Universidad Nacional de San Martín Instituto de Investigaciones Biotecnológicas GENÉTICA MOLECULAR 2009

Transcripción

1 Universidad Nacional de San Martín Instituto de Investigaciones Biotecnológicas GENÉTICA MOLECULAR 2009 GUíA DE TRABAJOS PRÁCTICOS Docentes Dra. Paula ALVAREZ Lic. Lara AVILA Lic. Alejandro CASSOLA Dra. Alejandra D ANTUONO Dr. Javier DE GAUDENZI Lic. Georgina MORETTI Lic. Cintia SANCHEZ Lic. María Paula ZAPPIA CONDICIONES DE CURSADA Y APROBACIÓN DEL TP

2 El horario de los TP será los martes y viernes de 14:00 a 19:00 hs. Los TPs son de asistencia obligatoria. Durante el cuatrimestre los alumnos serán evaluados en: (1) Un seminario de bibliografía, (2) Un parcialito después de cada clase de seminarios, (3) Un parcialito antes de cada práctico y (4) Un informe final donde se explique el trabajo realizado y los resultados obtenidos con el fin de integrar todos los trabajos prácticos y demostrar comprensión de la estrategia global. El mismo deberá tener formato de manuscrito científico (Título, Resumen, Introducción, Métodos, Resultados y Discusión) y no deberá exceder de 10 páginas tamaño A4 escritas con letra Times New Roman 12 pts a simple espacio. (5) Un parcial práctico. Régimen de aprobación- Se deberá asistir como mínimo al 80% de las clases de seminarios y laboratorios. Dos asistencias computadas como TARDE equivalen a un AUSENTE. Se podrá faltar o desaprobar un máximo de 2 parcialitos de TP y dos parcialitos de seminarios. Se deberá aprobar el informe final con nota = 5. De ser desaprobado este informe podrá ser presentado por segunda vez. Se deberá aprobar un examen práctico con nota = 5. Este parcial puede ser recuperado. Composición de la nota- Nota final de TP = 10% Nota de Concepto* + 15% Nota de Seminario de bibliografía + 15% Nota del informe + 60% Nota de Parcial práctico. Los TP se aprobarán con una nota final = 5, mientras que para promocionar será necesaria una nota = 7. *Obtenida a partir del trabajo realizado por el alumno en el laboratorio, de la participación en los distintos seminarios de bibliografía y resolución de problemas durante la cursada del TP. Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

3 OBJETIVO GENERAL DEL TP Introducir al alumno en técnicas básicas de biología molecular las cuales se utilizarán para resolver un problema concreto. El objetivo central del TP será que el alumno enfrente problemas reales del laboratorio realizando diversos protocolos de manipulación y clonado de moléculas de ácido desoxiribonucleico (ADN). En particular se subclonará un gen de Aequorea victoria, que codifica para una proteína verde fluorescente, en un vector de expresión procariota para obtener la proteína recombinante con actividad biológica. La misma emite luz visible al ser excitada con luz ultravioleta (UV) debido a su estructura tridimensional particular. Para ello se partirá de un clon proveniente de una biblioteca genómica de fragmentos grandes del ADN de A. victoria sobre el cual se realizará UNA AMPLIFICACION POR PCR para obtener el gen completo de la proteína verde. Luego se realizará el subclonado del gen completo a un plásmido que permita su expresión inducible en la bacteria Escherichia coli. ADNg de A. victoria? Diseño de oligonucleótidos para PCR? Amplificación del gen gfp por PCR a partir de ADNg? Ligación en vector pbluescript del gen gfp (paso llevado a cabo por los docentes)? Subclonado del gen gfp en vector de expresión procariota (pgex)? Inducción de la expresión de la proteína GFP Purificación de la proteina recombinante? Inmunodetección de GFP por Western blot Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

4 TP #1 DISEÑO DE OLIGONUCLEÓTIDOS Uno de los parámetros más importantes para tener éxito en la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es el diseño de los oligonucleótidos cebadores (comúnmente denominados, oligos o primers ). Si éstos no están bien diseñados la PCR puede no proceder eficientemente; el resultado es la amplificación baja o nula del producto debido a amplificación no específica o a la formación de dímeros de primers que pueden competir con la amplificación del producto deseado. Qué factores debemos tener en cuenta a la hora de diseñar oligonucleótidos para PCR? 1. Tamaño del oligonucleótido 2. Temperatura de fusión o melting 3. Especificidad 4. Secuencias complementarias 5. Contenido en G/C y tractos de polipirimidinas (T, C) o polipurinas (A, G) 6. Secuencia 3 terminal 7. Secuencia 5 terminal y regiones centrales 1. Tamaño del oligonucleótido. El tamaño del oligonucleótido influye en la especificidad, en la temperatura de fusión y en el tiempo necesario para la hibridación del oligonucleótido a su secuencia complementaria, y por lo tanto es decisivo para que ocurra la reacción. Los oligonucleótidos de 18 a 24 bases son muy específicos de secuencia, siempre que la temperatura de hibridación sea óptima. El tamaño del oligonucleótido es proporcional a la eficiencia de hibridación. En general, cuanto más largo sea el oligonucleótido más ineficiente será la hibridación. Si en cada paso de PCR hay pocas secuencias de ADN molde con su oligonucleótido hibridado, el resultado va a ser muy poco producto amplificado. Los oligos no deberían ser demasiado cortos a menos que se especifique lo contrario en el protocolo. La meta es diseñar un oligonucleótido con una temperatura de hibridación (la que programamos en el termociclador) de al menos 50 C. La relación entre temperatura de hibridación y temperatura de fusión es muy importante en la PCR. Como regla general la temperatura de hibridación (o annealing en inglés) Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

