YENY ALEXANDRA FARFAN VARGAS

Transcripción

1 DETECCION Y GENOTIPIFICACION DEL VIRUS DE PAPILOMA HUMANO EN MUJERES CON LESIONES DE SIGNIFICADO INDETERMINADO (ASCUS) EN UN PROGRAMA DE TAMIZAJE EN UN HOSPITAL DE LA CIUDAD DE BOGOTÁ YENY ALEXANDRA FARFAN VARGAS UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS POSTGRADO INTERFACULTADES MAESTRIA EN MICROBIOLOGÍA BOGOTA 2009

2 DETECCION Y GENOTIPIFICACION DEL VIRUS DE PAPILOMA HUMANO EN MUJERES CON LESIONES DE SIGNIFICADO INDETERMINADO (ASCUS) EN UN PROGRAMA DE TAMIZAJE EN UN HOSPITAL DE LA CIUDAD DE BOGOTÁ YENY ALEXANDRA FARFAN VARGAS Bact. Trabajo de grado presentado para optar al titulo de: Magíster Scientiae en Microbiología DIRECTOR: FABIO ANCIZAR ARISTIZABAL Q.F. PhD. COORDINACION: ADRIANA GARCIA Bact, MSc. UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS POSTGRADO INTERFACULTADES MAESTRIA EN MICROBIOLOGÍA BOGOTA 2009

3 DETECCION Y GENOTIPIFICACION DEL VIRUS DE PAPILOMA HUMANO EN MUJERES CON LESIONES DE SIGNIFICADO INDETERMINADO (ASCUS) EN UN PROGRAMA DE TAMIZAJE EN UN HOSPITAL DE LA CIUDAD DE BOGOTÁ DETECTION AND GENOTYPING OF THE VIRUS OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS IN WOMEN WITH INJURIES OF UNCERTAIN SIGNIFICANCE (ASCUS) IN A SCREENING PROGRAM IN A HOSPITAL IN BOGOTA RESUMEN El cáncer de cuello uterino (CCU) es una de las principales causas de muerte por cáncer en mujeres a nivel mundial, principalmente en países en vía de desarrollo (Lang et al, 2005). Uno de los agentes etiológicos asociado al cáncer cervical es el Virus de Papiloma Humano (VPH) principalmente los tipos oncogénicos o de alto riesgo (Bosch et al., 2002). Con una incidencia de nuevos casos al año, causa alrededor de muertes anualmente (IARC 2002); específicamente en bogota 14.9% de las mujeres con citología negativa para neoplasia son positivas para VPH (Molano et al., 2002). Por lo tanto, crece el interés a nivel mundial y nacional por mejorar las estrategias de control y diagnóstico de la infección; incluyendo técnicas de diagnóstico molecular que identifiquen y diferencien tipos virales específicos para así, tener mejor entendimiento de la dinámica del virus en la historia natural de la infección por VPH. En el presente trabajo se realizó detección y genotipificación del VPH en 302 pacientes que asisten normalmente al programa de tamizaje de la EPS Sanitas, y que posteriormente fueron diagnosticadas con lesiones ASCUS. La prevalencia del virus en esta población fue del 20.1% (62 pacientes) distribuidos en 82.3 % para tipos virales de alto riesgo y 17.7 % para bajo riesgo. Otro hallazgo importante fue la detección de infección múltiple en el 37.1% de las muestras analizadas y el 62.9% restante con infección única. Por primera vez se realizó descripción de tipos virales específicos encontrados en muestras de ASCUS en Bogotá, y la distribución en porcentaje de los mismos.

4 Palabras Claves: Virus de Papiloma Humano, Reverse Line Blot, células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASCUS). ABSTRACT Cervical cancer (CCU) is a leading cause of cancer death in women worldwide, mainly in developing countries (Lang et al, 2005). One of the etiologic agents associated with cervical cancer is human papillomavirus (HPV) types mainly highrisk or oncogenic (Bosch et al., 2002). With an incidence of 490,000 new cases annually, causing approximately 273,000 deaths annually (IARC 2002), specifically in Bogotá 14.9% of women with negative cytology for malignancy were positive for HPV (Molano et al., 2002). Therefore, a growing concern globally and nationally to improve strategies to control and diagnosis of infection, including molecular diagnostic techniques to identify and differentiate specific viral types thus have a better understanding of the dynamics of the virus in history natural HPV infection. In the present work was performed HPV detection and genotyping in 302 patients who normally attended the screening program of the EPS Sanitas, and were subsequently diagnosed with ASCUS lesions. HPV prevalence in this population was 20.1% (62 patients) divided into 82.3% for high-risk viral types and 17.7% for low risk. Another important finding was the detection of multiple infection in 37.1% of the samples and the remaining 62.9% with single infection. For the first time was a description of specific viral types found in samples of ASCUS in Bogotá, and the percentage of them. Key Words: Human Papillomavirus, Reverse Line Blot, Atipycal squamous cells of uncertain significance (ASCUS).

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6 Dedicado a Dios, a mi madre, a mi hermana y al amor.

7 AGRADECIMIENTOS Expreso mis mas sinceros agradecimientos: Al Profesor Fabio Aristizábal por su apoyo y colaboración en el desarrollo de este trabajo y confianza en mi. A la EPS sanitas por la colaboración brindada y por el suministro de la muestras. Al laboratorio de caucho (IBUN) y farmacia, de la Universidad Nacional donde se llevo cabo la parte experimental de este trabajo. A la Universidad Nacional por la financiación de este proyecto y permitirme tener el honor de ser una egresada de tan prestigiosa institución. Al Posgrado Interfacultades en Microbiología por la Formación académica que me brindo. Al doctor Javier Narváez por su valioso apoyo en el análisis de los datos epidemiológicos. A socorro prieto, Yesika Jiménez, Sandra Vargas, Adriana García, Ivonne García, Habib Yanine, Antonio huertas, Viviana Acosta, Yazmín Arias y a todas aquellas personas que intervinieron en este proceso, me apoyaron e hicieron posible la realización y logro de esta investigación

8 TABLA DE CONTENIDO INTRODUCCION MARCO TEORICO Antecedentes epidemiológicos Virus de Papiloma Humano VPH y Oncogénesis Diagnóstico de Cáncer Cervical 18 Pág. 1.4 Detección y genotipificación de VPH Amplicore Captura de Híbridos Reverse Line Blot OBJETIVOS Objetivo general Objetivos específicos PROBLEMA DE INVESTIGACION Y SU JUSTIFICACIÓN MATERIALES Y METODOS Tipo de estudio Población a estudio Obtención de las muestras Control Positivo VPH 16 y VPH Evaluación de sensibilidad y especificidad de las PCRs Extracción del ADN Evaluación de la calidad de ADN Detección genérica de VPH Detección especifica de VPH mediante Reverse Line Blot Activación de la membrana Hibridación del producto de amplificación Análisis de Datos Análisis estadístico RESULTADOS Evaluación de sensibilidad y especificidad de las PCRs Estandarización del ensayo Reverse Line Blot Características generales de la población Variables Clínicas 38

