Ciencia UANL Universidad Autónoma de Nuevo León ISSN (Versión impresa): MÉXICO

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1 Ciencia UANL Universidad Autónoma de Nuevo León ISSN (Versión impresa): MÉXICO 2002 Jorge Guillermo Gómez Gutiérrez / Luis G. Bermúdez Humarán / Reyes Tamez Guerra / Juan Manuel Adame Rodríguez / Roberto Montes de Oca Luna PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA TAQ DNA POLIMERASA A PARTIR DE E. COLI RECOMBINANTE Ciencia UANL, julio-septiembre, año/vol. V, número 003 Universidad Autónoma de Nuevo León Monterrey, México pp

2 Producción y purificación de la Taq DNA polimerasa a partir de E. coli recombinante Jorge Guillermo Gómez Gutiérrez*, Luis G. Bermúdez Humarán*, Reyes Tamez Guerra*, Juan Manuel Adame Rodríguez**, Roberto Montes de Oca Luna* La DNA polimerasa de Thermus aquaticus (Taq DNA polimerasa) es la enzima usada en el procedimiento del PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Este es un método extraordinario para la síntesis de ácido desoxirribonucleico (DNA) in vitro. El PCR puede amplificar un gen o un fragmento específico de DNA en varios millones de veces en menos de dos horas. Sus vastas aplicaciones dieron lugar a un avance vertical en el área de las ciencias biológicas. Dentro de algunas de las aplicaciones del PCR se encuentran el diagnóstico molecular de enfermedades genéticas humanas, de infecciones virales y bacterianas, en estudios de evolución molecular, clonación y expresión de genes, identificación de individuos, etc. El PCR es una reacción de varios ciclos en cadena, donde cada ciclo se compone de tres etapas que son: (a) desnaturalización del DNA, (b) hibridación de oligonucleótidos y (c) síntesis de DNA. En el primer paso se separan las cadenas de DNA a temperaturas de aproximadamente 94 o C, esto permite que en el segundo paso se hibriden los oligonucleótidos a la región de DNA que se desea amplificar y, finalmente, en el tercer paso la enzima Taq DNA polimerasa lleva a cabo la síntesis de DNA a una temperatura de 72 o C. Estos tres pasos se repiten en un promedio de 30 veces. Es decir, que durante cada ciclo los componentes de la reacción pasan por temperaturas muy elevadas a las cuales se inactivan la mayoría de las enzimas. Originalmente el procedimiento del PCR se estableció usando la DNA polimerasa I de Escherichia coli. 1 Esta enzima no es resistente a las temperaturas usadas en la desnaturalización del DNA y por ende se adicionaba nueva enzima después del primer paso en cada ciclo de reacción. Este problema se resolvió al sustituir la DNA polimerasa I de Escherichia coli por una Representación tridimensional de la Taq DNA polimerasa. enzima termoestable que no perdía su actividad a dichas temperaturas. Esta enzima es la Taq DNA polimerasa producida por la bacteria termófila Thermus aquaticus. 2 La Taq DNA polimerasa simplificó en gran medida la reacción de PCR al prescindir de adicionar enzima en cada uno de los 30 ciclos que se repite la reacción. La importancia que cobró esta enzima determinó que se establecieran procedimientos para facilitar su purificación, a partir de la bacteria productora de esta enzima, Thermus aquaticus. Posteriormente, con el uso de la tecnología del DNA recombi- *Laboratorio de Inmunología y Virología. **Laboratorio de Micología Médica, Facultad de Ciencias Biológicas, UANL, jadame@ccr.dsi.uanl.mx 316 CIENCIA UANL / VOL. V, No. 3, JULIO-SEPTIEMBRE 2002

