No. ISBN: Editorial Interna del Centro de Investigaciones en Óptica, León Guanajuato. Cuarta Edición. Año: 2007 pp 1-5.

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1 No. ISBN: Editorial Interna del Centro de Investigaciones en Óptica, León Guanajuato. Cuarta Edición. Año: 2007 pp 1-5. ANÁLISIS COMPARATIVO DE MÉTODOS MOLECULARES (PCR, RT-PCR EN TIEMPO REAL Y EL ENSAYO DE COBAS AMPLICOR CMV MONITOR), PARA LA DETECCION DE CMVH EN PACIENTES CON VIH-1+/SIDA González-Calixto, Cecilia 1, Ruiz-Tachiquín, Martha 2, Aguilera-Hernández Penélope 3, Espinoza-Rojo Monica 1. 1 Laboratorio de Toxicología y Biología Molecular, Unidad Académica Facultad de Ciencias Químico 2 Biológicas, Universidad Autónoma de Guerrero. Laboratorio de Biología Molecular, Unidad de Investigación Médica en enfermedades infecciosas y parasitarias, Hospital de Pediatría, CMN Siglo XXI. 3 Laboratorio de Patología Vascular, Instituto de Neurología y Neurocirugía. Correo electrónico: moniespinoza@yahoo.com RESUMEN El citomegalovirus humano (CMVH) es un patógeno oportunista, importante en individuos infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). La detección cuantitativa del gen de la polimerasa (gen temprano) por el COBAS AMPLICOR es hasta el momento el método validado y sensible para la realizar el diagnóstico, la detección de genes precoces como IE1 y la expresión de su mensajero, por RT-PCR en tiempo real ha sido realizada por varios autores con resultados favorables, sin embargo a pesar de la sensibilidad, la técnica de PCR en tiempo real no ha sido validada para el diagnóstico. En este estudio se pretende hacer una comparación de la sensibilidad de ambas técnica, y poder hacer un análisis comparativo de técnicas moleculares que detecten genes de expresión precoz (IE1) y temprana (DNA pol) para la detección de citomegalovirus en pacientes con VIH-1+. OBJETIVO. Analizar y comparar métodos moleculares (PCR y RT-PCR en tiempo real de IE1 y el ensayo de Cobas Amplicor CMV Monitor) para la detección de citomegalovirus humano en pacientes con VIH-1+/SIDA. METODOLOGIA. Se realizará un estudio transversal, en 150 muestras de pacientes con VIH-1+ captados en el laboratorio de Biología Molecular, Unidad de Investigación Médica en enfermedades infecciosas y parasitarias, Hospital de Pediatría, CMN Siglo XXI, a las cuales se les determinó y cuantificó la carga viral de VIH mediante la prueba de COBAS. De estas se seleccionaron 42 muestras que tuvieron mayor a 300,000 copias virales de VIH/ml de plasma, para posteriormente determinar la carga viral de CMVH por el ensayo de Cobas Amplicor CMV Monitor, PCR y RT-PCR en tiempo real. RESULTADOS. Se ha estandarizado la PCR convencional estándar para el gen IE1. A las 42 muestras seleccionadas se les determinó la carga viral de CMVH por el ensayo de Cobas Amplicor CMV Monitor, la PCR y RT-PCR en Tiempo Real está en proceso. DISCUSION. La evaluación de la cantidad de copias de CMVH en muestras de pacientes con VIH es importante dadas las características del virus, ya que como patógeno oportunista al producir una infección activa se desarrollan manifestaciones clínicas con consecuencias graves en los pacientes. La determinación de la carga viral mediante la detección del gen de la polimerasa del virus ha constituido un método altamente sensible para interpretar una infección activa, sin embargo la alta sensibilidad de la PCR en tiempo real ha tomado una gran importancia, sobre todo