9 5.5 Factores relacionados soportados en la literatura Detección y genotipificación de VPH mediante RLB DISCUSIÓN DE RESULTADOS CONCLUSIONES RECOMENDACIONES 53 ANEXOS 54 BIBLIOGRAFÍA 57

10 LISTA DE FIGURAS Pág. Figura 1. Presentación esquemática de la distribución de los genotipos de VPH en citología normal a nivel de Sur América. 12 Figura 2. Presentación esquemática del genoma del VPH 14 Figura 3. Ciclo de vida de VPH en los diferentes estratos del epitelio escamoso. 15 Figura 4. Limite de detección de Globina 36 Figura 5. Limite de detección de VPH 36 Figura 6. Resultados primer ensayo con cepillado cervical 38 Figura 7. Distribución inicio de relaciones sexuales por rangos de edad. 41

11 Tabla Nº 1. LISTA DE TABLAS Secuencias de las Oligosondas usadas para la tipificación por RLB. Tabla Nº 2. Distribución de grupos de edad en porcentaje 38 Tabla Nº 3. Distribución de la población por estrato socioeconómico Tabla Nº 4. Clasificación estado civil de las participantes 39 Tabla Nº 5. Distribución nivel de escolaridad 39 Tabla Nº 6. Resultados de la biopsia 40 Tabla Nº 7. Métodos de anticoncepción 40 Tabla Nº 8. Tabla Nº 9, Distribución número de compañeros sexuales durante toda la vida Distribución número de compañeros sexuales en los últimos dos años Tabla Nº 10. Prevalencia de VPH en mujeres con ASCUS 42 Tabla Nº 11. Tabla Nº 12. Tabla Nº 13. Prevalencia de infección única y múltiple en población de mujeres con ASCUS. Prevalencia de infección con VPH en mujeres con ASCUS por grupos de edad. Prevalencias de infección única y múltiple por grupo de edad. Tabla Nº 14 Prevalencias de infección en reporte de biopsia 44 Tabla Nº 15. Tabla Nº 16. Tabla Nº 17. Tabla Nº 18. Tabla Nº 19. Tabla Nº 20. Tabla Nº 21. Tabla Nº 22. Prevalencia de la infección con VPH por estrato socioeconómico Prevalencia de la infección por VPH según el nivel de escolaridad. Asociaciones entre tipos virales de alto riesgo en múltiple infección. Prevalencias de infección con VPH por consumo de tabaco Prevalencias de la infección según uso de anticonceptivos. Prevalencia de la infección con VPH según cantidad de compañeros sexuales durante toda la vida. Prevalencia de la infección con VPH por cantidad de compañeros sexuales en los últimos dos años Distribución por tipo viral especifico expresado en porcentaje Pág

12 Tabla Nº 23. Análisis de varianza entre dos variables homogéneas. Tabla Nº 24. Factores de riesgo asociados a la infección 48 Tabla Nº 25. Análisis de concordancia entre Amplicore y Reverse Line Blot mediante índice kappa 48 49

13 INTRODUCCION El cáncer de cuello uterino (CCU) es una de las principales causas de muerte por cáncer en mujeres a nivel mundial, principalmente en países en vía de desarrollo (Lang et al, 2005). El agente etiológico asociado al cáncer cervical es el Virus de Papiloma Humano (VPH) principalmente los tipos oncogénicos o de alto riesgo; Esta infección es una de las más prevalentes en cuanto a infecciones de transmisión sexual (ITS) en el mundo (Walboomers et al., 1999; Bosch et al., 2002). Una de las características de la historia natural del cáncer cervical es que en más del 50% de pacientes con lesiones de bajo grado regresan, mientras que pacientes con lesiones intraepiteliales de alto grado y cáncer tienen una baja probabilidad de regresión, sin embargo no es del todo claro porque unas pacientes regresan y otras progresan (Baak et al., 2006). Por esta razón, es importante desarrollar estrategias que lleven al conocimiento de factores virales moleculares con valor predictivo, con capacidad para indicar que personas muestran alto riesgo de desarrollar este tipo de patologías, esto con el fin de procurar medidas de prevención, seguimiento e intervención. En este trabajo se realizó la descripción de características tales como el genotipo o genotipos virales más prevalentes en pacientes con lesiones de cuello uterino de significado indeterminado (ASCUS) que dentro de la clasificación Bethesda son catalogadas como células escamosas atípicas que denotan un cambio observado que puede concurrir en un margen entre células escamosas normales y células presentes en neoplasias intraepiteliales cervicales (NIC I) (Lang et al, 2005), mediante técnicas de alta sensibilidad, al igual que su correlación con los hallazgos patológicos y de la citología cervical esta última como herramienta de tamizaje en nuestro país. En este estudio se evaluó la presencia de ADN de VPH en mujeres con lesiones de ASCUS mediante la técnica AMPLICORE utilizada por el hospital que realizó el tamizaje y la que empleó la Universidad Nacional para esta investigación; el Reverse Line Blot (RLB), un ensayo basado en hibridización reversa a gran escala que permite la identificación de 37 genotipos de VPH, con previa amplificación de las muestras por PCR GP5+/GP6+ (Van den brule et al., 2002).

14 1. MARCO TEORICO 1.1 ANTECEDENTES EPIDEMIOLOGICOS Mundialmente el cáncer de cuello uterino continúa siendo el segundo tipo de cáncer más frecuente en la población femenina, con una incidencia de nuevos casos al año y causa alrededor de muertes anualmente (IARC 2002). Se considera que un 80% de los casos nuevos de Cáncer Cervical ocurren en países en vía de desarrollo donde los programas de tamizaje son mínimos (Safaeian, et al., 2007). La prevalencia de la infección cervical con VPH varia considerablemente a nivel mundial, y la detección de tipos virales de alto riesgo se convierte actualmente en una herramienta de tamizaje interesante por su sensibilidad y costo-efectividad especialmente en mujeres mayores de 30 años. Un análisis combinado de los estudios de prevalencia del VPH realizado por la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC), muestra variación entre las diferentes áreas. Sin embargo, esto provee evidencia de la variación regional en la distribución de los tipos virales para las mujeres sin anormalidades citológicas (Clifford et al, 2005). En el caso de Sur América, la prevalencia es de 14.3%, de los cuales los tipos mas prevalentes son el genotipo VPH 16 (15%) seguido por VPH 58 (7%); la distribución de los demás genotipos virales se puede observar en el grafico (figura 1) (Clifford et al, 2005). La prevalencia en Colombia de VPH en mujeres con citología normal es de 14.9%, de los cuales los 3 tipos de alto riesgo más prevalentes son los genotipos VPH16 que representa (16.3% de las mujeres con infecciones únicas), VPH 58 un (6.2%), VPH 56 (3.6%) y VPH18, VPH 51 (2.9%) (Molano et al., 2002). Se estima que los tipos virales 16 y 18 son responsables del 70% de todos los cáncer de cuello uterino (CCU) a nivel mundial, aunque la fracción estimada para VPH 16 y VPH18 es ligeramente mayor en las regiones mas desarrolladas (72-77%) en comparación con las menos desarrolladas (65-72%) (Clifford et al, 2006).

