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1 k 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 knúmero de publicación: kint. Cl. 7 : A61K 39/39 //A61K 39/29 A61K 39/12 A61K 31/71 12 k TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA T3 86 k Número de solicitud europea: k Fecha de presentación: k Número de publicación de la solicitud: k Fecha de publicación de la solicitud: k 4 Título: Vacuna contra la hepatitis B. k Prioridad: GB k 73 Titular/es: SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS S.A. 89 Rue de l Institut 13 Rixensart, BE k 4 Fecha de la publicación de la mención BOPI: k 72 Inventor/es: Hauser, Pierre; Garcon, Nathalie Marie-Josephe Claude y Desmons, Pierre k 4 Fecha de la publicación del folleto de patente: k 74 Agente: Carpintero López, Francisco ES T3 Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, Madrid

2 Vacuna contra la hepatitis B. DESCRIPCION La presente invención se refiere a nuevas formulaciones de vacuna, a procedimientos para su preparación y a su uso en terapia. En particular, la presente invención se refiere a nuevas formulaciones para tratar infecciones de hepatitis y a formulaciones de vacuna de combinación que incluyen un componente de vacuna de hepatitis B. La hepatitis viral, causada por los virus de la hepatitis A, B, C, D y E, es una enfermedad viral muy común. Mediante los virus B y C, en particular, es también responsable de muchos casos de cáncer hepático. Por ello, el desarrollo de vacunas eficaces es crítico y, a pesar de notables éxitos, es todavía una tarea en curso. Puede encontrarse una revisión sobre vacunas modernas de hepatitis, incluyendo una serie de referencias clave, en The Lancet, 12 de mayo de 1990, en las páginas 1142 y siguientes (Prof. A.L.W.F. Eddleston). Véase también Viral hepatitis and Liver Disease (Vyas, B.N., Dienstag, J.L. y Hoofnagle J.H., eds., Grune y Stratton, Inc. (1984) y Viral Hepatitis and Liver Disease (Proceedings of the 1990 International Symposium, eds. F.B. Hollinger, S.M. Lemon y H. Margolis, publicado por Williams y Wilkins). Como se utiliza en la presente descripción, la expresión antígeno de la hepatitis B se utiliza para indicar cualquier material antigénico derivado de un virus de la hepatitis B que pueda utilizarse para inducir inmunidad frente al virus en humanos. La infección con el virus de la hepatitis B (HBV) es un problema extendido, pero están disponibles actualmente vacunas que pueden utilizarse para inmunización masiva, por ejemplo el producto Engerix- B (SmithKline Beecham plc) que se obtiene mediante técnicas de ingeniería genética. La preparación del antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) está bien documentada. Véase por ejemplo, Harford et al. en Develop. Biol. Standard 4, página 12 (1983), Gregg et al. en Biotechnology,, página 479 (1987), los documentos EP-A , EP-A y las referencias en estos. Como se utiliza en la presente descripción, la expresión antígeno de superficie de hepatitis B o HBsAg incluye cualquier antígeno HBsAg o fragmento de éste que presente la antigenicidad del antígeno de superficie de HBV. Se comprenderá que además de la secuencias de 226 aminoácidos del antígeno S de HBsAg (véase Tiollais et al., Nature, 317, 489 (198) y las referencias en éste), el HBsAg como se describe en la presente descripción puede contener, si se desea, toda o parte de una secuencia pre-s como se describe en las referencias anteriores y en el documento EP-A En particular, el HBsAg puede comprender un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 12-2, seguidos de los residuos 13-14, seguidos de los residuos 17-0 de la proteína L de HBsAg relativos al marco abierto de lectura en un virus de hepatitis B de serotipo ad (este polipéptido se designa como L,véase el documento EP ). El HBsAg dentro del alcance de la invención puede incluir también el polipéptido pres1-pres2-s descrito en el documento EP (Endotronics) o análogos de éste tales como los descritos en el documento EP 0478 (Mc Cormick y Jones). El HBsAg como se describe en la presente descripción puede designar también mutantes, por ejemplo el mutante de escape descrito en el documento WO 91/14703 o en la publicación de solicitud de patente europea número 0118A1, especialmente HBsAg en el que la sustitución de aminoácido en la posición 