5 debe ser 5-8 C más baja que la de fusión (o melting en inglés). Por tanto, si queremos un oligonucleótido con una temperatura de hibridación de al menos 50 C, correspondería a un oligonucleótido con una temperatura de fusión de ~55-58 C. A menudo, la temperatura de hibridación así determinada no resulta óptima y es necesario determinarla empíricamente. Se puede hacer fácilmente con un termociclador con gradiente (por ej. el Mastercycler gradient de Eppendorf). 2. Temperatura de fusión. La temperatura de fusión (Tm) de un oligo depende de varios factores: longitud, secuencia, contenido G+C, y el tipo y concentración de los cationes presentes en la reacción, particularmente el ión Na+. Pueden emplearse diversas fórmulas para estimar este valor, una buena aproximación surge de utilizar la regla de Wallace (generalmente válida para oligos en el rango de bases) donde la Tm se puede calcular con la siguiente fórmula: Tm = 2 * (A+T) + 4 * (C+G) (1) En la siguiente tabla hay valores de Tm de oligonucleótidos de varios tamaños usando la fórmula de Wallace asumiendo un contenido en G/C del 50%. Tamaño Tm = 2 (A+T) + 4(G+C) Tamaño del Tm = 2 (A+T) + 4(G+C) del Oligonucleótido Oligonucleótido 4 12 C C 6 18 C C 8 24 C C C C C C C C C C C C C C Notar que las temperaturas calculadas usando esta regla son inexactas en los valores extremos. Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

6 En la materia emplearemos la fórmula de Wallace para calcular el Tm de los primers. Sin embargo, para oligos que varián entre 20 y 100 bases también puede aplicarse la siguiente fórmula: Tm = *[%(C+G)] - 395/longitud (2) Una tercera ecuación incluye factores como concentración de formamida (F) y de cationes monovalentes (M): Tm = log M (%(C+G)) - 500/longitud - 0.6*F (3) y es recomendable para oligos mayores de 50 bases en un rango de ph de 5 a 9. Es importante tener en cuenta que en una reacción de PCR hay dos oligonucleótidos y que ambos deben diseñarse de manera que tengan temperaturas de fusión similares. Si los oligonucleótidos no tienen Tm parecidas, la amplificación será menos eficiente o incluso puede no funcionar ya que el oligonucleótido con la Tm más alta hibridará mal o inespecíficamente a bajas temperaturas mientras que el oligonucleótido con la Tm más baja puede no hibridar a temperaturas más altas. Además hay que cuidar que la Tm del producto sea lo suficientemente baja para asegurar que esté totalmente desnaturalizado a C. Este parámetro ayudará a asegurar una PCR más eficiente, pero no siempre es necesario para amplificar por PCR. En general, productos entre pares de bases se amplifican eficientemente en muchas reacciones de PCR. En caso de duda, la Tm del producto también puede calcularse empleando la fórmula 3 indicada anteriormente. 3. Especificidad. La especificidad del oligonucleótido depende parcialmente del tamaño del oligonucleótido. Es evidente que hay más combinaciones de oligos de 24 bases que de 15 bases. Con todo, debemos elegir oligonucleótidos que tengan una secuencia única en el molde de ADN que queremos amplificar. Por ejemplo: un oligonucleótido diseñado con una secuencia altamente repetitiva resultará en un manchado cuando amplifiquemos ADN genómico; sin embargo, el mismo oligonucleótido puede dar una sola banda si amplificamos un clon de una genoteca de ADN. Como la enzima Taq Polimerasa es activa en un amplio rango de temperaturas, puede extender el oligonucleótido a temperaturas bajas de hibridación. Si la temperatura es demasiado baja, puede suceder una hibridación no específica que será extendida por la Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