15 Figura 1. Presentación esquemática de la distribución de los genotipos de VPH en citología normal a nivel de Sur América. (Clifford et al., 2005). Actualmente no existe ningún meta-análisis de prevalencia específica de los tipos del Virus de Papiloma Humano (VPH) en mujeres con lesiones escamosas de significado indeterminado (ASCUS). Al igual que sucede con las lesiones escamosas intraepiteliales de bajo grado (LSILs), el diagnóstico de ASCUS no está bien estandarizado y la positividad para el VPH varía sustancialmente en los estudios publicados debido a la considerable variación intra e inter-observador en su definición (Clifford et al, 2006). Por otra parte, la positividad del VPH en los casos de ASCUS varía con la edad. En el estudio de cribado de ASCUS/LSIL ALTS se realizaron pruebas de detección para 27 genotipos del VPH en casos de ASCUS en los Estados Unidos de América utilizando cebadores PGMY09/11, de ellos casos (61%) dieron positivos para VPH (Castle et al, 2005). Estos mismos cebadores se han utilizado para estudios en mujeres costarricenses, el 42% de los 727 papanicolaous con resultados equívocos fue positivo, el 15% obtuvo resultados con infección múltiple. La prevalencia de los tipos 16 y 18 fue del 6.5% (15% en ASCUS VPH-positivas) y 1.7% (4% en ASCUS VPH-positivas), respectivamente (Herrero et al, 2005).

16 En Bélgica, de 549 casos el 59% de ASCUS fueron positivos para ADN de VPH y el 5% presentó múltiples tipos virales detectados mediante PCR con MY09/11 (Depuydt et al, 2003). La prevalencia del VPH 16 fue del 13 % (22% en ASCUS VPH-positivas) y las del VPH 18 fue del 6% (10% en ASCUS VPH-positivas) (Depuydt et al, 2003). En Uppsala (Suecia), de 161 casos el 58% de ASCUS fueron positivos para ADN de VPH detectados mediante PCR GP5+/GP6+ y Hybrid Capture 2. Además, 42 mujeres (46%) con citología normal fueron positivas para algún tipo viral de alto riesgo. Las muestras que fueron positivas para el test de VPH, se analizaron nuevamente realizando secuenciación del ADN de VPH y se encontró que el tipo más prevalente es VPH 16 (34.2%), seguido por VPH 45 (18.4) y VPH 18 (10.6%) (Lang et al, 2005). Por último, en Turkía en una población de 135 mujeres se evidenció ADN de VPH en 47 de ellas representando un 34.8% de prevalencia (Dane et al., 2009). 1.2 VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (VPH) El virus del papiloma humano (VPH) se considera el principal factor de riesgo y ha sido catalogado como causa necesaria pero no suficiente para el desarrollo de CCU (Walboomers et al., 1999), y numerosos estudios epidemiológicos demuestran la relación causal entre la infección viral y las neoplasias cervicales (Muñoz et al., 2000; Bosch et al., 2002; Bosch et al., 2003).El VPH es el agente infeccioso de transmisión sexual, considerado como el principal factor de riesgo para desarrollar cáncer de cuello uterino, ya que se ha observado su presencia en el 99.7% de los casos de cáncer de este tipo, que se presentan anualmente en el mundo (Cuschier et al., 2005; Muñoz et al., 1993; Muñoz et al., 2000; Zur Hausen et al., 1994). El virus del papiloma humano es un virus, sin envoltura lipídica, constituido por ADN circular de doble cadena con un tamaño aproximado de 8000 pb. El genoma está dividido en una región codificante que comprende ocho genes transcritos en un marn policistrónico y una región no codificante. La región no codificante o reguladora (LCR, Long Control Región) contiene el origen de replicación, una región promotora (P97 en VPH 16) y una secuencia intensificadora que controla la

17 transcripción de los genes virales. La región codificante está dividida a su vez en regiones de expresión temprana y tardía. Los primeros genes (E1, E2, E4, E5, E6 y E7) están relacionados con la modulación de los procesos de transformación celular, replicación y transcripción viral. La región de expresión tardía contiene los genes L1 y L2 que codifican para las proteínas estructurales de la cápside. (Figura 2). Taxonomicamente los papilomavirus se encuentran integrando la familia papillomaviridae compuesta por 16 géneros, los virus pertenecientes al genero Alpha papillomavirus se caracterizan por ser causantes de lesiones a nivel de mucosas y piel en humanos y primates (de Villiers et al., 2004; Bernard et al., 2005). Se han aislado más de 100 tipos diferentes de virus y más de 40 están asociados con lesiones benignas o malignas del tracto ano-genital. Estos virus se han dividido en grupos de bajo riesgo (VPH 6, 11, 26, 34, 40, 42, 43, 53, 54, 57, 61, 66, 70, 72, 66, 81, 83, 84, CP6108) asociados con lesiones benignas y de alto riesgo (VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82) asociados con un potencial de transformación maligna que resulta en el desarrollo de carcinomas invasivos ano-genitales de los cuales la mayoría están asociados con VPH-16 y VPH-18 a nivel mundial (Clifford et al., 2005; Muñoz et al., 2003; de Villiers et al., 2004; Bernard et al., 2005). Figura 2. Presentación esquemática del genoma del VPH (Muñoz et al., 2006).

