COMPETENCIA TECNICA. Equipamiento
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- Manuel del Río Campos
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1 Cumplimient de requisits técnics en ensays agralimentaris Fernand Lafnt Déniz La acreditación en labratris agralimentaris Acreditación de labratris (ISO/IEC 17025:2005) Recncimient frmal pr parte de una entidad autrizada, de la cmpetencia técnica de un Labratri para la realización de una actividad determinada, perfectamente definida. Anex Técnic (Alcance ) Dcument dnde aparecen definidas las actividades (en el cas de labratris de ensay, ls análisis) que están cubierts pr la acreditación cncedida. La acreditación en labratris agralimentaris
2 REQUISITOS DE GESTION (Apd. 4) Organización Sistema de gestión Cntrl de dcuments Revisión de pedids, fertas y cntrats Subcntratación Cmpras de servicis y suministrs Servicis al cliente Cntrl de trabajs n cnfrmes Mejra Accines crrectivas Accines preventivas Cntrl de registrs Auditrias internas Revisión pr la dirección Quejas La acreditación en labratris agralimentaris REQUISITOS TECNICOS (Apd. 5) Generalidades Persnal Instalacines y cndicines ambientales Métds de ensay y de calibración y validación de ls métds Equips Trazabilidad de las medidas Muestre Manipulación de ls ítems de ensay Aseguramient de la calidad de ls resultads de ensay Infrme de resultads La acreditación en labratris agralimentaris
3 Persnal (Apd. 5.2) COMPETENCIA TECNICA Persnal Equipamient Métds La acreditación en labratris agralimentaris Equips alta cmplejidad: CG/MS, HPLC/MS, ICP/MS, IRMS, MS alta reslución Métds análisis cmplejs: dilución istópica, adición standard, multirresidus gran númer de analits (>200) PERSONAL ALTAMENTE CUALIFICADO Integracines anómalas (analits cn varis pics, baja relación S/R, ) Identificacines espectrales n adecuadas Desarrll de métds defectuss (fragmentacines ines en MS/MS, métd crmatgráfic ) Preparación de muestra y dislucines n adecuadas (manipulación...) Persnal
4 METODOS DE ENSAYO Y VALIDACION (Apd. 5.4) Métds Tips Características Nrmalizads Interns - Métd Oficial (BOE ) - Métd nrmalizad (AENOR ) - Métd publicad pr rganizacines de prestigi (AOAC, COI, EPA ) - Métd desarrllad pr el LE - Prcedimient nrmalizad mdificad pca nula revisión dcumental pca validación* Revisión dcumental Validación La acreditación en labratris agralimentaris Métds Interns Guías funcinamient métds etc
5 Características Generales Métds Análisis Crmatgráfics HPLC HPLC CG Manipulación de muestra Reglament CE 401/2006. Métds muestre mictxinas en aliments Directiva CE 63/2002. Métds muestre pesticidas en aliments Etc Reglament CE 396/2005. Partes a analizar pesticidas en aliments y pienss. Reglament CE 1883/2006. Dixinas y PCBs en aliments Etc
6 Manipulación de muestra Identificación mediante una referencia única Muestra mínima Preparación de la misma previ al análisis (hmgeneización, trituración, lifilización, refrigeración, adición agentes estabilizantes ) Tiemp máxim de cnservación previ al análisis y psterir al mism (especialmente analits pc estables ó vlátiles). MUESTRA REPRESENTATIVA Matriz (cmpsicinal, degradación) Analits (degradación, pérdida) Analits standard Patrnes purs/dislucines certificadas: Pureza (certificada) Definir cndicines de almacenamient adecuadas (temperatura, expsición a la luz, recipiente ) Caducidad Pes mínim (10 mg aprx.) Equips calibrads Dislucines patrnes: Us dislvente adecuad (precipitación, vlatilidad, reactividad ) Crrección pureza Identificación adecuada Cndicines de almacenamient Cmparación dislucines nuevas cn antiguas (<10%) Emple dislucines diferente prcedencia Caducidad