3 JORGE GUILLERMO GÓMEZ G., LUIS G. BERMÚDEZ H., REYES TAMEZ G., JUAN MANUEL ADAME R., ROBERTO MONTES DE O. nante el gen de la Taq DNA polimerasa se clonó a partir de T. aquaticus y se expresó en Escherichia coli. 3 La expresión de este gen en E. coli facilitó su producción y purificación. 4 En el presente trabajo se describe la adaptación de un procedimiento para la producción y purificación de esta enzima Taq DNA polimerasa, a partir de una cepa recombinante de E. coli. Metodología Cepa recombinante de E.coli y plásmido ptrc-taq Se introdujo por electroporación en una cepa DH5α de E.coli (Stratagene) el plásmido ptrc-taq (figura1), el cual porta el gen de la Taq DNA polimerasa bajo la regulación del promotor lac. Para demostrar la presencia del gen de la Taq DNA polimerasa se aisló el DNA plasmídico, según la técnica descrita por Birnboim and Doly (1979), 5 se digirió con la enzima de restricción XhoI por 2h a 37ºC y se analizó en un gel de agarosa al 0.8%, teñido con bromuro de etidio. Producción de la Taq en medio LB versus TB El medio TB es un medio más enriquecido y se alcanzan densidades celulares de bacterias mayores que las que se obtienen con LB. Por tal motivo decidimos probar si en el medio TB se obtenía un mayor producción de Taq DNA polimerasa que en el medio LB. Para este propósito se preparó un preinóculo de 5 ml de la bacteria recombinante y se usaron 2.5 ml, para inocular 25 ml de ambos tipos de medio: LB (peptona de caseína 1%, NaCl 1%, y extracto de levadura 0.5%) y TB (peptona de caseína 1.2%, extracto de levadura 2.4% y glicerol 0.1ml). Se incubaron las bacterias hasta una densidad óptica, DO 550 = y se añadieron 20mg/ml de IPTG (Isopropyl B D thiogalactopyranosido), para inducir la expresión del gen Taq DNA polimerasa y se incubó toda la noche a 37 C con agitación. Posteriormente, los cultivos se centrifugaron y la pastilla se resuspendió en Buffer A (Tris 50mM ph 7.9, glucosa 50mM y EDTA 1mM ) y se lisaron las células por sonicación. Nuevamente se centrifugaron las células y se recuperó el sobrenadante del cual se prepararon diluciones (1:2, 1:4, 1:8, 1:16). La actividad de Taq DNA polimerasa se determinó por PCR, amplificando el transgen p53 humano, a partir de genoma murino. Lo anterior se hizo para las células provenientes de cada medio, LB y TB. Inducción de la expresión del gen Taq Para determinar el tiempo óptimo de producción de Taq DNA polimerasa, básicamente se hizo lo mismo que en el procedimiento anteriormente descrito, con la diferencia que solamente se crecieron las bacterias en el medio LB, ya que como se verá más adelante (resultados) en éste se obtuvo mayor actividad enzimática que en el medio TB. Se tomaron muestras de 1ml del cultivo celular cada dos horas durante 18h, a partir de la inducción con IPTG. Se prepararon extractos celulares, mediante sonicación, y se les determinó la actividad de Taq DNA polimerasa, de acuerdo a lo descrito en el punto anterior. Purificación de Taq DNA polimerasa Una vez que se demostró que el medio LB proporcionaba mayor actividad enzimática y que a las diez horas de incubación se obtenía la mayor producción de Taq (ver resultados). Se inoculó 1 litro de LB/Amp (40mg/ml) y se indujo la expresión de la Taq con IPTG, como se describió anteriormente. Se cosecharon las bacterias por centrifugación y se lavaron con Buffer A, posteriormente las bacterias se resuspendieron nuevamente en Buffer A, conteniendo lisozima a 4 mg/ml, se incubó a temperatura ambiente por 15 minutos (min) y se le adicionó un volumen de Buffer B (10mM Tris ph 7.9, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 0.5% Tween20, 0.5% IGEPAL). El lisado celular se centrifugó a 25,000 rpm por 45 min en un rotor SW 28. Al sobrenadante obtenido se le ajustó la concentración de KCl a 200 mm, se pasó por una columna de DE52 (BIO-RAD), previamente