18 1.2.1 VPH Y ONCOGENESIS El ciclo de vida del VPH comienza cuando las partículas virales consiguen, a través de pequeñas roturas o microabrasiones infectar la capa basal en células Stem del epitelio cervical, en la zona de transición. Existe controversia sobre la forma de entrada del virus a la célula y algunos estudios sugieren la dependencia de receptores tipo heparan sulfato y que es un proceso facilitado por endocitosis mediante vesículas cubiertas de clatrina (Doorbar et al., 2005). El ciclo de replicación al interior del epitelio puede dividirse en dos partes. En primer lugar, el genoma viral se replica hasta un número de aproximadamente 100 copias y, durante periodos variables de tiempo mantiene este bajo número de copias que todavía son competentes y capaces de replicarse. Las Proteínas virales E1 y E2 son esenciales para esta fase de replicación basal del ADN. En segundo lugar, una vez las células básales han sido llevadas al compartimento suprabasal, se altera la capacidad de dividirse y, en su lugar ponen en marcha el programa de diferenciación terminal. La replicación está asociada al proceso de diferenciación celular, por lo tanto, los papilomavirus se integran con la maquinaria celular del huésped para llevar a cabo este evento y aprovechan el recambio natural de las células epiteliales para infectar el tejido vecino con nuevas partículas virales. (Doorbar et al., 2005); (Figura 3). Figura 3. Ciclo de vida de VPH en los diferentes estratos del epitelio escamoso. (Muñoz et al., 2006).

19 El epitelio escamoso normal del cuello uterino es un epitelio plano estratificado queratinizado, la alteración de la maduración y diferenciación celular, puede llevar a la formación de un tejido nuevo de carácter atípico, maligno o neoplasia maligna. El cáncer de cuello uterino (CCU), es un proceso evolutivo, que se desarrolla como resultado de múltiples alteraciones genéticas, epigenéticas, inmunológicas e infecciosas; así como por la interacción entre el medio ambiente y la célula (Steben et al., 2007). Todas estas interacciones facilitan los procesos de transformación neoplásica, iniciando por lesiones escamosas no invasivas que progresan a etapas preinvasivas, (Muñoz et al., 2003; Renske et al., 2005), las cuales están conformadas por lesiones neoplásicas intraepiteliales cervicales (NIC) que van del grado I al III, caracterizadas por inmadurez y desorganización celular, anormalidades nucleares y la actividad mitótica incrementada, el grado de neoplasia está determinado por la extensión, la proliferación de células inmaduras y la atípia nuclear; si sólo está afectado el tercio más inferior del epitelio se designa como NIC I: Si la afección es del tercio medio o superior se denomina NIC II o NIC III respectivamente (Granflund et al., 2002). Dentro de las lesiones escamosas no invasivas encontramos las células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASCUS) que según la clasificación Bethesda son catalogadas como células escamosas que denotan un cambio observado en su morfología y puede concurrir en un margen entre células escamosas normales y células presentes en neoplasias intraepiteliales cervicales (NIC I), si la mujer previamente ha sido infectada con un tipo de VPH genital o por cambios celulares debidos a otra infección de transmisión sexual (ITS). (Lang et al, 2005). Las moléculas críticas en el proceso de carcinogénesis cervical son las proteínas E6 y E7, las cuales interaccionan con varias proteínas celulares (Munger et al., 2004). En sistemas experimentales estas interacciones han mostrado inducir la proliferación y, eventualmente, la inmortalización y transformación maligna de las células (Munger et al., 2004). Existen diferencias entre las proteínas E6/E7 de los tipos de VPH de alto y bajo riesgo, pero suele tratarse de diferencias de naturaleza cuantitativa más que cualitativa (Longworth et al., 2004). Actualmente, las interacciones mejor caracterizadas se producen con las proteínas prb y p53, que

20 se constituyen como moléculas importantes en el control del ciclo celular y que están alteradas en muchos canceres humanos. La unión de E7 a prb y consecuente liberación del factor de transcripción E2F, que desencadena la expresión de las proteínas necesarias para la replicación del ADN (Longworth et al., 2004). En condiciones normales cuando una célula entra en apoptosis que generalmente es llevada a cabo en la fase G1/S mediante la proteína p53; sin embargo, en las células infectadas por el VPH, este proceso de apoptosis o muerte natural es bloqueado por la interacción de la proteína viral E6 con la proteína del huésped E6AP, que provoca la degradación proteolítica de p53 por medio de la ruta de la ubiquitina (Thomas et al., 1999; Doorbar et al., 2005). Los estudios relacionados con VPH han sido concentrados en los tipos de alto riesgo VPH16 y VPH18 y su papel en las progresión de lesiones preneoplásicas a carcinoma cervical invasivo (CCI) (Bosch et al., 2002); sin embargo, investigaciones recientes muestran que la prevalencia de otros genotipos de alto riesgo como 58, 52 y 31 puede deberse a variaciones geográficas, demográficas o clínico patológicas (Wang et al., 2003; Brestrovac et al., 2005; Andersson et al., 2005; Veras et al., 2005). Por otro lado, diferentes trabajos muestran que factores virales tales como persistencia de la infección, carga viral, expresión continua de las oncoproteínas E6 y E7, integración del ADN viral dentro del genoma de la célula hospedera e inactivación del gen E2 junto a la acumulación de mutaciones oncogénicas, son eventos que conllevan a la progresión de lesiones preneoplásicas a cáncer. (Giannoudis et al., 2001; Ferenczy et al., 2001; Burd et al., 2003; Baseman et al., 2005). En estudios de experimentación animal el gen E5 parece tener también una capacidad oncoproliferativa importante (Muñoz et al., 2000). La persistencia de la infección, así como determinadas circunstancias de permisividad inmunológica, hace que el ADN viral se integre en el genoma celular, con la aparición de una serie de acontecimientos que originan la transformación y la proliferación celular alterada; se produce así un desequilibrio entre el proceso de apoptosis y proliferación celular, la respuesta a estímulos de diferenciación celular, estímulos de crecimiento tisular o de vigilancia inmunológica, así como la capacidad de reparar mutaciones y alteraciones cromosómicas, está disminuida en una célula

21 infectada por el VPH (Kyo et al., 1997). Estos cambios hacen a la célula más vulnerable, lo que favorece que los acontecimientos que actúan como cofactores ocasionen la transformación celular (Longworth et al., 2004). Los cofactores en la oncogénesis del VPH: La evolución de la lesión cervical es susceptible de variación individual y depende de que aparezcan ciertas circunstancias que actuarían como cofactores o coinductores, favoreciendo la progresión de una lesión cervical hacia la malignidad tras la infección del virus ((Muñoz, 2003). Éstos se pueden agrupar en los siguientes: Referentes al virus: genotipo presente, coinfección con otros tipos de VPH, variantes del genotipo viral, carga viral e integración viral en el huésped. Referentes al huésped: estado hormonal, estado inmunitario, susceptibilidad genética. Referentes a factores ambientales: uso prolongado de anticonceptivos hormonales, multiparidad, tabaquismo y coinfección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), o Chlamydia trachomatis. Se estima que la infección por un Virus de Papiloma Humano de alto riesgo VPH-AR multiplicaría por 150 el riesgo de desarrollar un cáncer de cérvix (Muñoz, 2003). Esto hace entendible la relación de los factores epidemiológicos asociados a un incremento del riesgo del carcinoma cervical con la manera en que el VPH se transmite. 1.3 DIAGNÓSTICO DE CÁNCER CERVICAL La detección temprana de lesiones preneoplásicas HSIL (High Grade Squamous Intraepitelial Lesions) y LSIL (Low Grade Squamous Intraepitelial Lesions), se realiza mediante la primera herramienta de tamizaje que es la citología cervical, observándose cambios morfológicos en las células cervicales, principalmente cambios propios de la infección por VPH. Actualmente, se han desarrollado