14 es de arginina por glicina. Normalmente el HBsAg estará en forma de partículas. Las partículas pueden comprender por ejemplo proteína S sola, o pueden ser partículas compuestas, por ejemplo (L,S), en las que L es como se definió anteriormente y S designa la proteínasdelhbsag. Lacitadapartícula está ventajosamente en la forma en la que se expresa en levaduras. Aunque las vacunas de hepatitis experimentales y comerciales disponibles, por ejemplo, Engerix-B R, proporcionan resultados excelentes, es un hecho aceptado que una vacuna óptima necesita estimular no sólo los anticuerpos neutralizantes, sino que necesita también estimular tan eficazmente como sea posible la inmunidad celular mediada por células T. La solicitud de patente internacional n WO 93/19780 describe vacunas de combinación con un componente de hepatitis B basado en un antígeno de superficie de hepatitis B, hidróxido de aluminio y monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado. No se sugirió una formulación que comprendiera fosfato de aluminio. Sorprendentemente, la presente invención proporciona una formulación hasta cuatro veces más potente que las descritas en el documento WO 93/

3 Consiguientemente, la presente invención proporciona una vacuna que comprende un antígeno de la hepatitis B junto con un monofosforil-lípido A 3-O-desacilado (abreviado en la presente descripción como MPL) y fosfato de aluminio El monofosforil-lípido A 3-O-desacilado (o monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado) se ha denominado anteriormente 3D-MPL o d3-mpl, para indicar que la posición 3 del extremo reductor glucosamina está des-o-acilada. Para su preparación, véase el documento GB 22211A. Químicamente, es una mezcla de monofosforil-lípido A 3-desacilado con 4, ó 6 cadenas aciladas. En la presente descripción, el término 3D-MPL (o d3-mpl) se abrevia a MPL, puesto que MPL es una marca comercial registrada de Ribi Immunochem., Montana, que se utiliza por Ribi para designar de forma no ambigua su producto monofosforil-lípido A 3-O-desacilado. Preferiblemente, en la composición de la presente invención se utiliza MPL en partículas pequeñas. El MPL R en partículas pequeñas tiene un tamaño de partícula generalmente inferior a 1 nm. Se describen dichas preparaciones en la solicitud de patente internacional n WO 94/21292 El documento GB 22211A cita que se reduce la endotoxicidad de los lipopolisacáridos (LPS) enterobacterianos utilizados anteriormente, conservándose las propiedades inmunogénicas. Sin embargo, el documento GB citaba estos descubrimientos únicamente en conexión con sistemas bacterianos (gram negativos). Sin embargo, sorprendentemente, se ha encontrado que las composiciones de vacuna según la invención que comprenden antígenos virales de la hepatitis B tienen propiedades particularmente ventajosas como se describe en la presente descripción. Una ventaja particular es que las formulaciones de vacuna de la invención son muy eficaces en la inducción de inmunidad protectora, incluso con dosis muy bajas de antígeno. Las nuevas formulaciones de vacuna permiten potenciaciones de la inmunogenicidad equivalentes a las formulaciones de hepatitis B disponibles actualmente después de dos dosis. En particular, se obtuvieron niveles equivalentes de anticuerpos en un ensayo clínico humano después de dos dosis de vacuna, en comparación con tres dosis de Engerix-B R. Proporcionan una excelente protección frente a infección primaria, y estimulan ventajosamente tanto la respuesta inmune específica humoral (anticuerpos neutralizantes) como también la mediada por células efectoras (DTH). Una ventaja importante adicional es que las composiciones de vacuna según la invención pueden utilizarse también como vacunas terapéuticas. El MPL R como se definió anteriormente estará normalmente presente en el intervalo de -0 µg, preferiblemente 2-0 µg por dosis, estando típicamente presente el antígeno de hepatitis B en un intervalo de 2-0 µg por dosis y el fosfato de aluminio en el intervalo de 00 µg (Al 3+ ) por dosis. Es una realización de la invención una composición de vacuna que comprende el antígeno HBsAg (por ejemplo como en Engerix-B R ) mezclado con MPL R y fosfato de aluminio, como se describe a continuación en la presente descripción. En una realización específica adicional