preparada y equilibrada con buffer B. Se colectaron fracciones de 5 ml y se combinaron aquéllas que en ensayos de PCR presentaron actividad de Taq. Las fracciones se dializaron toda la noche contra tres volúmenes de Buffer C (HEPES 20mM, ph 7.9, EDTA 1mM, PMSF 0.5mM, Twen20 0.5% e IGEPAL 0.5%). El dializado se pasó por una columna de resina Bio Rex 70 (BIO-RAD), equilibrada con Buffer C, y la Taq DNA polimerasa se eluyó con el mismo buffer, conteniendo KCl a 200 mm. Se colectaron fracciones de 1ml y se les determinó la actividad de la enzima mediante un ensayo de PCR. Medición de la actividad de Taq purificada La actividad de la Taq purificada se determinó mediante la amplificación del transgen humano p53 a CIENCIA UANL / VOL.V, No. 3, JULIO-SEPTIEMBRE

4 PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA TAQ DNA POLIMERASA A PARTIR DE E. COLI RECOMBINANTE partir de un genoma murino. Las reacciones de PCR se realizaron en volúmenes de 25 µl, conteniendo 100 ng de cada oligonucleótido, desoxiribonucleótidos de trifosfato a una concentración final de 250 mm, 100 ng de DNA genómico y 1 µl, ya sea de extractos celulares o fracciones de las columnas. Las condiciones del PCR fueron ( C/min): un ciclo inicial de 94/4, 30 ciclos de 94/1, 56/1, 72/3 y un ciclo final a 72/7. Para medir la actividad de la enzima purificada, así como su calidad, se realizaron diferentes tipos de amplificaciones (sencillas y múltiples) y se usaron diferentes tipos de templados de diferentes especies. Generalmente se usaron 100 ng de DNA genómico. Almacenamiento de la Taq DNA polimerasa Puesto que se obtuvo una enzima Taq DNA polimerasa con actividad biológica, es recomendable almacenarla y mantenerla estable por un periodo largo. Por lo tanto, decidimos probar dos diferentes Buffers de almacenamiento y monitorear a través del tiempo su actividad biológica. La enzima purificada se almacenó en dos diferentes tipos de buffer. Esto se llevó a cabo con la diálisis de la enzima purificada contra 100 volúmenes de Buffer I (HEPES 20mM, KCl 100mM, EDTA 0.1mM, PMSF 0.5mM, DTT 1 mm y Glicerol al 50%) o Buffer II (Tris 1M ph 8, DTT 1mM, EDTA 0.1mM, KCl 100mM, Tween 20 al 0.5%, IGEPAL al 0.5% y Glicerol 50%). La enzima dializada se almacenó a -20ºC y se le determinó su actividad de Taq DNA polimerasa, a través del tiempo, a intervalos de tres meses. Resultados Aislamiento y caracterización del gen de la Taq DNA polimerasa Para corroborar que nuestra cepa recombinante de E.coli porta el plásmido ptrc-taq se realizó un aislamiento de DNA plasmídico por la técnica de miniprep (ver metodología) y se digirió con la enzima de restricción XhoI. Ya que el gen Taq posee tres sitios XhoI en las posiciones 461,1540 y 2487 pb, la digestión del plásmido con esta enzima debe de generar la liberación de dos fragmentos de 1079 y 947pb (figuras 1 y 2 ). Producción de Taq DNA polimerasa en dos diferentes medios de cultivo La bacteria recombinante se creció en los dos me- Fig.1. Mapa del plásmido ptrc-taq. 1 KK 1 Kb M pb 947 pb Fig. 2. Caracterización del plásmido que porta el gen de la Taq DNA polimerasa. El plásmido se aisló de la bacteria recombinante y se digirió con la enzima XhoI. Carril 1 plásmido sin digerir; carril 2 plásmido digerido, y M es el marcador de peso molecular 1 Kb. dios de cultivo, LB y TB (metodología), se indujo la expresión del gen con IPTG y se comparó la actividad de la enzima producida en extractos celulares preparados por sonicación. Se probaron diluciones de los extractos celulares (1:2, 1:4, 1:8, 1:16). Los resultados se muestran en la figura 3, donde se observa que los productos del ensayo de PCR