7 polimerasa con que haya una pequeña similitud en el extemo 3 del oligonucleótido. En general, una temperatura de fusión de C es la más adecuada (Notar que corresponde a un tamaño de oligonucleótido de bases según la regla de Wallace). 4. Complementariedad en la secuencia de los oligonucleótidos. Es conveniente que los oligonucleótidos no tengan secuencias complementarias en más de 4-6 pares de bases dado que se pueden formar estructuras intracatenarias de doble cadena que interferirán con la hibridación al ADN molde. Otro problema es la complementariedad entre los dos oligonucleótidos. Similitud parcial en las regiones medias de dos oligonucleótidos puede interferir con la hibridación. Si el apareamiento ocurriese en el extremo 3' de cada oligonucleótido, se dará la formación de dímeros de oligonucleótido que impedirán la formación del producto por competición. 5. Contenido en G/C y extensiones de polipirimidinas (T, C) o polipurinas (A, G). La composición de bases de los oligonucleótidos debería ser del 45% al 55% en GC. La secuencia del oligonucleótido debería elegirse de manera que no contenga zonas de poli(g) o poli(c) que puedan llevar a hibridación no específica. Hay que evitar también las zonas ricas en poli(a) y poli(t) ya que es por donde puede desestabilizarse el complejo molde oligonucleótido lo que llevaría a una menor eficiencia de amplificación. También hay que evitar secuencias ricas en polipirimidinas (T, C) y polipurinas (A, G). Idealmente el oligonucleótido deberá tener una mezcla casi a alzar de nucleótidos, un contenido en GC del 50% y ~22 bases (en este caso la Tm estará en el rango de C). 6. Secuencia 3 -terminal. Se sabe que la posición 3' terminal de los oligonucleótidos de PCR es esencial para controlar el apareamiento incorrecto. Ya hemos visto el problema de la complementariedad del oligonucleótido en esas regiones. Otra variable que hay que considerar es que haya algún residuo de G ó C en el extremo 3' del oligonucleótido. Este cepo de GC (en inglés CG Clamp ) ayuda a asegurar que el extremo 3 hibride correctamente debido a los enlaces de hidrógeno que se dan entre los residuos de GC. También ayuda a mejorar la eficiencia de la reacción de PCR minimizando cualquier desestabilización que pudiese ocurrir. Por lo general, esta condición se puede cumplir incluyendo como mucho dos residuos G ó C en la últimas cinco bases del extremo 3 terminal. Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

8 7. Secuencia 5 -terminal y regiones centrales. Es conveniente incluir en esas zonas secuencias ricas en residuos GC para dar mayor estabilidad a la hibridación del oligonucleótido con su secuencia blanco. A modo de resumen, los primers deben cumplir los siguientes criterios: Criterios positivos para el diseño de primers Temperatura de melting (Tm) Tm FORWARD = Tm REVERSE Tm = 60-66ºC T hibridación = Tm 5 C Tamaño del primer nt, óptimo 18 a 24 nt Contenido en G+C Ideal del 45% al 55% Contenido GC en 3 Termina en T; G ó C en dos (máx.) de cinco últimas bases Contenido GC en 5 Incluir varias G ó C en las últimas bases Apareamiento de primers Únicos Criterios negativos para el diseño de primers Evitar apareamientos incorrectos Evitar interacción primer-primer (Tm) Evitar estructuras en horquilla EJERCICIO 1. Realice una búsqueda en bases de datos para conseguir la secuencia completa del gen que se quiere aislar. Para ello realice una búsqueda por similitud de secuencia empleando el programa BLAST ( y el fragmento del gen proporcionado en el Apéndice. Indique descripción del gen, organismo y número de acceso del primer hit obtenido. Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

9 2. Identifique los nucleótidos correspondientes a los codones de inicio y fin de la traducción y diseñe oligonucleótidos para amplificar dicha región codificante. Oligo Reverse (de 5 a 3 )... Oligo Forward (de 5 a 3 ) Calcular la Tm de los primers por la fórmula de Wallace. Oligo Reverse:.. C. Oligo Forward:.. C. 4. Busque herramientas bioinformáticas disponibles online (o consulte a los docentes) y compruebe los siguientes parámetros de los primers que acaba de diseñar: a) Cálculo de Tm, contenido en GC, tamaño y peso molecular de los oligos. b) Estructuras secundarias, hibridaciones entre los dos primers, repeticiones o palíndromos. 5. Por último, se quiere clonar el gen gfp en el sitio múltiple de clonado de un vector de expresión (BamHI, SmaI, EcoRI) para poder expresar la proteína. Diseña (o modifica) unos primers para que contengan secuencias de enzimas de restricción. En que extremo de la molécula las adicionarías? Calcular el Tm de los primers. Oligo Reverse 5... Oligo Forward 5... Cómo son los oligos Forward y Reverse en relación a la secuencia blanco que se quiere amplificar? Uno de ellos es complementario y el otro es idéntico en secuencia. Diga cuál es cuál. Bibliografía El contenido teórico de este TP fue extraído de Ingeniería Genética. Curso Universidad de Málaga, Área de Genética, Facultad de Ciencias, Licenciatura en Ciencias Biológicas. Profesora: Ana Grande Pérez. Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