de la invención,elantígeno HBsAg es (L,S) en partículas, definidas anteriormente en la presente descripción. La invención proporciona en un aspecto adicional una formulación de vacuna como se describe en la presente descripción para uso en terapia médica, particularmente para uso en el tratamiento o la profilaxis de infecciones virales de hepatitis. En un aspecto preferido, la vacuna según la invención es una vacuna terapéutica útil para el tratamiento de infecciones por hepatitis B en curso. En otro aspecto, la composición de vacuna de hepatitis de la invención comprende otros antígenos, de modo que sea eficaz en el tratamiento o la profilaxis de una o más infecciones bacterianas, virales o fúngicas. Consiguientemente, la formulación de vacuna de hepatitis según una realización de la invención contiene al menos otro componente seleccionado de otros antígenos de hepatitis, en particular de antígeno de 3

4 hepatitis A, o de antígenos no de hepatitis, que son conocidos en la técnica por proporcionar protección frente a una o más de las siguientes: difteria, tétanos, pertussis, Haemophilus influenzae b (Hib) y polio. Pueden incluirse también los antígenos frente a la meningitis A, B o C Preferiblemente, la vacuna según la invención incluye HBsAg como se definió anteriormente en la presente descripción. Las vacunas de combinación particulares dentro del alcance de la invención incluyen una formulación de vacuna de combinación DTP (difteria-tétanos-pertussis)-hepatitis B, una formulación de vacuna Hibhepatitis B, una formulación de vacuna DTP-Hib-hepatitis B y una formulación de vacuna IPV (vacuna de la polio inactivada)-dtp-hib-hepatitis B. La vacuna de hepatitis o las combinaciones anteriores pueden incluir ventajosamente un componente que es protector frente a la hepatitis A, especialmente la cepa atenuada muerta derivada de la cepa HM- 17, como está presente en Havrix. Los componentes adecuados para uso en dichas vacunas están ya comercialmente disponibles, y pueden obtenerse detalles de la Organización Mundial de la Salud. Por ejemplo, el componente IPV puede ser la vacuna de la polio inactivada Salk. La vacuna pertussis puede comprender el producto de células enteras o acelular, formulado con antígeno de difteria o tétanos, tal como Infanrix DTPa, que comprende tres antígenos B. Pertussis: 69 kda, toxina pertussis (inactivada) y FHA. En un aspecto, la hepatitis o vacuna de combinación según la invención puede ser una vacuna pediátrica. La preparación de vacunas se describe en general en New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland EE.UU Se describe la encapsulación en liposomas, por ejemplo, en Fullerton, patente de EE.UU Se describe la conjugación de proteínas a macromoléculas, por ejemplo, en Likhite, patente de EE.UU y en Armor, et al., patente de EE.UU La cantidad de antígeno en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos significativos en vacunados típicos. Dicha cantidad variará dependiendo de cuáles antígenos específicos se empleen. Generalmente, se espera que cada dosis comprenda 1-00 µgdeantígeno total, preferiblemente 2-0 µg. Puede determinarse la cantidad óptima para una vacuna particular mediante estudios estándar que implican la observación de titulaciones de anticuerpos y otras respuestas en sujetos. Después de una vacunación inicial, los sujetos recibirán una o más dosis de recuerdo, por ejemplo después de 2 y 6 meses. En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento de fabricación de una vacuna eficaz en la prevención o el tratamiento de infección por hepatitis, en la que el procedimiento comprende adsorber el antígeno de hepatitis como se define en la presente descripción sobre fosfato de aluminio y después añadir MPL. Utilizando este procedimiento, se mezclan preferiblemente uno o más componentes adicionales con HBsAg, proporcionando una vacuna de combinación. Pueden utilizarse varios procedimientos de mezcla de los componentes. En un procedimiento, puede absorberse cada antígeno separadamente sobre fosfato de aluminio y, después de un periodo de tiempo, puede añadirse MPL a cada uno antes de añadir la solución de mezcla. En otro aspecto, la invención proporciona el uso de una composición como se define en la presente descripción para la fabricación de una vacuna para la inducción de anticuerpos neutralizantes en el intervalo de mu para la hepatitis B en humanos, preferiblemente después de no más de dos dosis. Los siguientes ejemplos ilustran la invención y sus ventajas. Ejemplo 1 Formulación de vacuna de hepatitis B Se obtuvo MPL R (monofosforil-lípido A 3-des-O-acilado) de Ribi Immunochem. Research Inc. Se obtuvo el fosfato de aluminio de Superphos (Dinamarca). 4