7 Bibligrafía Métds de extracción Pesticidas: acetat etil, métd Luke, QuEChERS (ENE-EN 15662:2009) Mictxinas (agua/acetnitril, ) Pesticidas, PAHs en aguas (SPE, ELL ) Inyección directa (pesticidas aguas ) Inyección directa Análisis de matrices líquidas pr inyección directa (aguas) tras dilución (vins, aguas residuales ) Pesticidas en aguas pr HPLC/MS Acrilamida en agua pr HPLC/MS Rapidez, sencillez, menr cst Ocratxina y aminas biógenas en vins Herbicidas (triazinas, fenxiácids..) agua cnsum Inyección 25 µl, HPLC/MS(MRM) Dimetat Flurxipir Simazina Diurn Fsmet µg/l Linurn Terbutilazina Tebucnazl Diflufenican Oxiflurfen Acrilamida en agua cnsum Inyección 25 µl, HPLC/MS(Trap) 0.10 µg/l acrilamida Ocratxina A en vin Inyección 10 µl, HPLC/MS(MRM) 0.25 µg/l OTA 402/167
8 Inyección directa Aminas biógenas en vin (dilución 1/100 en fase móvil) 0.2 mg/l aminas (0.002 mg/l) Efect matriz Matriz lechuga frtificada cn 125 pesticidas pr CG/MS (0.02 mg/kg) Acetat etil Luke Luke/GPC Acetat etil: 94% Luke: 96% QuEChERS: 98% Luke/GPC: 100% QuEChERs cn PSA QuEChERs sin PSA
9 Velcidad de adquisición Definición pic crmatgráfic 10 punts A 0.2 seg/scan 0.4 seg/scan 3 seg (15 punts) 3 seg (8 punts) B Velcidad de adquisición ines en MS Multirresidus fithrmnas en vegetales pr HPLC/MS: auxinas, giberellinas y citquininas Ac Giberéllic RSD Areas (n=5) = 9.5% Velcidad de adquisición 0.8 seg/scan 0.2 seg/scan RSD Areas (n=5) = 2.1%
10 Velcidad de Adquisición ines en MS Equips actuales MS: Elevadas velcidades de adquisición de ines (<5 mseg/transición MRM) Eliminación segments adquisición Métds de adquisición de ines inteligentes Métds más rápids Mayr númer analits Relación S/R Selección de señales crmatgráficas que garanticen una adecuada relación S/R al Límite de Cuantificación (LC) Prmetrina en lechuga pr LC/MS Cncentración RSD (n=5) S/R ppm ppm 0.01 ppm > ppm 0.10 ppm 0.25 ppm > >1000 Señal ) Ruid
11 Relación S/R SEÑAL (S) S/R = 3 RUIDO (R) LD = 3 S LOQ = 5 S S: desviación standard blanc S/R > 5 S/R =2 u t Métds de detección El métd debe garantizar ls siguientes aspects (validación): Sensibilidad suficiente Selectividad adecuada Métds de cnfirmación residus veterinaris (Decisión CE 657/2002) Métds válids (reglamentads) Residus veterinaris Dixinas/PCBs (HRMS), reslución 10000
12 Métds de detección Relación tips ines MS y punts de identificación en residus veterinaris Ejempls de cálcul punts identificación cn diferentes técnicas Sustancias Grup A (prhibidas) 4 punts Sustancias Grup B 3 punts Métds de detección Espectrmetría de Masas (requisits de identificación dependen de la frma de adquisición/especificacines técnicas de ls equips). Detectres universales/selectivs de Crmatgrafía: a menud se requiere cnfirmación cn la misma técnica (clumna diferente), cn tr detectr. Requisits de identificación pr MS para pesticidas (Guía SANCO/2009)