son más intensos en los extractos celulares de las bacterias crecidas en LB (carriles 1 al 4), en comparación con los extractos obtenidos del crecimiento en TB (carriles 5 al 8). Este resultado nos indica que existe una mayor cantidad de actividad enzimática de Taq DNA polimerasa en las bacterias crecidas en LB. Cinética del tiempo óptimo de producción de Taq Debido a que en la bacteria recombinante el gen de la Taq DNA polimerasa está bajo la regulación del promotor lac, el cual es inducible con IPTG, era necesario definir el tiempo óptimo para cosechar las bacterias, después de la inducción con dicho in- 318 CIENCIA UANL / VOL. V, No. 3, JULIO-SEPTIEMBRE 2002

5 JORGE GUILLERMO GÓMEZ G., LUIS G. BERMÚDEZ H., REYES TAMEZ G., JUAN MANUEL ADAME R., ROBERTO MONTES DE O. 1.6 kb 1 kb 0.5 kb LB TB M Tg p53 Fig. 3. Determinación de la productividad de Taq DNA polimerasa en dos medios de cultivo: LB y TB. Se amplificó el transgen p53 humano (Tgp53). Los carriles del 1 al 4 corresponden a diluciones (1:2,1:4,1:8,1:16) del extracto celular obtenido del medio LB, los carriles del 5 al 8 son las diluciones (1:2,1:4,1:8,1:16) del extracto celular obtenido del medio TB. ductor. Después de determinar la actividad de Taq obtenida de muestras de cultivo tomadas cada 2 h, a partir de la inducción hasta un máximo de 18 h, encontramos que la actividad de Taq comienza a detectarse a las 4 h, incrementándose progresivamente hasta las 10 h de crecimiento y disminuyendo a partir de las 12 h (figura 4). Estos resultados indican que a las 10 h se observa mayor actividad de Taq DNA polimerasa. 1.6 kb 1 kb 0.5 kb Hrs de crecimiento Post-inducción M Tg p53 Fig. 4. Determinación del tiempo óptimo de inducción de Taq DNA polimerasa. Actividad de la enzima en extractos celulares obtenidos a los tiempos indicados (2 a 18 hrs) posterior a la inducción con IPTG. La actividad se determinó mediante la amplificación del transgen Tg p53. M es el marcador de peso molecular 1 kb. Comparación de la Taq DNA polimerasa purificada y una Taq comercial La figura 5 se muestra la comparación de la actividad enzimática de la Taq DNA polimerasa purificada en comparación con una enzima comercial (BioSelec). Para este propósito se realizó un ensayo de PCR para amplificar un gen p53 murino en estado heterocigoto y usando tres diluciones diferentes (1:2, 1:4 y 1:8) de ambas enzimas. Los productos de PCR, del alelo silvestre y del alelo mutado, indican que la Taq DNA polimerasa purificada (carriles 1, 4 y 7) presentó mayor actividad que la enzima comercial (carriles 2, 5 y 8). Además, el almacenamiento de la enzima en un buffer diferente al I (Buffer II, metodología) no mejoró la estabilidad de la Taq DNA polimerasa purificada (carriles 3, 6 y 9); esto, debido a que nuestra enzima purificada mostró tener igual o mayor actividad que la comercial (5 U/µl). 1 Kb 0.5 Kb P C BII P C BII P C BII M AM AS Fig. 5. Comparación de la actividad de la Taq purificada (P) y de una enzima comercial (C). Se amplificó por PCR el gen p53 murino, en estado heterocigoto: AM, alelo mutante; AS, alelo silvestre. Carriles 1, 4 y 7 enzima purificada; carriles 2, 5 y 8 enzima comercial, y carriles 3, 6 y 9 corresponden a la enzima purificada almacenada en Buffer II (BII). M es el marcador de peso molecular 1Kb. Funcionalidad de la Taq DNA polimerasa A la enzima purificada se le probó su habilidad de amplificar DNA, a partir de genomas de diferentes organismos y condiciones de reacción. Primero se determinó la funcionalidad de nuestra enzima para la amplificación simultánea de varias regiones del genoma humano (PCR múltiple, figura 6). 400 pb M pb 50 pb Fig. 6. PCR múltiple del brazo largo del cromosoma Y usando la Taq DNA polimerasa purificada. M marcador de peso molecular 50 pb; carriles 1 al 4 productos de PCR esperados de acuerdo al estuche comercial. CIENCIA UANL / VOL.V, No. 3, JULIO-SEPTIEMBRE