10 TP #2 REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) DIA 1 A) Reacción de PCR 1. Colocar en un tubo Eppendorf una mezcla de reacción considerando volúmenes suficientes para. tubos de PCR. Discutir que controles se deben incluir en este u otro ensayo y que dato puede aportar. Concentración final x 1 rxn x rxns Templado 0; 1; 2,5; 5; 10; 20 ng Buffer Taq Polimerasa 10X 1X MgCl2 (50 mm) 0; 0,5; 1; 2; 5 mm dntp (10mM c/u) 0, 50,100, 250, 500 µm Primer I (100 ng/µl) 0; 0,1; 0,5; 1; 10 ng/?l Primer II (100 ng/µl) 0; 0,1; 0,5; 1; 10 ng/?l Enzima Taq Polimerasa (5U/?l) 0; 0,05; 0,5; 1; 2 U/rxn H2O csp 25?l? Enzima. Taq ADN polimerasa, aislada de Thermus aquaticus. Por qué se utiliza este organismo como fuente de una ADN polimerasa? Buscar la definición de unidad.? Buffer: 200 mm Tris-HCl (ph 8,4), KCl 500 mm.? MgCl2. Concentración final: entre 1 y 5 mm. En que fenómeno de la reacción está actuando este ion? En qué afectan los extremos de este rango?? dntps (datp, dctp, dgtp, dttp). Concentración final 100 µm. Discutir en que fenómeno de la reacción está actuando? Oligonucleótidos: Se utilizarán los oligonucleótidos específicos GFPs y GFPa (ver apéndice) separados por 200 pb. Llevar a concentración final: 1 ng/µl. Discutir diseño y especificidad. Cálculo de Tm para cada uno de los oligos de acuerdo a la secuencia nucleotídica de los mismos y al Tm que usted utilizaría para la PCR.? Templado: ADNg de A. victoria. Tiene alguna importancia la topología del ADN molde en el rendimiento de la reacción? 2 Completar y llevar a cabo la reacción de PCR bajo el siguiente protocolo: a) 1 ciclo 94 C 3 min (desnaturalización) b) 35 ciclos. C 30 seg (desnaturalización). C 30 seg (apareamiento). C. seg (elongación) c) 1 ciclo. C 10 min (elongación final) Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

11 En que se basa para elegir las temperaturas y tiempos de desnaturalización, annealing de los primers y polimerización? DIA 2 B) Análisis de los productos obtenidos en geles de agarosa 1 Colocar la solución de agarosa (aproximadamente 50 ml/gel) por 1 minuto en microondas. Esta solución contiene: Agarosa 1-2% TBE 0,5 X 2 Cuando la solución se encuentre fundida y homogénea dejarla enfriar hasta que se pueda tocar con la mano y agregar Bromuro de etidio 0,5 µg/ml. El Bromuro de Etidio es un potente mutágeno, manejar todas las soluciones que lo contengan con guantes! 3 Volcar la solución de agarosa en la cuba, que debe tener colocados el peine y los separadores. Evitar la formación de burbujas. Esperar hasta que gelifique completamente antes de usar 4 Agregar TBE 0,5 X hasta cubrir el gel y retirar cuidadosamente el peine y los espaciadores. Preparación de las muestras y siembra del gel 1 Mezclar la solución de ADN con el buffer de siembra (que se encuentra preparado 6 veces por encima de su concentración de uso; esto es, 6X en la jerga) 2 Cargar la pipeta con la muestra. Apoyar con delicadeza en uno de los bordes del pocillo (calle, en la jerga). Descargar lentamente la pipeta hasta el primer tope. No llevar al segundo tope aunque no haya descargado por completo para evitar la formación de burbujas. 3 Conectar la fuente teniendo cuidado de que el polo positivo este en el lado opuesto al sitio de siembra. Correr a voltaje constante (se usan unos 5 Volt/cm, midiendo la distancia entre los polos de la cuba) hasta lograr una buena resolución de fragmentos. 4 Apagar la fuente. Colocar el gel sobre un transiluminador de luz UV. Observar manteniendo en todo momento los ojos protegidos de la radiación UV! Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

12 Soluciones utilizadas TBE 1X Tris Base 135 mm Ac. Bórico 45 mm EDTA 2,5 mm Buffer de siembre 6X: Orange G o Azul de bromofenol 0,25% Glicerol 30% Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