13 Identificación MS Trabajar cn In Ratis, preferentemente Tlerancias máximas establecidas (idénticas para pesticidas y residus veterinaris) Ines de mayr masa más selectivs Ines istópics (clusters Cl y Br) Intensidad relativa Tlerancias In Ratis EI/CG/MS CI/CG/MS, CG/MS n, LC/MS, LC/MS n >50% ±10% ±20% 20-50% ±15% ±25% 10-20% ±20% ±30% Br Br 2 Br 3 <10% ±50% ±50% Cl ClBr ClBr 2 ClBr 3 Cl 2 Cl 2Br Cl 2Br 2 Cl 2Br 3 MUY IMPORTANTE CRITERIO ANALISTA!!! Cl 3 Cl 3Br Cl 3Br 2 Cl 3Br 3 Identificación/cuantificación crmatgráfica Establecer criteris t R : 0.5% CG y 2.5% HPLC t R 2 t 0 (frente crmatgráfic interferencias) Frma de pics adecuada: cmpuests muy plares en HPLC (eluyen al inici) y CG (frman clas pr adsrción sbre grups silanles, baja vlatilidad ) Area crmatgráfica (preferentemente) S/R señal cuantificación 6/10 S/R ines cualificación (MS) 3 Preferentemente, intensidad ines >10% del ión más intens (cuantificación) Fase móvil ACN ACN Metamidfs pr HPLC/MS Metmil pr HPLC/MS
14 Ines cualificación Mictxinas en aliment infantil pr LC/MS (frtificación micrg/kg) Dexinilvalenl 1 Dexinilvalenl 2 Aflatxina B1 1 Aflatxina B1 2 Aflatxina B2 1 Aflatxina B2 2 Aflatxina G1 1 Aflatxina G1 2 Aflatxina G2 1 Aflatxina G2 2 Ocratxina A 1 Ocratxina A 2 Zearalenna 1 Zearalenna 2 Mictxina Cncentración (µg/kg) RT (min) In Rati/ Teóric Rati OK Dexinilvalenl Dexinilvalenl (0.92) Aflatxina B Aflatxina B (0.74) Aflatxina B Aflatxina B (1.12) Aflatxina G Aflatxina G (0.98) Aflatxina G Aflatxina G (0.56) Ocratxina A Ocratxina A (1.46) Zearalenna Zearalenna (0.93) Ines cualificación Análisis de piáces (mrfina, cdeina, tebaina y derivads) en semilla adrmidera para alimentación pr HPLC/MS Grasa: 25-50% Mrfina Fit<500 Identificación Cdeina Fit<700 Cdeina m/z 165 In Rati= 0.13 ( ) MORFINA m/z 214 In Rati= 0.20 ( ) CODEINA TEBAÍNA
15 Identificación de analits Asignación adecuada de analits Frmads pr más de un cmpnente (cipermetrinas, deltametrina, fluvalinat, spinsad ) Espectrs muy similares idéntics (acrinatrina y λ-cihaltrina, ) Fluvalinat Cipermetrinas Acrinatrin λ-cihaltrina Calibración de analits Recta de calibrad: Relación de la respuesta del detectr cn la cncentración Aceptable 1 punt (señal ±50%), 2 punts (rang lineal detectr, FR alt /FR baj <120%, C alt /C baj <4) Preferible ajuste lineal para 3 niveles (dilución de extract) Trabajar cn al mens ds criteris de linealidad (r 2, RSD residuales, ceficiente linealidad ) Frecuencia: pr tanda cntrl de calibración (<30% a LCL ó <20% pr encima LCL) LCL LOQ Calibración en matriz: en aquélls cass dnde la matriz afecte a la respuesta de analits Criteris linealidad: Cef. Crr. >0.99 RSDr <20% Dexinivalenl ppb Aflatxina B ppb Aflatxina B ppb Aflatxina G ppb Aflatxina G ppb Ocratxina A ppb Zearalenna ppb
16 Detección ines pr Alta Reslución/MS Detección masa exacta de ines: desviación mda/ppm Alta selectividad en cnfirmación Crmatgramas ines masa exacta muy limpis N es necesari realización MS/MS, trs ines cnfirmación Simplicidad de preparación métds Analizadres masas Alta Reslución: MAGNETICOS TOF ORBITRAP TRAMPAS LINEALES Detección ines pr Alta Reslución/MS Pes mnistópic: es el masa del ión frmad a partir de ls elements mnistópics. Sn las masas de ls ines que btenems en MS En la Tabla Periódica, l que se prprcina es el pes atómic prmedi del element, tmand en cuenta las prprcines de sus isótps en la naturaleza. 100% 90% 80% Cmpuest C 16 H 14 ClN 3 O: PM prmedi = PM Mnistópic = Abundancia relativa 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% m/z