22 tinciones inmunoquímicas que complementan la tinción de Papanicolaou, estas tinciones, detectan antígenos específicos del VPH. Sin embargo, este tipo de diagnóstico, presenta algunas limitantes, como son los falsos negativos en aproximadamente 20-30%, además de la presencia de otros contaminantes como bacterias y levaduras, y la tardanza en la fijación de las láminas ó el error humano al momento de la lectura (pues cada lámina contiene de a células que deben ser analizadas). El diagnóstico histopatológico, finalmente define la clasificación para las lesiones halladas en las pacientes que van desde NIC I hasta NIC III. Mundialmente la expresión ASCUS (Células escamosas atípicas de significado no determinado) acuñada por la terminología Bethesda 2001, ha tenido múltiples fallas en aceptación, tanto en relación con los parámetros citológicos para dicha terminología como para la unificación del enfoque del clínico a un manejo médico acorde con dicho resultado. Las células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASCUS) son detectadas en el 5% a 10% de mujeres que asisten al tamizaje de la citología. Su manejo es controversial y aunque cerca del 30% de estas mujeres presentarán neoplasias intraepiteliales cervicales de bajo grado (NIC 1) ; otras lesiones regresarán espontáneamente, sin embargo, cerca del 15% o quizás hasta un 40%, progresan a NIC 2 o NIC 3. (Dane, et al., 2009). De acuerdo con las guías consenso de la Sociedad Americana para la colposcopía y la patología cervical del 2001 para el manejo de las mujeres con anomalías citológicas cervicales, las mujeres con ASCUS deberían ser manejadas usando un esquema de 2 citologías repetidas, colposcopia inmediata, o tamizaje de detección de VPH para tipos de alto riesgo. varios estudios, han demostrado la utilidad de realizar detección de ADN de VPH como un complemento a la citología que es la herramienta de tamizaje primaria. (Dane, et al., 2009) Por esta razón, en nuestro país el Instituto Nacional de Cancerología (INC) contribuye al respecto, con el desarrollo del modelo control del cáncer para Colombia, y lideró la realización del Consenso Nacional de Expertos Tipo Panel con revisión sistemática de la literatura sobre tamización y manejo de neoplasias de cuello uterino en mujeres sin antecedentes de patología cervical (INC, 2007).

23 Dentro de los enfoques de manejo para esta alteración citológica se incluyen tres diferentes esquemas: 1. Realizar seguimiento citológico 2. Realizar pruebas de detección para el ADN VPH de alto riesgo. 3. Derivar a la paciente directamente a la colposcopia y biopsia. Teniendo en cuenta estos parámetros, el Instituto Nacional de Cancerología realizó unas recomendaciones; como estrategia óptima de manejo para las pacientes con citología reportada con células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASCUS). Sin embargo, aún existe desconocimiento acerca de ellas y por lo tanto el manejo óptimo estandarizado para estas pacientes sigue siendo poco asertivo en nuestro país. En los últimos años, las técnicas de biología molecular se convierten en una herramienta útil para la detección de la infección por VPH, ya que proveen un alto porcentaje de sensibilidad y se estima que con la ayuda de estas técnicas los falsos negativos son <1% (Jung et al., 2004; Burd, 2003). Finalmente, la implementación de pruebas para la detección de ácidos nucleicos para la detección del VPH promete aumentar la sensibilidad y rentabilidad de los programas de cribado del Cáncer de Cérvix al detectar de forma más temprana las lesiones de alto riesgo y reducir la realización de colposcopias y tratamientos evitables. 1.4 DETECCION Y GENOTIPIFICACION DEL VPH Generalmente, los ensayos por PCR facilitan la detección de un amplio espectro de genotipos de VPH mucotrópicos, puesto que la alineación de los iniciadores con una región altamente homologa entre los tipos virales se extiende sobre una región interna polimórfica, permitiendo la tipificación específica de VPH. Dentro de estas técnicas basadas en PCR, los sistemas más frecuentemente usados y clínicamente evaluados son la amplificación con los primers MY09/11, PGMY09/11, GP5+/GP6+, SPF10.(Clifford et al., 2003,de roda et al., 1995; Manos et al., 1989,). Actualmente, la detección de ADN del VPH ha sido hecha

24 principalmente mediante ensayos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con primers consenso para la región L1 del virus de papiloma humano anteriormente mencionados que anteceden las técnicas de hibridización tales como la captura de híbridos (Hybrid Capture 2 [Qiagen]) o el AMPLICORE (Roche) que serán descritos en detalle más adelante. A pesar de la existencia de más de 100 genotipos de VPH, la búsqueda de éstos con propósitos clínicos ha sido simplificada y facilitada por la investigación de genotipos de alto riesgo simultáneamente en un ensayo, es decir; detección del grupo de VPH de alto riesgo. Es posible su realización mediante PCR GP5+/GP6+ y posteriormente inmunoensayos con enzimas (EIA) o HC2 (Jacobs et al., 1995; jacobs et al., 1997; Salomón et al., 2001). Sin embargo, hay una gran necesidad de identificar genotipos individuales de VPH para investigar la epidemiología y comportamiento clínico de tipos virales particulares. Además, la tipificación de VPH es de importancia para estudios de caracterización de poblaciones siendo usadas para ensayos de vacunación y monitoreo de la eficiencia de terapias dirigidas a VPH y vacunas (Van den brule et al., 2002). La determinación del tipo viral después de ensayos de PCR generales han sido hechos por secuenciacion de nucleótidos (Lambert et al., 2000; Vernon et al., 2000) o hibridación con sondas (sourthen dot blotting y EIA) (Jacobs et al., 1995; Manos et al., 1989; Van den brule et al., 1990) de los productos de PCR o por PCR tipo-específico para VPH (Van den brule et al., 1990). Sin embargo, todos estos métodos son muy laboriosos. Recientemente, los métodos de tipificación más favorables que se han descrito están basados en hibridización reversa, Reverse Line Blot (RLB) utilizando oligonucleótidos tipo específico de VPH (Forslund et al., 1994; Gravitt et al., 1998; Kleter et al., 1999) Amplicore El AMPLICORE, es una técnica que fue lanzada a mediados del 2004 en el mercado europeo. Este ensayo fue diseñado para detectar 13 genotipos de VPH de alto riesgo (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59, y 68), utiliza iniciadores para definir una secuencia de nucleótidos dentro de la región polimórfica L1 del genoma del VPH con una longitud aproximada de 165 pb. Adicionalmente utiliza