13 TP #3 CLONADO y SUBCLONADO Cada grupo recibirá un plásmido recombinante que porta el gen gfp completo de A. victoria. A partir de este plásmido, y mediante una restricción del mismo, se purificará el fragmento correspondiente al inserto gfp (714 pb) y se lo ligará al vector pgex (GE Healthcare Life Sciences). Los productos de ligación serán introducidos por transformación en bacterias E. coli DH5a competentes. Las colonias portadoras del plásmido recombinante serán identificadas por digestión. El vector de expresión de la línea pgex, permite obtener una proteína de fusión a Glutatión-S-transferasa (GST). Utilizando los mapas de ambos vectores y del inserto (ver apéndice) se determinarán los sitios de restricción a utilizar. NOTA. Los manuales de laboratorio recomiendan la utilización de 1 U de enzima de restricción por µg de ADN a digerir. En la práctica, debido a las concentraciones en que vienen las enzimas y a que las enzimas no se pueden guardar diluídas, se suele utilizar un exceso de las mismas (5-10 U/µg). Realizar las reacciones de acuerdo a los protocolos elaborados en la clase. DIA 1 A) Digestión con enzimas de restricción 1) Colocar en un tubo Eppendorf: DNA (1 µg/µl) µl Buffer de reacción µl Enzima 1 (10 UE/µl) µl Enzima 2 (10 UE/µl) µl H20 csp µl 2) Incubar a 37 C por 2 horas. Transcurrido este tiempo, guardar los tubos a -20 C hasta el próximo TP. DIA 2 A) Desfosforilación del ADN Las fosfatasas alcalinas catalizan la eliminación de un grupo fosfato 5 de una cadena de Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

14 ADN. Es conveniente desfosforilar un vector que ha sido digerido con una enzima de restricción con la finalidad de evitar la religación del mismo. Esto impediría la ligación del fragmento de ADN que se quiere ligar. En este caso el ADN doble cadena del inserto aporta dos grupos fosfatos 5 para participar en dos de los cuatro enlaces que serían necesarios para formar 1hebra de ADN doble cadena recombinante circular cerrado. Procedimiento Agregar al mismo tubo donde se hizo la reacción de digestión del plásmido pgex, 1U de CIP (Calf Intestinal Phosphatase) por pmol de terminales de ADN. El alumno deberá calcular la cantidad de enzima necesaria y las condiciones exactas de reacción de acuerdo a los manuales de laboratorio. B) Electroforesis preparativa - Purificación de fragm. de ADN utilizando QIAEX II 1 Sembrar en un gel de agarosa la reacción de digestión del plásmido pgem-t-gfp, así como el vector pgex desfosforilado 2 Correr hasta obtener una buena resolución de los fragmentos 3 Terminar la electroforesis y poner el gel sobre un transiluminador UV. Comprobar que la digestión fue total. Qué espera obtener para cada caso? Protegerse los ojos de la radiación UV! Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

15 4 Cortar la porción de gel correspondiente al fragmento de ADN deseado usando un escalpelo (cuidado de no rayar el transiluminador), colocarla dentro de un tubo eppendorf de 1,5 ml y pesarla 5 Purificar utilizando el kit comercial QIAEX II Procedimiento QIAEX II 1 Agregar 3 volúmenes de una solución NaI 6M (buffer QX1) e incubar durante 5 min a 52ºC para derretir la agarosa 2 Controlar el ph de la solución mediante el indicador coloreado de la solución QX1. Debe permanecer amarillo (ácido), en caso de virar al rojo, reajustar el ph agregando 10µl AcONa 3M ph Agregar 10 µl de resina Qiaex II, resuspender bien con vórtex e incubar por 10 min a 52ºC agitando ocasionalmente 4 Centrifugar durante 1 min a rpm 5 Descartar el sobrenadante y resupender el pellet en 500 µl de solución de lavado (buffer PE). Para el caso del inserto, proveniente de gel, repetir el lavado con QX1, previo al lavado con PE 6 Repetir el lavado 2 veces 7 Extraer la solución del último lavado y dejar secar 5 min en un bloque a 37ºC. 8 Resuspender el pellet en 15 µl de agua, vortexear e incubar 10 min a 50ºC agitando ocasionalmente. 9 Centrifugar durante 1 min a rpm y guardar el sobrenadante. 10 Cuantificar el rendimiento en gel de agarosa con Bromuro de etidio. Alternativa. Purificación de fragmentos de ADN por precipitación con etanol 1 Realizar una extracción con cloroformo y centrifugar (conservar la fase acuosa). 2 Agregar 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3M ph 5,2 y luego 3 volúmenes de etanol 100% frío. 3 Incubar a -20 C 30 min. 4 Centrifugar durante 30min en microcentrífuga a rpm. 5 Secar el pellet y resuspender en buffer TE. En qué propiedades se basa cada método para la separación? C) Ligación de fragmentos de ADN El fragmento purificado por cada grupo se ligará al vector pgex en diferentes relaciones molares. Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