17 Detección ines pr Alta Reslución/MS ESI - Flufenxurón en naranja (0.01 ppm). m/z= ESI+ Crmatgramas HPLC/ESI (fullscan) extract naranja Frtificación 0.01 ppm (250 pesticidas) Azinfs metil en naranja (0.01 ppm) m/z= VALIDACION PROCEDIMIENTOS DE ENSAYO Objetivs Demstrar rbustez métd: evaluación de la recuperación media y reprducibilidad del métd Pequeñs ajustes en métd en el tiemp n afectan al funcinamient Demstrar su aplicabilidad a matrices de la misma categría Determinar ls valres de aceptabilidad (pr ejempl, recuperación) en análisis de rutina Recpilar infrmación para determinar la incertidumbre del métd Resultad Infrmación suficiente que pruebe, para el alcance fijad (ANALITOS, CONCENTRACIONES, MATRICES), que el métd es: ESPECIFICO, SENSIBLE, VERAZ y PRECISO = EXACTITUD
18 Validación prcedimients de ensay Que prcedimients hay que validar? Prcedimients n nrmalizads Prcedimients nrmalizads utilizads fuera de su alcance previst Ampliacines mdificacines de métds nrmalizads: en función de la mdificación realizada, el Labratri debe tener cmpetencia suficiente para evaluar que parámetrs hay que revalidar. Validación prcedimients de ensay VERIFICACION DE PROCEDIMIENTOS NORMALIZADOS COMPROBACIÓN que ls parámetrs de funcinamient establecids para dich prcedimient, pueden ser alcanzads pr el Labratri utilizand sus medis específics: equips, persnal, ambientales PRECISION, VERACIDAD, LOQ, LINEALIDAD
19 Validación prcedimients de ensay VALIDACION PROCEDIMIENTOS INTERNOS El grad de validación y parámetrs a evaluar dependen de cada métd Validación prcedimients de ensay
20 Errres de medición Errr de medición: diferencia entre el resultad de una medición y el valr de referencia Errr aleatri: cmpnente del errr de medición que, en medicines repetidas, varía de frma impredecible Errr sistemátic: cmpnente del errr de medición que, en medicines repetidas, permanece cnstante varía de frma predecible Errres de medición Requisit A Requisit B
21 Grad de cncrdancia entre resultads btenids en medicines repetidas de un mism bjet de bjets similares, baj cndicines específicas Parámetrs en la Validación Grad de cncrdancia entre el prmedi de un númer de resultads y el valr de referencia Capacidad de un métd para cuantificar exactamente un analit en presencia de interferencias Interval de cncentracines de analit en el cual puede cnsiderarse el métd validad Menr cncentración de analit en una muestra de ensay que puede ser cnfiablemente distinguida del blanc). LD=3 S blanc Capacidad de un métd analític de prducir resultads que sean directamente pr medi de una transfrmación matemática definida, prprcinales a la cncentración de analit en la muestra Menr cncentración de analit en una muestra de ensay que puede ser determinada cn un aceptable nivel de incertidumbre. LOQ=10 S blanc Capacidad del métd de mantenerse sin cambis ante pequeñas variacines en ls parámetrs del métd. Medida de su cnfiabilidad durante su us rutinari Parámetr asciad cn el resultad de una medición, que caracteriza la dispersión de ls valres que pdrían se raznablemente atribuids al mesurand. Veracidad Cóm se evalúa? Análisis varias veces de un Material Referencia Certificad (MRC) Matriz blanca frtificada dentr del rang del méttd Clrpirifs en aceite Recuperación (%)