6 PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE LA TAQ DNA POLIMERASA A PARTIR DE E. COLI RECOMBINANTE En este experimento se usaron todos los reactivos de un estuche de amplificación de diferentes regiones del brazo largo del cromosoma Y, sustituyendo la Taq del estuche por nuestra enzima. El resultado obtenido fue el mismo patrón de bandas esperadas, de acuerdo con el estuche comercial. Por otro lado, se probó la habilidad de la enzima purificada para amplificar DNA de aves. En la figura 7 se muestra el resultado que corresponde a un procedimiento de sexado molecular de aves monomórficas, en donde se amplificaron regiones específicas de los cromosomas sexuales Z y W. Los machos poseen dos cromosomas Z y amplifican una sola banda (carriles 1, 2, 4, 5, 7 y 9) y las hembras poseen un cromosoma Z y un W, y amplifican dos bandas (carriles 3, 6 y 8). 400 pb M pb Z Fig. 7. Amplificación de los genes CHD-W de la hembra y CHD-Z del macho. Carriles del 1 al 5, Amazona leucocephalla y carriles del 6 al 9 pertenecen a Lory sp. Estabilidad de la enzima purificada La enzima purificada se almacenó a 20 0 C en dos diferentes buffers y se monitoreó su actividad a través del tiempo, mediante la amplificación por PCR del Tg p53 humano a partir de genoma murino. En la figura 8 se muestra el resultado de la actividad de Taq DNA polimerasa a los tres, seis y nueve meses de almacenamiento (panel A, B y C, respectivamente). En los dos primeros paneles se aprecia que la intensidad de las bandas es comparable en ambos buffers, es decir que la actividad permanece similar hasta los seis meses. Por el contrario a los nueve meses de almacenamiento (panel C) existe una actividad ligeramente mayor en la enzima almacenada en el Buffer I. Conclusión y discusión En este trabajo se logró implementar un procedimiento para la purificación de la enzima Taq DNA W M BII BI M BII BI M BII BI Tg p53 (A) (B) (C) Fig. 8. Monitoreo de la Taq DNA polimerasa con respecto a su actividad a través del tiempo en dos tipos de Buffers de almacenamiento (BII y BI). Panel A, B y C, enzima con 3, 6 y 9 meses de almacenamiento. M es el marcador de peso molecular 1Kb. polimerasa, a partir de una bacteria recombinante de E.coli. En general la actividad de la enzima purificada fue similar a la de una Taq DNA polimerasa comercial bajo condiciones estándar de nuestro laboratorio. La cantidad producida a partir de 1Lt de cultivo fue ~ 100,000 U. Dos puntos importantes de resaltar de la enzima purificada son: (1) su reproducibilidad para amplificar los alelos del gen endógeno p53 murino (figura 5), con los cuales normalmente se presentaban problemas en nuestro laboratorio con la enzima comercial y (2) la enzima purificada amplificó secuencias de DNA bacteriano, a partir de DNA aislado de tejido bovino embebido en parafina, nuevamente con mayor reproducibilidad que la enzima comercial usada en este trabajo (datos no mostrados). Asimismo, la enzima purificada se ha probado en dos estuches comerciales, uno de PCR múltiple para la detección de microdeleciones del cromosoma. Y, y otro para reacciones de RT-PCR en la amplificación de DNAs complementarios humanos y virales (datos no mostrados). En ambos casos el uso de la Taq DNA polimerasa purificada funcionó en igual medida que la enzima Taq DNA polimerasa presente en el estuche. Las comparaciones fueron hechas de manera cualitativa y no cuantitativa. Finalmente, la vida media de la Taq bajo condiciones de almacenamiento en nuestro laboratorio ha sido superior a un año. En conclusión se implementó un procedimiento para la producción y purificación de la Taq DNA polimerasa a partir de una cepa recombinante de Escherichia coli. Agradecimientos Este proyecto CN fue apoyado por el programa PAICYT de la Universidad Autónoma de Nuevo León. 320 CIENCIA UANL / VOL. V, No. 3, JULIO-SEPTIEMBRE 2002