16 Se incluirán dos controles de background, uno de vector solo sin ligasa (para conocer la cantidad de vector no cortado por ninguna enzima) y otro de vector solo con ligasa (para conocer la cantidad de vector capaz de recircularizarse sin inserción, es decir cortado con sólo una de las dos enzimas utilizadas). Podría realizar un control adicional? Los componentes de la mezcla de ligación son:? Inserto y Vector (usar de ng) Recuerde que: ng Inserto = ng Vector x kb Inserto x relación molar Inserto:Vector kb Vector? Buffer T4 ADN ligasa 10X: 50 Mm Tris ph7.5, 10 Mm Cl2Mg, 10 Mm DTT, 1 Mm ATP, 25 µg/ml BSA? T4 ADN ligasa: se usan 20 a 40U/por reacción de ligación (1 µl de una dilucion 1/10)? Agua: csp 10 µl 1) Rotular tubos eppendorf como A, B, C, D, E y F y agregarles (las cantidades están en µl): Componentes A B C D E F Inserto (0,7kb X ng/µl) - - Vector (5,6kb 20 ng/µl) - Buffer 10X T4 ligasa (40U/µl) H2Odd csp 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl Nota. Si los volumenes de inserto a agregar lo permiten, se sugiere realizar la reacción de ligación utilizando 50 ng de vector en vez de 20 ng y ajustar las cantidades de inserto acorde a esta modificación. Discutir esta opción con los docentes. 2) Incubar a temperatura ambiente durante 4 horas. Alternativamente puede dejarse toda la noche a 16 C. 3) Guardar a -20 C hasta el momento de la transformación bacteriana. Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

17 TP #4 TRANSFORMACIÓN BACTERIANA A) Transformación baceriana 1 Descongelar las bacterias y dejarlas inmediatamente en hielo 10 min. Cada tubo contiene 200 µl de bacterias E. coli competentes por el método de Cl 2 Ca. 2 Agregar 10 µl de la reacción de ligación. 3 Incubar en hielo 30 min. 4 Incubar segundos a 42 C y luego reposar 2 minutos en hielo (shock térmico). 5 Inocular tubos conteniendo 1 ml de LB y agitar 1 hora a 37 C (recuperación). 6 Sembrar 200 µl en placas de petri con LB agar conteniendo ampicilina 100 µg/ml final. B) Preparación de placas de LB agar 1 Se derrite una solución de LB agar en el microondas y se deja enfriar hasta que pueda ser tocada con la mano (aprox. 50ºC). 2 Agregar ampicilina 100 µg/ml concentración final. 3 Alicuotar en esterilidad (aproximadamente 15 ml/placa) y dejar solidificar. 4 Incubar a 37ºC en forma invertida para secarlas. Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

18 TP #5 PURIFICACION DE ADN PLASMIDICO. SCREENING A) Purificación de ADN plasmídico por el método de lisis alcalina 1 Inocular las colonias aisladas de las transformaciones en 4 ml de medio LB con ampicilina (100µg/ml), dejar crecer ON a 37 C con agitación 2 Centrifugar el cultivo bacteriano (3 ml total) durante 2 minutos a 6000 rpm a temperatura ambiente en microcentrífuga 3 Descartar el sobrenadante por inversión 4 Resuspender completamente el pellet bacteriano en 200 µl de buffer P1 5 Agregar 200 µl de buffer P2. Mezclar suavemente por inversión del tubo (4-6 veces). Incubar a temperatura ambiente 5 minutos exactos! 6 Agregar 200 µl de buffer P3 frío. Mezclar inmediatamente y muy suavemente. Incubar en hielo 10 minutos. 7 Centrifugar 15 minutos a rpm. 8 Transferir el sobrenadante a otro tubo eppendorf y mezclar con 0.7 volúmenes de isopropanol. Agitar por inversión 4-5 veces y centrifugar inmediatamente a rpm durante 30 minutos 9 Descartar el sobrenadante cuidadosamente 10 Lavar el ADN con 200 µl de etanol 70 % (no agitar ni resuspender) 11 Centrifugar 5 minutos a rpm 12 Descartar el sobrenadante cuidadosamente 13 Secar el pellet durante 5 minutos a 37ºC y resuspender en 30 µl de H2O o Tris/HCl 10mM ph 7 14 Cuantificar en gel de agarosa el rendimiento de la purificación por comparación de la intensidad de fluorescencia con cantidades conocidas de ADN del fago?. Buffer P1 (buffer de resuspensión) RNasa A 100 µg/ml Tris/HCl ph 8 50 mm EDTA ph mm Buffer P2 (buffer de lisis) NaOH 200 mm SDS 1 % Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