5 1 Se resuspendió elmpl R en agua para inyecciones a una concentraciónvariablede0,2a3mg/mlpor sonicación, hasta que las partículas alcanzaron un tamaño entre 80 y 0 nm, medido por fotocorrelación de luz dispersada. Se adsorben de 1 a µg de HBsAg (antígeno S como en Engerix-B R )ensolución de tampón fosfato de 0, a 3 mg/ml) sobre de a 00 µg de fosfato de aluminio (solución a 3-6 mg/ml de Al 3+ ) durante una hora a temperatura ambiente con agitación. Se almacenó la mezcla a temperatura ambiente durante 1 días, y se mantuvo después a 4 C antes del procesamiento adicional. Después, se añadieron de a 0 µg dempl R (solución 0,2 a mg/ml) a la solución. Se ajustaron el volumen y la osmolaridad de 00 a 00 µl con agua para inyecciones y solución salina. Se añade tiomersal (1 % p/v) hasta una concentración final de 0,00 %, proporcionando el producto final. Se preparó una formulación similar utilizando como componente HBsAg el antígeno compuesto (L,S) como se definió anteriormente en la presente descripción. En esta formulación, el agente bacteriostático era 2-fenoxietanol. Ejemplo Estudios clínicos de antígeno de superficie de hepatitis B formulado con monofosforil-lípido A 3-desacilado y fosfato de aluminio. En un ensayo clínico, se compararon diversas vacunas de antígeno de superficie de hepatitis B. Se consideraron los siguientes grupos: Grupo 1: HBsAg ( µg)/mpl R (0 µg)/alpo 4 (Al:00 µg)/tiomersal (0 µg)/nacl mm/ph 6,1 en 1 ml, formulado como en el ejemplo 1. Grupo 2: HBsAg ( µg)/mpl R (0 µg)/aloh 3 (Al:0 µg)/tiomersal (0 µg)/tampón fosfato mm + NaCl mm/ph 6,8 en 1 ml. Grupo 3: HBsAg ( µg)/mpl R (0 µg)/aloh 3 (Al:00 µg)/tiomersal (0 µg)/tampón fosfato mm + NaCl mm/ph 6,8 en 1 ml. Grupo 4: Tipo Engerix HBsAg ( µg)/mpl R (0 µg)/aloh 3 (A1:00 µg)/tiomersal (0 µg)/tampón fosfato mm + NaCl mm/ph 6,8 en 1 ml. Grupo : HBsAg ( µg)/mpl R (0 µg)/alpo 4 (A1:00 µg)/tiomersal (0 µg)/nacl mm/ph 6,1 en 1 ml. Se reclutaron voluntarios de 18 a años de edad para su participación en el ensayo. Se vacunó por vía intramuscular cada grupo (aproximadamente adultos por grupo el día 0) en la región deltoide el día 0 y 2 meses después. Se recogió una muestra de sangre antes de la primera inyección, uno y dos meses después de la primera inyección, y 1, 2 y 4 meses después de la segunda inyección. Se midieron los anticuerpos anti-hb utilizando el estuche AUSAB (Abbott) y una referencia de la OMS calibrada en mlu/ml. Los sensibles tenían una titulación 1 ml U/ml. Para cada punto temporal, se calculó latmg (titulación media geométrica) para los conversores séricos. Resultados 0 Se proporcionan las TMG en la tabla 1 para cada vacuna, y la tabla 2 proporciona la clasificación de titulaciones de anticuerpo en cada grupo de vacunados. Los resultados de las TMG (tabla 1) muestran claramente que después de 2 dosis de vacuna que contiene AlPO 4 + MPL (grupo 1), se observa un aumento de más de veces de las titulaciones después de la segunda dosis, en comparación con la titulación alcanzada utilizando la Engerix-B comercial (grupo 4). La respuesta anti-hb es también más rápida, y del 1 al 70 % de los vacunados tienen una titulación protectora ( ml/u/ml) 1 y 2 meses después de la primera dosis (en comparación con el 34 y 16 % para Engerix B) (tabla 2). La adición de 3D-MPL a Engerix B R (grupo 3) y el uso de AlPO 4 sólo (grupo ) mejoran ligeramente la respuesta anti-hb (en comparación con Engerix B), pero las titulaciones son aún de 4 a veces inferiores que con la formulación AlPO 4 +MPL R. La adsorción de HBsAg sobre una dosis reducida de Al(OH) 3 +MPL R proporciona titulaciones que son similares a las alcanzadas con