2 cuando se realiza con genes precoces como IE1 lo que ha originado que varios autores realicen ensayos de detección del CMVH por esta técnica, por lo que es importante validar la sensibilidad de ambas técnicas. INTRODUCCIÓN El CMVH es un patógeno oportunista, importante en individuos infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Antes del tratamiento antiretroviral altamente activo, del 20 al 40% de las personas con SIDA desarrollan enfermedad por CMVH en órganos externos, incluyendo retinitis, esofagitis, colitis o encefalitis. Las personas coinfectadas con VIH y con un conteo de células CD4+ por debajo de 100/µl de plasma, están en gran riesgo de desarrollar enfermedad por CMVH. 1 El ciclo de replicación lítica del CMVH ocurre en el núcleo y se presenta en una cascada de eventos que se inicia cuando el virus se une a los receptores de la célula hospedadora y continúa con la expresión de varios tipos de genes: inmediatotempranos (precoces), tempranos y tardíos. Los genes precoces (IE-1 e IE-2) son el primer grupo de genes que se activa en una infección viral activa, los productos de estos genes, IE72 y IE86, respectivamente son requeridos para iniciar la replicación viral y para regular la expresión de los genes tempranos que codifican para las proteínas de replicación del DNA como la DNA polimerasa (UL54), estos a su vez regulan la expresión de genes tardíos, que codifican para las proteínas estructurales del virion como pp65 (UL83), glicoproteína B. 2 El CMVH es detectado por diversos métodos que difieren en cuanto a sensibilidad y especificidad. Entre los métodos para diagnosticar la infección se encuentran: serológicos, antigenemia, cultivos y métodos moleculares que incluyen PCR convencional, RT- PCR en Tiempo Real, Cobas Amplicor CMV Monitor, de los cuales estos dos últimos métodos son instrumentos muy sensibles en el análisis de secuencias de ADN y RNA. 3,4 El método de COBAS Amplicor hasta la fecha es el método más sensible y validado para la realización del diagnóstico de infección activa de CMVH, la PCR en tiempo real es un metodología altamente innovadora y con una gran sensibilidad para la detección de genes, varios han sido los autores que han realizado estudios donde detectan infección activa de CMVH por PCR en tiempo real, basándose en la expresión de genes precoces (IE1) y tardíos como (pp65) que hasta hace unos años la detección de éste último en su expresión proteíca constituía el estandar de oro. Dado que el método del Cobas Amplicor CMV Monitor detecta un gen de expresión temprana (DNA polimerasa), nosotros argumentamos que la técnica de PCR en tiempo real es más sensible, por lo que será necesario determinar el numero mínimo y máximo de copias virales detectadas, tanto para un gen precoz (IE1) y su mensajero y compararla con el número de copias virales detectables por el Cobas Amplicor CMV Monitor, y posteriormente hacer un análisis comparativo de las muestras en base a estas tres determinaciones moleculares y determinar la sensibilidad de cada gen (precoz y temprano ). Con todo lo anterior, el objetivo de este trabajo es analizar y comparar métodos moleculares (PCR y RT-PCR en tiempo real de IE1 y el ensayo de Cobas Amplicor CMV Monitor) para la detección de citomegalovirus humano en pacientes con VIH-1+/SIDA. METODOLOGÍA Este estudio se está realizando en el Laboratorio de Biología Molecular de la Unidad Académica Facultad de Ciencias Químico Biológicas perteneciente a la Universidad Autónoma de Guerrero, en 42 muestras de pacientes con VIH mayores a 20 años, colectadas en el laboratorio Biología Molecular de la Unidad de investigación Médica en enfermedades infecciosas y parasitarias, Hospital de Pediatría, CMN Siglo XXI. A las cuales se les realizó la prueba de Cobas Amplicor HIV Monitor para cuantificar la carga viral de VIH, todas las muestras presentaron mas de 300,000 copias virales de VIH/ml de plasma para posteriormente determinar la carga viral de CMVH por el ensayo de Cobas Amplicor CMV Monitor, PCR y RT- PCR en tiempo real. Con el ensayo de COBAS AMPLICOR CMV MONITOR se cuantificará el gen de la DNA polimerasa, amplificando un fragmento de 365 pb, los resultados son expresados en copias del DNA del CMVH/ml de plasma. La prueba puede cuantificar de 600 a 100,000 copias de ADN del CMVH/ml de plasma, con la PCR y RT- PCR en tiempo real se detectarán y cuantificarán el gen y mrna de IE. Para realizar esto se estandarizó la PCR estandar para la amplificación de fragmento del gen de IE1, la estandarización de la PCR de IE1 se realizó en el laboratorio de Biología Molecular de la UAG., la clonación (fragmento de 257 pb), la PCR y la RT-PCR en tiempo real se encuentra en proceso. Con la clonación se pretende hacer una curva estándar para determinar el número mínimo y máximo de copias virales detectables por PCR en tiempo real. Para poder analizar las 42 muestras de plasmas detectando el gen y su mensajero de 2