25 un par de iniciadores para el gen de -globina humano con una longitud de 268 pb y de esta manera proporcionar un control de la adecuación de la preparación celular, la extracción y la amplificación. Los amplimeros obtenidos de VPH y - globina marcados con biotina hibridarán con las oligosondas de VPH adheridas en microplacas de múltiples pozos. Para la detección de los productos hibridados, se adiciona un conjugado de avidina y peroxidasa de rábano picante que se unirá a los productos marcados con biotina en cada uno de los pozos. Luego de un lavado para eliminar exceso de conjugado no fijado, se adiciona una solución substrato que contiene peróxido de hidrógeno y 3,3,5,5 -tetrametilbencidina (TMB). En presencia de peróxido de hidrógeno, la peroxidasa de rábano picante fijada cataliza la oxidación de la TMB para formar un complejo coloreado. La reacción se detiene mediante la adición de un acido débil y se mide la absorbancia a 450nm usando un lector de micro pocillos automatizado y un punto de corte para determinar la positividad de las muestras analizadas. (Halfon et al, 2007) Captura de Híbridos La captura de híbridos 2 (HC2) es una técnica basada en una reacción de quimioluminiscencia en la cual el ADN del Virus de Papiloma Humano se une a un cocktail de sondas ARN, las cuales reconocen una amplia escala de tipos virales de alto riesgo (16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68) y bajo riesgo (6,11,42,43,44). Los híbridos de ADN-ARN se unen posteriormente a una superficie de un pozo en una microplaca, que esta cubierta con anticuerpos específicos para esos híbridos ADN-ARN; y finalmente los pozos positivos para VPH son detectados mediante un conjugado (fosfatasa alcalina) en combinación con un sustrato quimioluminiscente (Bolick et al, 2003) Reverse Line Blot El Reverse Line Blot, es un ensayo basado en hibridización reversa a gran escala que permite la identificación de 37 genotipos de VPH, con previa amplificación de las muestras por PCR bien sea; GP5+/GP6+ o MY09/MY11. Para este ensayo se utiliza un sistema miniblotter y una membrana de hibridización con derivatizaciones de grupos carboxilo que le confiere una carga negativa. Como

26 característica importante es que no es un ensayo radiactivo y la membrana utilizada puede ser fácilmente lavada y reutilizada al menos 15 veces sin pérdida de señal (Van den brule et al., 2002). Otra característica importante, es que primordialmente esta técnica es de gran uso en el ámbito de investigación no solo en estudios de corte transversal sino también en estudios de cohorte.(lazcano et al., 2001, Fu Xi et al., 2006)

27 2. OBJETIVOS 2.1 GENERAL Establecer la prevalencia de genotipos del virus del papiloma humano en pacientes con lesiones de significado indeterminado en un programa de tamizaje de la EPS sanitas de la ciudad de Bogotá, Colombia. 2.2 ESPECÍFICOS Detectar de manera global la presencia de VPH en la población a estudio. Determinar la presencia de genotipos virales de alto riesgo en lesiones de significado indeterminado de la población a estudio. Determinar la presencia de genotipos virales de bajo riesgo en lesiones de significado indeterminado de la población a estudio. Establecer la asociación de factores sociodemográficos como factores de riesgo con la infección. Evaluar la concordancia entre la técnica reverse line blot y el AMPLICORE.

28 3. PROBLEMA DE INVESTIGACION Y SU JUSTIFICACION El cáncer de cuello uterino (CCU) es el segundo tipo de cáncer más prevalerte a nivel mundial; sin embargo es una enfermedad que a pesar de sus altas tasas de incidencia, puede ser prevenida cuando es detectada en sus estados iniciales (Bosch et al., 2002). El VPH es uno de los agentes infecciosos de transmisión sexual más comunes, aproximadamente entre el 10 y 40% de las mujeres con citología negativa para neoplasia son positivas para VPH (Molano et al., 2002; Jacobs et al., 2000). El patógeno, que es detectado en el % de los casos de CCU, se convierte en una causa necesaria pero no suficiente para el desarrollo del cáncer (Walboomers et al, 1999); afirmación basada en observaciones de tejidos en los que existe presencia de la infección mas no de la enfermedad (Bosch et al., 2002). En el caso de pacientes con ASCUS la relación se mantiene (Sherman et al., 2002). La valoración citológica como único método asequible de tamizaje en nuestro país tiene limitaciones importantes una de ellas su baja sensibilidad, adicionalmente, la citología únicamente permite sugerir la presencia de una infección por VPH. La combinación de métodos de detección viral con citología cervical incrementan la sensibilidad de los programas de tamizaje y prevención de cáncer de cuello uterino (CCU) (Brink et al., 2006). Teniendo en cuenta que el pronóstico de carcinoma invasivo es generalmente pobre mientras que las lesiones precursoras frecuentemente regresan, el conocimiento de los eventos moleculares y posiblemente la genotipificación viral (alto riesgo vs. bajo riesgo) que hacen que una lesión avance es de considerable interés debido a la necesidad de identificar tendencias que permitan definir con mayor certidumbre si la lesión va a progresar y, por lo tanto, darle un tratamiento más adecuado a la paciente. Además en Colombia no existen estudios sobre análisis de los tipos virales de alto y bajo riesgo mas prevalentes en pacientes con ASCUS, y su vez la relación de estas prevalencias con otros factores tales como edad y condiciones socio demográficas; datos que son de gran importancia no solo para el conocimiento epidemiológico, sino para el desarrollo de nuevas técnicas diagnósticas, esquemas de vacunación para VPH y seguimiento de pacientes con anormalidades en la citología.