22 Selectividad Capacidad de un métd para cuantificar exactamente un analit en presencia de interferencias Interferencias: especie química que causa errres sistemátics en la determinación de un analit: Interferencias que den señales y/ respuestas que n se distingan de las del analit Interferencias que afecten a la señal del analit (efect matriz) EVALUACION Blanc de reactivs Blanc de matriz Adición de cantidades cncidas de analit sbre blanc de matriz Estudi cn ptenciales interferencias Validación de prcedimients de ensay Prcedimient de Validación. Prcedimient que recge la estrategia a seguir para realizar las validacines de matrices y analits, y se definen ls criteris (resultads a alcanzar) Criteris de validación de pesticidas (Guía SANCO 2009) Parámetr Que/Cm Criteri Linealidad Cn rectas calibrad Residuales 20% LOQ Nivel más baj que cumplen ls criteris de exactitud y precisión LMR Especificidad Blancs y muestras de cntrl 30% LOQ Exactitud Precisión (RSD r ) Precisión (RSD R ) Recuperación media en muestras adicinadas materiales referencia Obtenida en cada nivel de cncentración Reprducibilidad intralabratri (QC) % 20% 20%
23 Criteris de Validación Criteris de validación de residus veterinaris (Decisión 657) Parámetr Que/Cm Criteri Linealidad Ccα Ccβ Cn rectas calibrad (al mens 5 niveles) Límite de decisión Capacidad de detección Residuales 20% 3 veces S/R 20 blancs ISO (valr crític variable estad net) 3 veces S/R 20 blancs ISO (valr mínim detectable variable estad net) Especificidad Blancs y muestras de cntrl 30% LOQ Exactitud Precisión (RSD r ) Precisión (RSD R ) Recuperación media en muestras adicinadas materiales referencia Criteri depende cncentración Obtenida en cada nivel de cncentración Reprducibilidad intralabratri (QC) -50% a +20%, 1 µg/kg -30% a +10%, 1-10 µg/kg -20% a +10%, 10 µg/kg Hrwitz CV = 2 (1 0,5 lg C) Hrwitz Resultads de Validación PLAGUICIDA N1 Recuperación Criteris (%) Rec 1 (%) Rec 2 (%) Rec 3 (%) Rec media (%) Cumple Repetibilidad Criteris (%) Repetibilidad (RSD%) Cumple a-endosulfan si 20 8 si a-hch si si ALDRIN si 20 9 si AZOXISTROBIN si 20 1 si b-endosulfan si 20 4 si b-hch si 20 6 si BIFENTRIN si 20 8 si BROMOPROPILATO si 20 3 si BUPIRIMATO si 20 5 si CAPTAN si 20 9 si CIPERMETRINA si 20 8 si CLORFENVINFOS si 20 4 si CLORPROFAM si 20 2 si Cncentración mg/kg Recuperación (%) Lechuga Tmate Limón Uva Repetibilidad (CV %) Lechuga Tmate Limón Uva Reprducibilidad (CV %) Lechuga Tmate Limón Uva Incertidumbre relativa (%) Lechuga Tmate Limón Uva
24 Infrme de validación Dcument intern que debe cntener la siguiente infrmación (trazabilidad): Objetiv y alcance (matrices, cncentracines) Instrumentación y materiales utilizads Persnal invlucrad Prtcl de validación Resultads y cnclusines Prcedimient de ensay Firma de respnsables Alcance de Acreditación Ensays para ls que se define un alcance cerrad (matriz/analit) Ensays cn alcances genérics (requieren un nivel de cmpetencia técnica y de gestión añadidas): Nta Técnica 19: Rige criteris para categría de ensay genérica de plaguicidas en aliments Lista Pública de Ensays (LPE) Definición de familias de matrices (generalmente de acuerd a las establecids en Anex 1 SANCO) Matrices validadas y matrices cmprbadas (LOQ) Nta Técnica 18: Rige categrías de ensay más genéricas Lista Ensays Baj Acreditación (LEBA): englba tdas las familias de prducts y prducts en cncret, así cm familias de parámetrs y parámetrs en cncret acreditads. Ejempl: Categría de Ensay: Cntaminantes rgánics en aliments: -Parámetrs: PAHs ( ), PCBs (.), melamina, acrilamida -Familias de prducts: prducts de la pesca ( ), aliments infantiles ( ), carnes ( ), cereales ( ), aceites y grasas (...).