7 JORGE GUILLERMO GÓMEZ G., LUIS G. BERMÚDEZ H., REYES TAMEZ G., JUAN MANUEL ADAME R., ROBERTO MONTES DE O. Resumen En el presente trabajo se implementó un método para la producción y purificación de la enzima Taq DNA polimerasa, a partir de una cepa recombinante de Escherichia coli. Se determinó el tiempo de mayor producción en cultivo, se probaron dos diferentes medios para el crecimiento de dicha bacteria y dos diferentes buffers de almacenamiento para la enzima purificada. A partir de un litro de cultivo se logró obtener enzima Taq DNA polimerasa equivalente a 100,000 unidades. Esta enzima purificada se ha utilizado en protocolos estándar de laboratorio para la amplificación de secuencias genómicas de bacterias, virus, aves, ratones, bovinos y humanos, mostrando ser igual o más eficiente que una preparación comercial. La actividad de la enzima purificada ha permanecido estable durante al menos nueve meses de almacenamiento a 20 0 C. Palabras clave: Taq DNA polimerasa, PCR, PCR múltiple, Purificación. Abstract In the present work we developed a protocol to produce and isolate Taq DNA polymerase of recombinant Escherichia coli. We determined the optimum time of Taq DNA polymerase production. We tested two different culture media for the growth of the recombinant bacterium and two different storage buffers for enzyme stability. From one liter media culture we obtained 100,000 units of said enzyme. This enzyme was used for gene amplification from different organisms such as birds, mice, human and bacteria. The enzyme activity has been stable for at least nine months at 20ºC storage. Keywords: Taq DNA polymerase, PCR, PCR multiplex, Purification. Referencias 1. Mullis Kary, Faloona F., Scharf S., Saiki R., Horn G., and Erlich H. Especific Enzymatic Amplification of DNA In Vitro: The Polymerase Chain Reaction. CSH Symp. Quant. Biol ; 51: , Cold Spring Harbor Lab. 2. Saiki R.K., Gelfand H., Stoffel S., Scharf R., Higuchi R., Horn T. y Mullis K. Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase. Science 1988; 239: Lawyer F.C., Stoffel S., Saiki K., Myambo K., Drummond R. y Gelfand H. Isolation, Characterization, and Expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. Journal of Biological Chemistry 1989; 264: Engelk D.R., Krikos A., Bruck E. y Ginsburg D. Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase Expressed in Escherichia coli. Analytical Biochemistry 1990; 191: Birnboim HC and Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 1979; 7: Qureshi, S.J., Ross A.R. Ma K. et al (1996) Polymerase chain reaction screening for Y chromosome microdeletions. A first step towards the diagnosis of the genetically-determined spermatogenic failure in men. Mol Hum. Reprod., 2, Ogawa, A., Murata, K. & Mizuno, S. (1998). The location of Z- and W-linked marker genes and sequence on the homomorphic sex chromosome of the ostrich and the emu. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: Nakamura, T., Pichel, JG., Williams-Simons, L., Westphal, H. (1995). An apoptotic defect in lens differentiation caused by human p53 is rescued by a mutant allele. Proc. Natl. Acad. Sci. USA CIENCIA UANL / VOL.V, No. 3, JULIO-SEPTIEMBRE