29 4. MATERIALES Y METODOS 4.1 TIPO DE ESTUDIO Estudio descriptivo de corte transversal. 4.2 POBLACIÓN DE ESTUDIO La población a estudio consistió en pacientes registrados en un hospital de tercer nivel de la ciudad de bogota que cumplieron los criterios de inclusión, es decir, mujeres entre 16 y 69 años, con reporte de citología ASCUS, registrados en la institución de salud, y que aceptaron participar voluntariamente en el estudio mediante la firma del consentimiento informado. A todas las participantes se les realizó una encuesta para la recolección de datos sociodemográficos, reproductivos y comportamiento sexual, y adicionalmente reporte de biopsia. Este estudio correspondió a una investigación con riesgo mínimo, de acuerdo con la clasificación establecida por el ministerio de salud en la resolución 8430/93, debido a que realizaron procedimientos comunes para la obtención de muestras biológicas. A todas las pacientes se les explicó el objetivo de la toma de las muestras y aceptaron firmar voluntariamente el consentimiento informado para su participación en la investigación. 4.3 OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS Se practicó a las pacientes exploración endocervical para obtener exudado cervical con citocepillo, posterior inmersión de las muestras endo y ectocervicales en el medio líquido comercial (PreservCyt ), realizado por la entidad Sanitas y almacenadas a 4ºC Control positivo VPH 16 Y VPH 18 El control positivo compuesto por el genoma completo de VPH 16 y VPH 18 introducido en el vector plasmídico pbr322, fue donado por el Centro de Referencia para Papilomas Humanos DKFZ (German Cancer Research Center, Heilderberg, Alemania).

30 4.4 EVALUACIÓN DE LA ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD DE LAS PCR La especificidad de cada cebado usados en las PCR, se evaluó inicialmente, empleando BLASTN V2.2.11, bases de datos en el GenBank, EMBL, y DDBJ, la corroboración experimental se realizó en pacientes VPH negativas y positivas. La sensibilidad de las PCR para la detección genérica de VPH y específica de los tipos virales mediante el Reverse Line Blot, se determinó mediante diluciones del ADN de (pbr322 VPH 16, VPH 18), empleando concentraciones entre 1 g y 10 fg. Previo a la evaluación de la especificidad y sensibilidad, se estandarizó las concentraciones de reactivos, sondas de oligonucleótidos y condiciones de reacción para cada PCR y el Reverse Line Blot. 4.5 EXTRACCIÓN DE ADN La extracción de ADN de las muestras procesadas mediante reverse line blot se realizó por el método de fenol-cloroformo descrito por Sambrook (Sambrook, 1985): 1. A partir de cada cepillado cervical tomar 200 L, se le agrega 1 L de proteinasa K y se incuba durante toda la noche a 37ºC. 2. Hervir durante 10 minutos en baño maría los tubos bien tapados con parafilm para inactivar la proteinasa K. 3. Adicionar a la muestra 200 L de fenol-cloroformo/alcohol isoamilico (24:1), para que queden partes iguales muestra y fenol-cloroformo. 4. Se le da Vortex para homogenizar hasta que quede blanca la mezcla. 5. Se centrifuga por 1 minuto a r.p.m. 6. Transferir la fase acuosa a un nuevo vial. 7. Agregar 200 L de cloroformo y se le da vortex. 8. Se centrifuga nuevamente por un minuto a r.p.m. 9. Transferir la fase acuosa a un nuevo vial, es decir; la de arriba. 10. Se adiciona 40 L de acetato de sodio, 0.5 L de glicógeno y 500 L de etanol al 100% frío. 11. Se deja a -70ºC durante toda la noche. 12. Centrifugar los viales por 30 minutos a r.p.m. a 4ºC.

31 13. Se descarta el sobrenadante y se adiciona 200 L de etanol al 70% para retirar exceso de acetato de sodio. 14. Centrifugar los viales por 30 minutos a r.p.m. a 4ºC. 15. Se descarta totalmente el sobrenadante y se dejan los viales abiertos hasta la total evaporación del etanol. 16. Resuspender el ADN en 100 L de agua HPLC estéril. 17. Almacenar a -20ºC. 4.6 EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DEL ADN Se evaluó la calidad del ADN de las muestras empleando como indicador la amplificación de un fragmento de 152pb del gen β-globina humano mediante los primers: GLOBINA PCO3 S PCO4 A 5`ACACAACTGTGTTCACTAGC3` 5`CAACTTCTACCACGTTCACC3` La reacción de PCR se realizó en el termociclador My Cycler de BioRad, en un volumen final de 25µL conteniendo 1X Buffer (Promega), 3.0mM MgCl (Promega), 0.75 mm dntps (Promega), 0.75mM de cada primer (Invitrogen), 0.2 U Taq Polimerasa (Promega) y 5 L de ADN. La PCR se realizó en un volumen final de 25µL. Cada uno de los 40 ciclos de amplificación se desarrollará de la siguiente forma: 94ºC por 1 min.; 52ºC por 1 min y 72ºC por 1 min. La primera denaturación se realizará a 94ºC por 4 min y la elongación final por 10min, Como control positivo se empleó ADN linfocitario y como control negativo agua destilada. Diez microlitros de cada amplimero fueron analizados en un gel de agarosa al 2% teñido con Bromuro de Etidio 0.5 g/ L. El corrido se realizó en el equipo de electroforesis Power PAC 3000 de BioRad a 80V durante 1hora. Por último, el producto de amplificación se detectó en el digitalizador de geles GelDoc 1000/2000 de BioRad.

32 4.7 DETECCIÓN GENÉRICA DE VPH La detección genérica de VPH se realizó por PCR GP5+/GP6+ según el procedimiento descrito por (de Roda Husman et al., 1995), para obtener un fragmento de 142 pb empleando los iniciadores: VPH GP5+ S 5 TTTGTTACTGTGGTAGATACTA 3 GP6+ A 5 GAAAAATAAACTGTAAATCATA 3 La reacción de PCR se realizó en el termociclador My Cycler de BioRad, en un volumen final de 50µL conteniendo las siguientes concentraciones de reactivos Buffer 1X (Promega), MgCl 3.0 mm (Promega), dntps 10 mm (Promega), de cada primer 0.25 M (Invitrogen), 0.4 U Taq Polimerasa (Promega) y 5 L. Cada uno de los 40 ciclos de amplificación se desarrolló de la siguiente forma: 94ºC por 1 min.; 40ºC por 2 min y 72ºC por 1.5 min. La primera denaturación se realizó por 4 min y la elongación final por 10min. Como control positivo se empleó pbr322 VPH 16 y 18 y como control negativo agua destilada. 4.8 DETECCIÓN ESPECÍFICA DE VPH MEDIANTE REVERSE LINE BLOT El método de tipificación utilizado está basado en hibridización reversa, utilizando un sistema miniblotter sobre el producto de PCR obtenido después de realizar amplificación con PCR GP5+/GP6+. Este método de tipificación es denominado Reverse Line Blot (RLB), que permite la identificación de 37 genotipos de VPH. Los tipos virales que fueron determinados son los siguientes: VPH 6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 66, 68, 70, 72, 73, 82, 83, 84, 82, 71, 81, CP6108. Las oligosondas utilizadas para este fin fueron las reportadas por (Van den Brule et al., 2002):

