la recuperación de proteínas y otros productos del suero de la leche y, en particular, se refiere al fraccionamiento de alfa-lactalbumina y beta-lactoglobulina del suero. El suero de la leche es un producto acuoso sobrante de la fabricación de ciertos productos lácteos, tales como queso y caseínas. Además de una partedegrasasdeorigenlácteo, el suero de la lechecontieneproteínas, lactosa y minerales. Las proteínas predominantes en el suero son alfa-lactalbumina y beta-lactoglobulina. Estos componentes son económicamente valiosos por si mismos y, en particular, cuando se recuperan en forma parcial o sustancialmente purificada. Un procedimiento conocido por el tratamiento del suero de la leche es el descrito en el documento EP B1. En este procedimiento (que a continuación se indicará como procedimiento Pearce ), el suero de la leche en bruto es tratado para reducir su peso específico y su concentración iónica a un nivel no inferior a 2 % de los valores originales. Antes o después del tratamiento, el ph es ajustado a valores comprendidos entre 3,8 y, por la añadidura de un ácido. A continuación, el suero de la leche es calentado a una temperatura comprendida entre Cy70 C durante un tiempo mínimo de segundos para permitir la agregación selectiva de la fracción de alfa-lactalbumina. Después de ello, el suero de la leche es enfriado por debajo de C durante un tiempo suficiente para permitir la floculación de la proteína agregada y se recoge la alfa-lactalbumina floculada. La beta-lactoglobulina permanece soluble en las condiciones utilizadas junto con otros componentes del suero de la leche, tales como lactosa, y se puede recuperar a partir del licor madre en caso necesario. Otros procesos para recuperar las fracciones de la proteína purificada a partir del suero de la leche se han descrito en el documento Amundson, C.H. yotros, Journal of Food Processing and Preservation 6, -71, El procedimiento Amundson varía significativamente del procedimiento Pearce por el hecho de que es la beta-lactoglobulina la que se precipita de manera selectiva, permaneciendo la alfalactalbumina en solución en el licor madre. De acuerdo con el procedimiento Amundson, se trata el suero de la leche en bruto para concentrar la proteína eliminando fracciones de bajo peso molecular tales como agua, minerales y lactosa. El ph del concentrado se ajusta a 4,6, seguido de una fase de desmineralización para eliminar iones de bajo peso molecular incluyendo iones calcio. El ph es reajustado, a continuación, a 4,6. En las condiciones de ph y baja concentración iónica que se utilizan, la beta-lactoglobulina se aglomera y puede ser separada como precipitado, dejando la alfa-lactalbumina en solución. La presente invención pretende dar a conocer un procedimiento integrado eficaz para el tratamiento de suero de la leche para la recuperación de sus componentes, en particular una fracción de beta-lactoglobulina sustancialmente pura, una fracción enriquecida de alfa-lactalbumina y lactosa. De acuerdo con lo anterior, la presente invención da a conocer un procedimiento para la recuperación de los componentes del suero que comprende las siguientes fases: (a) reducción del contenido mineral del suero de la leche en bruto y reduciendo en particular el contenido de calcio a un valor por debajo de 1 partes por millón (p.p.m.) en base a materia seca; (b) reducir el ph del suero a un valor entre 1,8 y3,4; (c) calentar el suero a un valor entre 71 Cy 98 C durante un tiempo de 0 segundos a 9 segundos seguido del enfriamiento rápido a unos C; (d) concentrar el suero de la leche entre % y 63 % de sólidos totales a la temperatura no superior a 69 C; (e) enfriar el suero durante un período de tiempo y a una temperatura suficiente para permitir la cristalización de lactosa a partir del suero; (f) separar los cristales de lactosa resultantes del licor de proteína del suero restante; (g) ajustar el ph del licor de proteína del suero a un valor del ph comprendido entre 4,3 y 4,7 y a una temperatura menor de Cy calentando, a continuación, a una temperatura comprendida entre 3 Cy4 C durante un tiempo comprendido entre 1 y 3 horas; (h) separar el floculante resultante que comprende alfa-lactalbumina