19 Buffer P3 (buffer de neutralización) AcK ph M B) Identificación de clones positivos por restricción 1) Colocar en un tubo Eppendorf: DNA (1 µg/µl) µl Buffer de reacción µl Enzima 1 (10 UE/µl) µl Enzima 2 (10 UE/µl) µl H20 csp µl 2) Incubar a 37 C por 2 horas; 3) Analizar en gel de agarosa. Qué otras metodologías podría emplear para determinar los clones que contienen el inserto de intrés? Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

20 TP #6 PROTEINAS RECOMBINANTES DIA 1 A) Inducción de la expresión proteica 1 Tomar 0,3 ml del cultivo crecido O.N. (pgex-gfp) e inocular 3 ml de medio Terrific Broth. Realizar la operación por duplicado (uno será el control sin inducir) 2 Incubar 1 h a 37ºC con agitación 3 Inducir uno de los cultivos por agregado de IPTG a una concentración final de 0.2 mm, e incubar 2 h a 37ºC con agitación 4 Cosechar 3 ml de cada cultivo, centrifugando 1,5 ml por 5 min a 5000 rpm. Descartar el sobrenadante por volcado y volver a cosechar 1,5 ml en el mismo tubo. Descartar el sobrenadante. 5 Observar al UV y comparar los pellets de cultivos inducidos y no inducidos. Guardar los pellets congelados a 70ºC hasta el próximo TP. DIA 2 A) Purificación de proteinas recombinantes fusionadas a GST 1 Resuspender los pellets congelados en 500 µl de TBS conteniendo inhibidores de proteasas (PMSF1mM y EDTA 3mM) 2 Sonicar las muestras 3 pulsos de 20 segundos con intervalos de otros 20 segundos en hielo 3 Agregar a cada muestra Triton X-100 1% final e incubar en hielo por 10 minutos 4 Centrifugar 10 minutos a rpm 5 Tomar el sobrenadante e incubarlo con la resina (glutation agarosa) previamente hidratada en TBS durante 1 hora a temperatura ambiente 6 Centrifugar 1 min a 3000 rpm, sacar sobrenadante y guardarlo en tubo nuevo en hielo. 7 Realizar 3 lavados con 500 µl TBS-Triton X100 1%. Se centrifuga 1 min a 3000 rpm entre lavados. Descartar los lavados. 8 Realizar la elución en dos pasos: 8.1 Incubar la resina en presencia de Trombina (1 Unidad), durante 1 hora con agitación, en un volumen final de 100 µl de TBS-CaCl 2 3 mm. Esta es una proteasa que corta específicamente en la secuencia de reconocimiento presente en la proteína de fusión (Donde cree usted que está ubicada la secuencia de corte para la Trombina en la proteína Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

21 de fusión? Para que cree usted que se incluye un sitio de corte para una proteasa como parte de esta proteína de fusión?). Luego guardar el sobrenadante en hielo (4ºC). 8.2 Lavar la resina con 1 ml de con TBS-Triton X100 1% 8.3 Incubar la resina con 100 µl de glutation reducido 15 mm por 10 minutos en agitación y guardar el sobrenadante 9 Congelar los tubos hasta el próximo TP. DIA 3 A) Electroforesis en condiciones desnaturalizantes A.1) Preparación de la muestra para geles desnaturalizantes (SDS-PAGE ) 1 Mezclar 14 µl de cada muestra con DTT (0.1M final) y Cracking buffer 5X (1X final) e incubarlo por 3 minutos a 100 ºC 2 Centrifugar 2 min a rpm 3 Sembrar las muestras en geles 10% acrilamida-bisacrilamida 29:1 de acuerdo a la indicación del docente. A.2) Preparación geles desnaturalizantes y electroforesis Gel Separador 10% (10ml gel) Acri: Bis (29:1) 3.33 ml Agua 2.76 ml SDS 10% 0.1 ml Tris-HCl 1M ph ml APS 10% 100 µl Temed 10 µl Gel Stacking 5% (5 ml gel) Acri: Bis (29:1) 0.83 ml Agua 3.45 ml SDS 10% 0.05 ml Tris-HCl 1M ph ml APS 10% 50 µl Temed 5 µl Running Buffer 5X (1litro) Glicina 72g Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

22 Tris SDS 15g 5g A.3) Coloración Una vez corrido el gel, se lo separa de los vidrios cuidadosamente (utilize guantes!). Colorear el gel con Coomasie Blue R-250 (0.2% Coomasie, 50% Metanol y 10% Acético) durante 1 hora. Decolorar realizando varios cambios de solución fijadora (20% Metanol, 10% ácido acético, 70% agua) B) Electroforesis en condiciones nativas B.1) Preparación de la muestra para geles nativos 1 Mezclar 14 µl de cada muestra con Cracking buffer nativo hasta 1X final 2 Sembrar los geles PAGE nativos 8% y correrlos a 120V constantes. B.2) Preparación geles nativos Gel Separador 8% (10ml gel) Acri: Bis (29:1) 2.5 ml Agua 3.6 ml Tris-HCl 1M ph APS 10% 100 µl Temed 10 µl Gel Stacking 5% (5 ml gel) Acri: Bis (29:1) 0.83 ml Agua 3.45 ml Tris-HCl 1M ph ml APS 10% 50 µl Temed 5 µl B.3) Visualización de GFP en geles nativos Una vez corridos los geles, se los separa de los vidrios cuidadosamente utilizando guantes. Los geles nativos se irradian con luz UV onda corta (~245nm) con el objetivo de identificar la proteína de fusión con GFP producida y purificada. Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