3 IE1 por tiempo real, se realizará extracción de DNA y RNA del plasma usando el kit QIA Ultrasens, las cuales se cuantificarán mediante el empleo de un biofotometro (BioPhotometer, Eppendorf), para determinar la concentración y pureza del DNA y del cdna. En los métodos antes descritos y en base a los resultados se determinará la sensibilidad y especificidad. RESULTADOS Se seleccionaron 42 muestras a partir de su carga viral a VIH, las cuales tienen más posibilidad de presentar infección por CMVH (Fig.1). Fig. 1. Número de copias de VIH en las 150 muestras recolectadas. Se determino la carga viral a las 42 muestras que presentaron una carga viral > 300, 000 copias de DNA de CMV/ml de plasma. De las cuales 4 fueron positivas a CMVH (Fig. 2). Num copias virales Num. copias en log 10 de DNA de CMV/ml de plasma Fig. 2. Número de copias (concentración log 10) de CMVH detectadas por COBAS AMPLICOR en las 42 muestras seleccionadas. Se estandarizó la PCR convencional para la amplificación del fragmento del gen de IE1, los primers utilizados fueron: 5 CACCATGTCCACTCGAA3 (sentido) y 5 CAAGTGACCGAGGATTGCAA3 (antisentido), usando 20 pmol del oligonucleótido sentido 5-3 y 20 pmol del oligonucleótido antisento 5-3, que amplificaron un fragmento de 257 pb. El volumen final de la mezcla de reacción fue de 25 µl, conteniendo 2.5 µl de buffer 10X, MgCl 2 [2.5 mm], dntps [2.5 mm], 0.40 U de la enzima platinum. Los productos fueron analizados por electroforesis en geles de agarosa al 1.5%, que fueron teñidos con bromuro de etidio al 0.5%; la visualización se efectuó bajo luz ultravioleta en un transluminador (3UV transilluminator) (Fig. 3). 3

4 Posteriormente se cortaron las bandas de IE1 y se procedió a hacer la purificación usando el kit QIAGEN, el producto purificado fue analizado por electroforesis en un geles de agarosa al 1.5 %, y fue teñido con bromuro de etidio al 0.5%; la visualización se efectuó bajo luz ultravioleta en un transluminador (3UV transilluminator) (Fig. 4). Esta en proceso la secuenciación, la clonación y el análisis por PCR y RT-PCR de ie1. DISCUSIÓN Fig. 4. Producto purificado de ie1, Carril 1: marcador de peso molecular de 123 pb; carril 2 y 3: pirificado de ie1. La evaluación de la cantidad de RNA del VIH presente en las muestras de plasma por el ensayo de COBAS (carga viral) es una herramienta importante en la aplicación clínica a los pacientes con SIDA, ya que se sabe que a mayor número de copias virales de VIH aparecen enfermedades oportunistas como las enfermedades por CMVH, por lo que es importante evaluar la cantidad de DNA del CMVH en plasma con métodos moleculares altamente sensible para identificar a los pacientes que presentan un mayor riesgo de desarrollar enfermedad por CMVH con un diagnostico oportuno así como la monitorización de los pacientes con tratamiento. En este estudio pretendemos buscar la cuantificación del DNA de CMVH por el método de PCR Tiempo Real versus COBAS AMPLICOR CMV MONITOR para comparar el número de copias virales detectables por ambos métodos en función de su sensibilidad y especificidad. Se han realizado varios estudios donde detectan la expresión de IE1 por PCR en tiempo real, cuando nosotros aplicamos las mismas condiciones para la amplificación del gen en una PCR convencional no logramos resultados favorables, por lo que tuvimos que realizar varias modificaciones que van desde la temperatura de alineamiento, la cantidad de DNA, la cantidad de enzima y la concentración de Cloruro de magnesio, hasta lograr tener una banda limpia y 4

5 poder hacer la cuantificación de DNA y RNA de CMVH por PCR en tiempo real, estamos en proceso de realizar la PCR en tiempo real. BIBLIOGRAFIA 1. Netterwald J., S. Yang, W. Wang, S. Ghanny, M. Cody, p. Seteropoulos, B. Tian, w. Dunn, f. Liu, and H. Zhu Two Gamma Interferon-Activated Site-Like Elements in the Human Cytomegalovirus Major Immediate-Early Promoter/Enhancer Are Important for Viral Replication. JVI Sainz Bruno Jr, H. L. LaMarca, R. F. Garry and C. A. Morris Synergistic inhibition of human cytomegalovirus replication by interferon-alfa/beta and interferon-gamma. BMC. Virology Journal 2: Amorin M. L, Cabeda J.M, Seca R, Mendes A. C, Castro A. P, and Amorim P CMV infection of liver transplant recipients: comparasion of antigenemia and molecular biology assays. BMC. Infectious Diseases 1:2. 4. Grzimek, N. et al Random, asynchronous, and asymetric transcriptional activity of enhancerflanking major immediate-early genes ie1/3 and ie2 during murine cytomegalovirus latency in the lungs. JVI