enriquecida del licor de proteínas del suero de la leche que comprende beta-lactoglobulina sustancialmente pura; y (i) purificar el floculante enriquecido con alfalactalbumina por lavado con una solución isoiónica con el licor de proteínas del suero, ajustando a un ph comprendido entre 4,3 y 4,7 y refraccionando la alfa-lactalbumina por centrifugación o filtración. La fracción de beta-lactoglobulina puede ser concentrada adicionalmente por ultrafiltrado, dando lugar a un retenido de beta-lactoglobulina y a un producto de permeación. En un procedimiento preferente, las fases (a) y (b) se han llevado a cabo utilizando una combinación de electrodiálisis y de intercambio catiónico. Esto permite reducir el ph al valor requerido conosinadicióndirecta de ácido y permite la reducción de la concentración catiónica al nivel requerido. Preferentemente, el ph es ajustado a un valor entre 1,8 y 2,2. Las fases (a) y (b) pueden ser llevadas a cabo simultáneamente. La concentración del suero de la leche puede ser llevada a cabo en un procedimiento de dos etapas, siendo la primera etapa una concentración a

3 3 ES T3 4 una temperatura menor de 70 Caunvalorentre % y 3 % de sólidos totales y efectuándose en una segunda etapa a una temperatura de 64 C o inferior para conseguir un contenido total de sólidos comprendido entre % y 63 %, consiguiéndose la primera etapa de concentración por evaporación o por utilización de membranas y evaporación y siendo llevado a cabo la segunda etapa por evaporación. Opcionalmente, se puede llevar a cabo una etapa o etapas de desmineralización después de la primera etapa de concentración y antes de la segunda etapa de concentración para reducir adicionalmente la cantidad de fosfato presente. Después de la etapa de acondicionamiento térmico (c) las proteínas del suero de la leche permanecen en estado soluble y de acuerdo con ello, en la etapa (f) la lactosa puede ser eliminada por cristalización y separación mecánica sin arrastrar dichas proteínas. Después de la retirada de los cristales de lactosa el licor de proteínas de suero restante contiene de manera típica entre 31 % y 4 % de proteínas en base a materia seca. La gama de temperatura preferente para floculación del componente de alfa-lactalbumina de este licor de suero en la fase (g) es entre 3 Cy4 C. De manera más preferente, la etapa (g) es llevada a cabo a una temperatura de 2 +/-2 C. Después del fraccionamiento de la alfa-lactalbumina procedente de la beta-lactoglobulina, ambos productos pueden ser sometidos a procedimientos adicionales incluyendo eliminación de grasas, neutralización, concentración y/o secado por pulverización. En el procedimiento de la presente invenciónel suero de la leche en bruto es tratado parcialmente para desmineralizarlo y el ph se ajusta a un valor de 3,4 o inferior. Si bien el ajuste del ph puede ser conseguido por lo menos parcialmente por la adición de ácido, en un procedimiento preferente, la reducción de ph es llevada a cabo por intercambio catiónico sin adición de ácido. El suero de la leche puede ser suero de queso, suero ácido o suero del cuajo de caseína. A continuación el suero es sometido a tratamiento a elevada temperatura a un valor comprendido entre 71 Cy98 C. A esta temperatura y bajo las condiciones iónicas prevalentes, la beta-lactoglobulina permanece en solución, mientras que la alfa-lactalbumina sufre un cambio que, no obstante, no resulta en la floculación de las moléculas de la proteína alfalactalbumina. A continuación el suero es enfriado y concentrado, después de lo cual los cristales de lactosa se dejan crecer a temperaturas más bajas. Los cristales son recogidos y el licor de proteínas del suero de la leche, que contiene la alfa-lactalbumina y la beta-lactoglobulina en estado soluble, es retenido. En la fase siguiente el licor de proteínas del suero es ajustado a un valor de ph entre 4,3 y 4,7 y es calentado a un valor comprendido entre 3 Cy4 C, en cuyas condiciones la alfa-lactalbumina flocula. Esta floculación permite que la alfa-lactalbumina se separe con respecto a la beta-lactoglobulina por separación mecánica, lo cual tiene como resultado una corriente enriquecida de alfa-lactalbumina y una corriente