23 TP #7 TRANSFERENCIA Y WESTERN BLOT A) Transferencia Materiales - dos casetes de transferencia (son parte del set de transferencia); - cuatro papeles Whatman (3MM o similar); - filtro de nitrocelulosa o nylon, cortados del tamaño del gel a transferir (levemente más grandes). Precauciones I? Todo el material a utilizar debe equilibrarse en el buffer de transferencia. En el caso de la membrana primero se humedece en agua destilada y recién después se equilibra en el buffer de transferencia;? El sandwich de transferencia debe armarse siempre sumergido en el buffer para evitar burbujas de aire;? UTILIZAR EN TODO MOMENTO GUANTES (el contacto con la piel puede engrasar la membrana y/o el gel de poliacrilamida y evitar la transferencia). Una vez embebido el material en el buffer de transferencia colocar por orden: 1. Tapa plástica negra (se ubicará en el electrodo negativo) 2. dos unidades de papel Whatman 3. gel de electroforesis (pasarlo con cuidado) 4. membrana de nitrocelulosa o nylon 5. dos unidades de papel Whatman 6. cerrar con la tapa plástica blanca (será el positivo) Precauciones II Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

24 Cuidar que no queden burbujas de aire en ningún lugar del sandwich, pues no pasará corriente eléctrica en ese punto. RECOMENDACION: entre el paso 5 y 6 anteriores (es decir, antes de cerrar la segunda tapa de plástico) ayudarse con una varilla de vidrio o pipeta para sacar todas las burbujas que pudieran haber quedado. Condiciones de transferencia? 200 ma en 1 hs (corriente limitante), ó 30 ma O.N. Hecha la transferencia, desarmar el dispositivo y secar la membrana sobre un papel de filtro (este filtro se puede guardar o pasar directamente a su procesado). NOTA: En este punto se pueden teñir las membranas de nitro o nylon para ver todas las proteínas que se han transferido, con el colorante rojo Ponceau en TBS. B) Inmunodetección Todo el procesamiento se lleva a cabo a temperatura ambiente. a) Bloquear un mínimo de 30 min. en TBS - 5% leche descremada - 0,3% Tween; b) Incubar con el anticuerpo primario diluido en TBS - 2% leche descremada - 0,3% Tween por el lapso de una hora (la dilución a usar depende de la calidad y título del anticuerpo; se definirá en el momento de hacerlo) (todo a temperatura ambiente). c) Lavar TBS 10min TBS + Tween 0,3% 10min TBS 10min; d) Incubar con el anticuerpo secundario (anti-ig de conejo conjugado con fosfatasa alcalina) diluido 1:2000 en TBS - 2% leche descremada - 0,3% Tween, una hora. e) idem punto c) Revelado a) Pasar el filtro a recipiente con 10 ml de solución de DAB (di-amino benzidina). b) Detener la reacción cambiando el filtro a un recipiente con abundante agua. Soluciones Buffer de transferencia : Tris-base 9.09 g Glicina 43.2 g Metanol 600 ml llevar a 3 litros con agua deionizada Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

25 TBS (Tris buffered saline): Tris.HCl ph mM NaCl 150mM Solución de revelado (DAB): 6mg en 10ml de PBS + 10?l de peróxido de hidrógeno. Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

26 APÉNDICE I. SECUENCIA Query Y OLIGONUCLEÓTIDOS EMPLEADOS >partial_cds aacatacggaaaacttacccttaaatttatttgcactactgggaagctacctgttccatgg ccaacacttgtcactactttctcttatggtgtacaatgcttctcaagatacccagatcata tgaaacagcatgactttctcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaaagaactat attttacaaagatgacgggaactacaagacacgtgctgaagtcaagtttgagggtgatacc cttgttaatagaatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaacattcttggac acaaaatggaatacaactataactcacataatgtatacatcatgggagacaaaccaaagaa tggcatcaaagttaacttcaaaattagacacaacattaaagatggaagcgttcaattagca Las secuencias de los oligonucleótidos utilizados son (de 5 a 3 ): GFPs / GGGATGAGTAAAGGAGAAGAACTT GFPa / CATATGACTGGGTATCTCGC II. VECTORES Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos

27 Gen. Mol. y Biol. Mol. del Desarrollo - Guía de trabajos prácticos