33 Tabla Nº 1. Secuencias de las Oligosondas usadas para la tipificación por RLB. Nº Tipo Secuencia MM4 83 MM7 84 MM8 82 IS39 CP CP CP8304 TCCGTAACTACATCTTCCA TCTGTGTCTAAATCTGCTAC CATTATGTGCTGCCATATC TGCTTCTACACAGTCTCCT GTACATTATCTGCAGCATC GCAATTGCAAACAGTGATAC TGCACACAAGTAACTAGTGA TTTTCAGTTTGTGTAGGTACA CTGCTGTGTCTTCTAGTGA ATAGAGTCTTCCATACCTTC AGTCCCCCACACCAACC TGGTGATACATATACAGCTG TCTACTGACCCTACTGTG TACTAGTGAACAATATAAGCA TAATTTAACATTATGTGCCTC TGCTGCGGTTTCCCCAA GAATACCTTCGTCATGGC TGTCTACATATAATTCAAAGC CACGCAGGATAGCTTTAAT TCAGTCTCCATCTACAACAT CAGAACAGTTAAGTAAATATG CCACAGAAACTAATTATAAAG TATGCACTGAAGTAACTAAG TCTACTACTGCTTCTATTCC CCCCCCCTGTATCTGAAT AGCTAAAAGCACATTAACTAA CTGAATCAGCTGTACCAAT GAAACGGCCATACCTGCT AGCGTCCTCTGTATCAGAA ACAGGCTAGTAGCTCTACT ACTGCTGGTACTCAATCTG AGCGTCCTCTGTATCAGAA TGCTACCAACACCGAATCA TGCTACTCCATCAGTTGC CTTCCCAGTCTGCCACA TGCTACCAAAACTGTTGAG GCTACATCTGCTGCTGC Para realizar la tipificación se debe primero activar la membrana de hibridación y posteriormente se procede al proceso de hibridación; a continuación se explica detalladamente como se lleva a cabo los procesos de activación de la membrana e hibridación.

34 4.8.1 Activación de la membrana 1. Cortar la membrana Biodine C en una sección de 14 cm 2 y marcar con un corte en una de las esquinas. 2. Pesar 1,6g de EDAC (16% peso/volumen) [1-etil-3-(3-dimetil amino propil) carbodimida; Sigma] y diluirlo en 10mL de H 2 O destilada en un tubo falcom. 3. Colocar la membrana en un recipiente plástico con la solución de EDAC e incubar durante 10 minutos en agitación. Luego realizar un lavado rápido con H 2 O destilada en el mismo recipiente. 4. Colocar la membrana en el miniblotter de modo que el corte que se hizo de marcación se ubique en el borde superior derecho. Asegurar que este bien ajustada y aspire los carriles para eliminar el exceso de líquido. 5. En los carriles 1 y 45 aplicar una solución 1:100 de tinta china para marcar los carriles de los extremos en la membrana y en los demás carriles colocar la solución de oligosondas (150µL) e incubar durante 1 minuto. 6. Aspirar los carriles para eliminar el exceso de líquido y retirar la membrana del miniblotter con unas pinzas. 7. Colocar la membrana en un recipiente plástico y añadir una solución de NaOH 100mM durante 8 minutos a temperatura ambiente. 8. Hacer un lavado rápido con H 2 O destilada en el mismo recipiente. 9. Lavar la membrana con 100mL de una solución de SSPE 2X/0,1%SDS a 60ºC durante 5 minutos en agitación teniendo cuidado de mantener la temperatura.

35 4.8.2 Hibridación del producto de amplificación 1. Preparar 100mL de 2XSSPE/0.1%SDS que se usará a temperatura ambiente, 200mL de 2XSSPE/0,5%SDS que se colocan a 42ºC, 200mL de 2XSSPE/0,5%SDS que se colocan a 53ºC y 200mL de 2XSSPE que se usará a temperatura ambiente. 2. Se toma 10µL del producto de previamente amplificado mediante PCR GP5+/6+, marcado con biotina en el extremo 3 y se disuelven en 140µL de 2XSSPE/0,1%SDS. Posteriormente se denatura la solución a 99ºC por 10 minutos y rápidamente se colocan las muestras en hielo para evitar la unión de las cadenas nuevamente. 3. Se lava la membrana con 100mL de 2XSSPE/0,1%SDS a temperatura ambiente durante 5 minutos en agitación. 4. Se coloca la membrana en el miniblotter de modo que el corte de marcación se ubique en el borde inferior derecho; seguidamente se aspira el exceso de líquido. 5. Se colocan los productos denaturados en el miniblotter y se incuba a 42ºC durante 45 minutos teniendo cuidado en mantener la temperatura. 6. Se aspiran los carriles y se retira la membrana del miniblotter. 7. Se coloca la membrana en un recipiente plástico y se hacen dos lavados cada uno con 100mL de la solución 2XSSPE/0,5%/SDS a 53ºC durante 10 minutos en agitación. Asegúrese de mantener la temperatura durante el periodo de incubación. 8. Se toman 20mL de 2XSSPE/0,5%SDS a 42ºC y se le adiciona 5µL (dil. 1:4000) de conjugado estreptavidina peroxidasa y mezclar con vortex por un pulso. La membrana se incuba con el conjugado estreptavidina-peroxidasa por 45 min. a 42 C.

36 9. Con unas pinzas se enrolla la membrana y se coloca en un tubo de hibridización, seguidamente se añaden los 20mL de la solución del conjugado incubando a 42ºC durante 45 minutos en un horno de hibridización. Chequear la temperatura durante el tiempo de incubación. 10. Se retira la solución del conjugado y se hacen 2 lavados cada uno con 100mL 2SSPE/0,55SDS a 42ºC durante 10 minutos en agitación. Asegúrese de mantener la temperatura durante el periodo de incubación. 11. Se coloca el filtro en un recipiente plástico, seguidamente se lava la membrana dos veces con 100mL de 2XSSPE durante 5 minutos a temperatura ambiente en agitación. Se descarta la solución. 12. Se prepara la solución de ECL reactivo de detección (Amersham,) mezclando 5 ml de la solución de tapa negra y luego 5mL de solución de tapa blanca siempre en ese orden en un tubo falcom cubierto totalmente con papel aluminio. 13. Se traspasa la membrana a un recipiente, se le adiciona la solución ECL y se incuba durante 2 minutos a temperatura ambiente en agitación. 14. Se coloca la membrana entre dos acetatos y se le retira el exceso de líquido. 15. En un cuarto oscuro se hace una marca en la parte superior derecha en una película de radiografía (Hyperfilm Amersham) y este se coloca sobre los acetatos que tienen la membrana, dentro de un cassette de autoradiografía teniendo cuidado que la marca de la membrana esté en la parte superior derecha. 16. Se espera hasta el día siguiente para realizar el revelado en el equipo Medicalfilm Processor SRX-101A.