de beta-lactoglobulina sustancialmente pura A continuación se describirá el procedimiento de manera más detallada con referencia a los dibujos adjuntos, en los cuales: La figura 1 muestra un diagrama representativo de un procedimiento a título de ejemplo según la presente invención; y La figura 2 es un cromatograma que muestra la recuperación de la beta-lactoglobulina. Haciendo referencia a la figura 1 se trata suero de la leche en bruto a efectos de reducir su contenido de minerales, específicamente los iones de calcio son reducidos a menos de 1 p.p.m. en base a materia seca. La desmineralización es llevada a cabo preferentemente por electrodiálisis y por intercambio iónico, lo cual tiene la ventaja de que al mismo tiempo que se eliminan los iones, el ph puede ser reducido a un valor por debajo de 3, y preferentemente al punto deseado dentro de una gama de 1,8 a 2,2. Utilizando electrodiálisis standard, se puede conseguir hasta 70 % de la desmineralización requerida. A continuación se utiliza un cambiador catiónico para eliminar el sodio, potasio, magnesio y particularmente calcio. A continuación el suero de la leche es sometido a tratamiento térmico a una temperatura comprendida entre 71 Cy98 C durante un tiempo de 0 segundos a 9 segundos. Debido al bajo valor del ph, la beta-lactoglobulina permanece sustancialmente soluble durante la fase de alta temperatura. La concentración iónica muy baja del calcio combinada con el tratamiento térmico tiene el efecto de inducir cambios en la fracción de alfalactalbumina sin favorecer la aglomeración de la proteína. De este modo, después de la fase de tratamiento térmico, las proteínas del suero existen en forma de proteínas sustancialmente solubles. En la fase siguiente, la temperatura se reduce con rapidez a un valor por debajo de C, después de lo cual el suero de la leche es concentrado entre % y 63 % de sólidos totales. De modo conveniente, la concentración se logra en dos etapas. En la primera etapa, la temperatura se aumenta a un valor no superior a 70 Cyel contenido de sólidos del suero de la leche se incrementa a un valor entre % y 3 %. A continuación, en la segunda etapa, a una temperatura no superior a 64 C el contenido total de sólidos se incrementa adicionalmente a un valor comprendido entre % y 63 %. La concentración se puede conseguir por medios normales de la técnica, por ejemplo, por evaporación. Después de la primera etapa de concentración, se pueden llevar a cabo opcionalmente fases adicionales de electrodiálisis y/o otras etapas de desmineralización para eliminar otros componentes tales como fosfatos. Después de la concentración, la temperatura del suero de la leche es reducida de 64 C a unos C y se favorece el crecimiento de los cristales de lactosa. Una vez que la cristalización se ha terminado, los cristales de lactosa son retirados del suero por separación mecánica, dejando las proteínas del suero de la leche en el licor de proteínas del mismo. La lactosa preparada por este procedimiento es de manera típica una lactosa de elevada calidad. Por ejemplo, la calidad obtenida es de forma habitual suficientemente elevada para que la lactosa se pueda comercializar 3

4 ES T3 6 como lactosa de calidad refinada comestible. En esta etapa, el licor de proteínas del suero contiene entre 31 % y 4 % de proteínas en base a materia seca. Finalmente, las fracciones de alfa-lactalbumina y la beta-lactoglobulina son separadas una de otra. Esta separación es conseguida ajustando el ph del licor de proteínas del suero de la leche a un valor entre 4,3 y 4,7 a una temperatura inferior a C y luego calentando el licor de proteínas del suero a una temperatura comprendida entre 3 Cy4 C, preferentemente y de modo aproximado 2+/-2 C y permaneciendo en dicho valor de ph y temperatura durante un período de tiempo mínimo de una hora. El floculante es separado mecánicamente o por separación de membrana con respecto al licor madre restante para conseguir una fracción enriquecida de alfa-lactalbumina. El licor madre contiene beta-lactoglobulina soluble en forma sustancialmente pura. En fases de proceso subsiguientes, la fracción de alfa-lactalbumina puede ser lavada por medios mecánicos y/o por