6 Engerix B. Conjuntamente, los resultados indican que tanto AlPO 4 como MP R son necesarios para tener un aumento óptimo de la respuesta anti-hb en vacunados después de sólo 2 dosis. TABLA 1 Tasas de conversión sérica (%) y media geométrica de la titulación de anticuerpo anti-hb (TMG) de los conversores séricos: Análisis preliminar 1 Grupo Momento N S+ % TMG NC NC Tit. Tit. inferior superior mín. máx. al 9 % al 9 % 1 Pre 9 0 0, PI (m1) , PI (m2) , PII (m3) 3 3 0, PII (m4) , PII (m6) 2 2 0, Pre 9 0 0, PI (m1) , PI (m2) , PII (m3) 3 3 0, PII (m4) 0, PII (m6) , Pre 9 0 0, PI (m1) , PI (m2) , PII (m3) 3 3 0, PII (m4) 0, PII (m6) ,

7 TABLA 1 (Continuación) Grupo Momento N S+ % TMG NC NC Tit. Tit. inferior superior mín. máx. al 9 % al 9 % 1 4 Pre 9 0 0, PI (m1) 0, PI (m2) , PII (m3) 0 0 0, PII (m4) , PII (m6) 2 2 0, Pre 9 0 0, PI (m1) 2 7, PI (m2) , PII (m3) 2 2 0, PII (m4) , PII (m6) , TABLA 2 Distribución del análisis preliminar de las titulaciones de anticuerpo anti-hb individuales Grupo Momento N n % 0 n % 00 n % 1 Pre 9 0 0,0 0 0,0 0 0,0 PI (m1) ,9 2 3,8 0 0,0 PI (m2) ,8 2 3,8 0 0,0 0 PII (m3) 3 3 0, , 7, PII (m4) , , ,2 PII (m6) 2 2 0, ,0 1,0 7

8 TABLA 2 (Continuación) Grupo Momento N n % 0 n % 00 n % 2 Pre 9 0 0,0 0 0,0 0 0,0 PI (m1) 3 37,7 3,7 1 1,9 PI (m2) ,4 3,7 0 0,0 PII (m3) , ,7 11,8 1 PII (m4) 38 9,0 24,0 3 7, PII (m6) , 8 36,4 0 0,0 3 Pre 9 0 0,0 0 0,0 0 0,0 PI (m1) ,1 7 13,2 0 0,0 2 PI (m2) ,1 1 1,9 1 1,9 PII (m3) ,2 4 84,9 37,7 3 PII (m4) 39 97, 34 8,0 2,0 PII (m6) ,8 18 7,0 3 12, 4 Pre 9 0 0,0 0 0,0 0 0,0 PI (m1) ,0 3 6,0 0 0,0 PI (m2) ,0 0 0,0 0 0,0 PII(m3) ,0 3 70, ,0 PII (m4) 42 9,2 71,4 11,9 4 PII (m6) 2 2 0, ,0 4 16,0 Pre 9 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 PI (m1) ,8 9,6 1 1,9 PI (m2) 2 38, 03,8 0 0,0 PII (m3) ,3 39 7, ,9 PII (m4) ,1 31 7,6 9 22,0 PII (m6) ,7 18 7,0,8 8

9 REIVINDICACIONES 1. Una composición de vacuna que comprende un antígeno de hepatitis B junto con monofosforil-lípido A 3-O-desacilado y fosfato de aluminio. 2. Una composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que el antígeno comprende antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) o una variante de éste. 3. Una composición de vacuna según la reivindicación 2, en la que el HBsAg comprende el antígeno S del HBsAg (226 aminoácidos). 4. Una composición de vacuna según la reivindicación 3, en la que el HBsAg comprende adicionalmente una secuencia pre-s Una composición de vacuna según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en la que el HBsAg es la partícula compuesta de fórmula (L,S), en la que L designa una proteína L modificada del virus de la hepatitis B con una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos 12-2, seguidos de los residuos , seguidos de los residuos 17-0 de la proteína L, y S designa la proteína S de HBsAg. 6. Una composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende uno o más antígenos de hepatitis, y al menos otro compuesto seleccionado de antígenode hepatitis o antígeno no de hepatitis que proporciona protección frente a una o más de las siguientes: difteria, tétanos, pertussis, Haemophilus influenzae b (Hib), polio y meningitis A, B o C. 7. Una composición de vacuna según la reivindicación 6, seleccionada de una combinación de DTP (difteria-tétanos-pertussis)-hbsag, una combinación Hib-HBsAg, una combinación DTP-Hib-HBsAg y una combinación IPV (vacuna de la polio inactivada)-dtp-hib-hbsag. 8. Una composición de vacuna según la reivindicación 7, que comprende además un antígeno de la hepatitis A. 9. Una composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el monofosforil-lípido A 3-O-desacilado está presente en el intervalo de µg-0 µg por dosis. 3. Una composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para uso en medicina. 11. Uso de un antígeno de hepatitis B junto con monofosforil-lípido A 3-O-desacilado y fosfato de aluminio en la fabricación de una vacuna para la profilaxis o el tratamiento de infecciones de hepatitis. 12.Un procedimiento para la producción de una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende absorber el antígeno de superficie de hepatitis B sobre fosfato de aluminio, y añadir después monofosforil-lípido A 3-O-desacilado. 4 0 NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD 2424/1986, de de octubre, relativo a la aplicación del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del , no producirán ningún efecto en España en la medida en que confieran protección a productos químicos y farmacéuticos como tales. Esta información no prejuzga que la patente esté onoincluída en la mencionada reserva. 9