25 ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD Cóm sabems que hems realizad un buen trabaj en el Lab? ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD DE LOS ENSAYOS Benz(a)piren en pescad Aseguramient de la calidad de ls resultads de ensays ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD Aseguramient de la calidad: plan glbal de gestión que garantiza la integridad de ls resultads el sistema Materiales de referencia Intercambi de muestras Ejercicis de intercmparación Muestras dbles Muestras ciegas Cntrl de calidad: Cnjunt de ensays analítics que se realizan para asegurar la calidad/validez de ls resultads de cada análisis la herramienta Aseguramient de la calidad de ls resultads de ensays
26 Aseguramient de la Calidad N existe un criteri general/hja de ruta que indique cm llevar a cab el aseguramient de la calidad INTERNO EXTERNO Periódics / en cada tanda Más esprádics Aseguramient de la calidad de ls resultads de ensays Cntrl de Calidad Intern Actividades a realizar: Calibración/verificación (según criteris y frecuencia establecida) Cntrl de blancs (cntaminacines): señal<1/3 LOQ Ensays de recuperación rutinaris (preferentemente LOQ) y/ MRC. Se puede establecer un plan de rtación en el cas de ensays cn múltiples analits (pesticidas). Criteris: X ± 2 RSD (60-140%) Muestras dbles y ciegas (establecer criteris) Terbutilazina pr CG/MS Aseguramient de la calidad de ls resultads de ensays
27 Expresión resultads La expresión de resultads debe hacerse de acuerd a la reglamentación En determinads cass, es bligatri crregir el resultad cn la recuperación ó expresar ésta: residus veterinaris, mictxinas Utilizar las unidades y númer de cifras significativas adecuadas. En muestras realizadas pr duplicad, establecer criteri para la expresión del mism y su aceptación. Expresión de la Incertidumbre expandida (nivel de cnfianza del 95%) en ls cass que l requiera. La expresión de incertidumbre debe ser cherente cn la de ls resultads Infrmes de resultads Expresión incertidumbre INCERTIDUMBRE: Parámetr asciad al resultad de una medida, que caracteriza la dispersión de ls valres atribuids al mesurand EXPRESION DE UN RESULTADO ANALITICO Valr Sin evaluar U Evaluación U INFORME DE ENSAYO Cncentración Resultad= Valr ± incertidumbre Infrmes de resultads
28 Expresión incertidumbre Cn una incertidumbre expandida del 50%, un resultads será vilativ cuand X> 2 LMR Resultads cn incertidumbre del 50% (95%) Resultad vilativ mg/kg 1.0 mg/kg Resultad n vilativ 0.6 mg/kg LMR=0.4 mg/kg Infrmes de resultads Definición de residus Infrmes de resultads
29 Expresión resultads residus suma Infrmes de resultads
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