sistemas de diafiltración por membrana y ambas fracciones de alfa-lactalbumina y de beta-lactoglobulina pueden ser concentradas por ultrafiltración. El contenido de grasas de cada uno de los productos se puede reducir por separación mecánica y/o microfiltración. Finalmente, los productos son neutralizados por adición de base y secados en pulverización. Los siguientes ejemplos no limitadores se indican a título de ilustración de procedimientos dentro del ámbito de la presente invención. Ejemplo 1 Se desmineralizaron 00 litros de caseína ácida clarificada utilizando equipos comerciales de electrodiálisis y de intercambio iónico. La desmineralización combinada resultó en un producto agotado de su contenido de calcio a un contenido de menos de 1 p.p.m. en base a materia seca. En este sistema de desmineralización el ph fue reducido a 2,0. El producto fue tratado térmicamente a continuación a una temperatura de 94+/-1 C durante un período de segundos seguido de enfriamiento rápido a C antes de concentración en dos etapas, en primer lugar a 22 % de total de sólidos a una temperatura máxima de 69 C y finalmente a 62 % de sólidos totales a una temperatura máxima de 63 C. Se consiguió la cristalización de la lactosa por medio de enfriamiento controlado. Los cristales de la lactosa fueron eliminados por separación mecánica dejando un licor de proteínas del suero concentrado conteniendo 37 % de proteínas en base a materia seca. La solución de proteínas del suero de la leche concentrada fue ajustada a ph de 4,4 a 8 C y a continuación calentada a 3+/-1 C y siendo mantenida en un recipiente de acondicionamiento a dicha temperatura durante un tiempo mínimo de 1 hora. Toda la proteína de suero concentrada había sido retirada del recipiente de acondicionamiento después de un período de tiempo de tres horas. El mantenimiento en estas condiciones favorecía la floculación selectiva de la alfa-lactalbumina. El licor de proteínas del suero de la leche fue separado utilizando separación centrífuga, lo cual tuvo como resultado dos corrientes, una fase pesada que contenía una floculación enriquecida de alfa-lactalbumina y una fase ligera que comprendía una solución muy pura de beta-lactoglobulina sin otras fracciones principales de proteínas presentes. La figura 2a muestra un cromatograma de una muestra standard de beta-lactoglobulina (SIGMA CHEMICAL COM- PANY), mientras que la figura 2b es un cromatograma de la fracción de beta-lactoglobulina obtenida a partir de este Ejemplo, y la Tabla 1 muestra los valores máximos o valores pico obtenidos a partir de esta fracción. TABLA 1 Características principales del HPLC Tiempo Identificación Pico Proporción Retención del Pico (min) Total, % 9-, 23-2 Péptidos derivados,4 de la caseína 19- Beta-lactoglobulina 94,6 La fracción enriquecida en alfa-lactalbumina fue purificada adicionalmente por una serie de lavados utilizando una solución isoiónica con el licor de proteínas del suero, ajuste del ph a ph 4,4 y refraccionado por separación centrífuga dando lugar a una fracción final enriquecida en alfa-lactalbumina. Las dos corrientes de proteínas fueron concentradas adicionalmente utilizando ultrafiltración. Las concentraciones de grasas fueron reducidas utilizando separación mecánica y microfiltración. El producto final de beta-lactoglobulina fue neutralizado con una combinación de KOH, NaOH, Mg(IH) 2 yca(oh) 2, se concentró a% total de sólidos y se secó por pulverización. El producto final de alfa-lactalbumina fue neutralizado con una combinación de KOH, NaOH, Mg(OH) 2 yca(oh) 2, se concentró a% total de sólidos y se secó por pulverización. Ejemplo 2 00 litros de suero de queso cheddar fueron clarificados y utilizados como materia prima. El proceso fue el del Ejemplo 1. Ejemplo 3 00 litros de suero de la leche de caseína cuajada clarificado fueron utilizados como materia prima. El proceso fue el del Ejemplo 1. Ejemplo 4 En este ejemplo, se llevó a cabo el procedimiento igual que en los Ejemplos 1, 2 y 3, pero incluyó una fase adicional de desmineralización cuando el producto tenía un 22 % total de sólidos. Esta fase de desmineralización fue incluida a efectos de reducir adicionalmente los niveles de fosfato. El producto fue concentrado a continuación a un total de sólidos de 62 % a 63+/-1 Cyel proceso continuó igual que en los Ejemplos 1, 2 y 3. Ejemplo En este ejemplo, el procedimiento fue llevado a cabo igual que en los Ejemplos 1, 2 y 3. No obstante, la fracción de beta-lactoglobulina fue

5 7 ES T3 8 diafiltrada a 7 % de proteínas en base a la materia seca, se concentró a % total de sólidos, se neutralizó con una combinación de KOH, NaOH, Mg(OH) 2 yca(oh) 2 y se secó. Ejemplo 6 En este ejemplo el procedimiento se llevó a cabo igual que en los Ejemplos 1, 2 y 3. No obs- tante, la fracción de alfa-lactalbumina fue enriquecida por una combinación de lavado y de ultrafiltración a 6 % de proteína en base a materia seca, se concentró a 22 % total de sólidos, se neutralizó con una combinación de KOH, NaOH, Mg(OH) 2 yca(oh)

6 9 ES T3 REIVINDICACIONES 1. Procedimiento para recuperación de componentes del suero de la leche que comprende las siguientes fases: (a) reducir el contenido de minerales del suero en bruto y reducir en particular el contenido de calcio hasta un valor inferior a 1 partes por millón (p.p.m.) en base a la materia seca; (b) reducir el ph del suero a un valor comprendido entre 1,8 y 3,4; (c) calentar el suero de la leche entre 71 Cy 98 C durante un tiempo comprendido entre 0 segundos y 9 segundos, seguido de enfriamiento rápido a unos C; (d) concentrar el suero de la leche a un valor entre % y 63 % de contenido total de sólidos a una temperatura no superior a 69 C; (e) enfriar el suero durante un período de tiempo y a una temperatura suficiente para permitir la cristalización de la lactosa con respecto al suero; (f) separar los cristales de lactosa resultantes del licor de proteínas del suero resultante; (g) ajustar el ph del licor de proteínas del suero a un valor comprendido entre 4,3 y 4,7 a una temperatura inferior a C y calentando luego a una temperatura comprendida entre 3 Cy4 C durante un tiempo comprendido entre 1 y 3 horas; (h) separar el floculante resultante que comprende la alfa-lactalbumina enriquecida con respecto al licor de proteína de suero comprendiendo beta-lactoglobulina sustancialmente pura; y (i) purificar el floculante enriquecido en alfalactalbumina por lavado con una solución isoiónica con el licor de la proteína del suero de la leche, ajustando a un ph comprendido entre 4,3 y 4,7 y refraccionando la alfalactalbumina por centrifugación o filtración. 2. Procedimiento, según la reivindicación 1, enelqueelphsereduceenlafase(b)aunvalor entre 1,8 y 2,2. 3. Procedimiento, según la reivindicación 1 ó 2, en el que las fases (a) y (b) son llevadas a cabo simultáneamente por una combinación de electrodiálisis e intercambio catiónico. 4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la fase de concentración (d) es llevada a cabo en dos etapas, comprendiendo la primera etapa la concentración del suero de la leche a un valor comprendido entre % y 3 % de contenido total de sólidos a una temperatura menor de 69 C y comprendiendo la segunda etapa la concentración a un contenido total de valores sólidos comprendido entre % y 63 % a una temperatura no superior a 64 C.. Procedimiento, según la reivindicación 4, en el que la primera etapa de concentración es llevada a cabo por evaporación o por utilización combinada de membranas y evaporación y la segunda etapa de concentración es llevada a cabo por evaporación. 6. Procedimiento, según la reivindicación 4 ó, en el que se lleva a cabo una fase adicional de electrodiálisis y/o desmineralización entre las dos etapas de concentración. 7. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la fase (g) es llevadaacaboa2 C ± 2 C. 8. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los cristales de lactosa son separados con respecto al licor de proteínas del suero de la leche por separación mecánica. 9. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el producto de alfa-lactalbumina o beta-lactoglobulina resultante es sometido a eliminación de grasas, neutralización, concentración y/o secado por pulverización. 0 6 NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté o no incluída en la mencionada reserva. 6

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