Bioq. Jorge A. Basiletti
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- Salvador Torres Vera
- hace 7 años
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1 VIRUS PAPILOMA HUMANO (HPV): Etiopatogenia Diagnóstico molecular y utilidad clínica de la tipificación viral Vigilancia Vacunas Bioq. Jorge A. Basiletti Servicio Virus Oncogénicos Laboratorio Nacional de Referencia de Papilomavirus Laboratorio Regional de Referencia de Papilomavirus- OPS/OMS Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas- ANLIS "Dr. Malbrán"
2 Virus papiloma humano (HPV) Familia Papilomaviridae Tropismo epitelial: infecta piel y mucosas 100 nm Cápside proteica, sin envoltura Genoma: ADN circular Genoma: ADN circular (8.000 pb) (Adaptado de Burd EM. Clin Microbiol Rev 2003; 16:1 17. )
3 VIRUS PAPILOMA HUMANO (HPV) Familia Papillomaviridae Cápside proteica, sin envoltura Genoma: ADN circular Partículas virales Organización genómica (Microfotografía Instituto Malbrán)
4 Ciclo de vida del HPV en el cérvix Canal cervical Capa escamosa madura Capa escamosa Las partículas del virus se ensamblan y el virus se libera. INFECCION PRODUCTIVA El virus utiliza células del hospedador para replicar el ADN viral y expresar las proteínas codificadas Células parabasales Células basales Membrana basal Epitelio Normal Epitelio Infectado El VPH infecta la capa basal epitelio cervical. (Adaptado de Frazer IH. Nat Rev Inmunol 2004; 4:46 54)
5 CICLO DE LA INFECCIÓN POR HPV EN EL EPITELIO. POTENCIAL ONCOGÉNICO VIRAL. A B Formación de la verruga o condiloma Virus epiteliotropo: infecta piel y mucosa
6 Cuello uterino: la unión escamo-columnar El punto donde se unen las células escamosas y las células columnares se denomina la unión escamo-columnar ' Endocervix Trompas de Falopio Matriz Útero Ovario Cuello uterino La zona de transformación Ectocervix Unión escamo-columnar Epitelio escamoso Epitelio columnar Unión escamo-columnar Unión escamo-columnar: blanco preferido del HPV
7 CLASIFICACION DE LOS HPV Los HPV se clasifican en genotipos en base a diferencias en su secuencia de DNA Tipo viral divergencia en > 10% de homología en L1 (de Villiers y col, Virology, 2004)
8 HPV: 100 genotipos y vienen más...
9 POTENCIAL ONCOGÉNICO DE LOS HPV Tracto anogenital: 40 tipos de HPV No todos los tipos virales son igualmente oncogénicos HPVs de Bajo riesgo: 6,11,40,42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 y CP6108 HPVs de Alto riesgo: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 y 59 (Muñoz et al, Vaccine 2006)
10 PATOGENIA DE LAS INFECCIONES POR HPV Tropismo epitelial Piel Verrugas Epidermodisplasia verruciforme (EV) Cáncer cutáneo no melanoma (CCNM) Mucosa Condilomas anogenitales Lesiones preneoplásicas Cáncer anogenital
11 INTERRELACIÓN ENTRE E6 Y E7 EN LA INTERFERENCIA CELULAR HPV E7Captura prb y libera E2F Progresión de G1 a S HPV E6 Captura p53 y la degrada Estabiliza p53 Activación de los genes para la replicación del ADN celular E6 y E7 de los HPV de alto riesgo pueden inmortalizar células humanas en forma independiente, pero muestran complementariedad y sinergismo (Münger y Howley, 2002)
12 ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD AGENCIA INTERNACIONAL DE INVESTIGACIÓN SOBRE CANCER Los HPV de alto riesgo son carcinogénicos en humanos. HPV agente etiológico del cáncer de cuello uterino La carcinogénesis por los HPV de alto riesgo está sustentada en evidencias experimentales que indican que proteínas de esos virus interfieren en el control de la proliferación celular Human Papillomaviruses. Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans. International Agency for Research on Cancer (IARC-WHO) Vol 64 (1995).
13 El cáncer de cuello de útero en el mundo mujeres diagnosticadas por año 1 A nivel mundial, cada 2 minutos muere una mujer por cáncer de cuello de útero muertes (GLOBOCAN 2002) 1 En regiones menos desarrolladas, el cáncer de cuello de útero continúa siendo la principal causa de muerte por cáncer en mujeres Las proyecciones indican para 2050 > 1 millón de nuevos casos de cáncer de cuello de útero cada año 2 1. Ferlay J, et al. GLOBOCAN 2002 Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide. IARC CancerBase; Lyon, 2004; 2. Parkin DM, et al. Eur J Cancer 2001; 37(Suppl 8):S4-S66.
14 DETECCIÓN Y TIPIFICACIÓ DE HPV EN MUCOSAS
15 Tipos de muestra para el estudio virológico de HPV Material fresco Tejido fijado Biopsia Células Portas Tacos
16 TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO DE HPV EN EL LABORATORIO VIROLÓGICO (I) Detección de ácidos nucleicos virales por hibridación Hibridación in situ Captura de híbridos (HC II)
17 DETECCIÓN Y TIPIFICACIÓN DE HPV POR HIBRIDACIÓN IN SITU (Servicio Virus Oncogénicos, Instituto Malbrán)
18 Detección de HPV por captura de híbridos Mezcla A (5 HPV BR): HPV 6, 11, 42, 43 y 44 Mezcla B (13 HPV AR): HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 Se mide luz emitida: proporcional a la cantidad de DNA viral
19 Técnicas de estudio de HPV para la vigilancia laboratorial Detección de ácidos nucleicos virales mediante PCR Primers consenso Primers tipo-específicos
20 Detección y tipificación de HPV por PCR consenso SPF1 SPF MY11 GP5 GP6 MY09 Posiciones nucleotídicas Primers consenso: MY 09, 11 / PGMY (450 pb) GP 5+, 6+ (140 pb) SPF (65 pb) Requieren un paso posterior a la PCR para la tipificación viral (Bernard y col, 1994; Jacobs y col., 1997;Gravitt y col, 1998; Kleter y col, 1999)
21 Estrategias de tipificaión de HPV a traves de primers consenso Hibridación por Dot-blot ADN amplificado por PCR RFLP Dot-blot Electrophoresis of amplified products Hibridación reversa Patrones de restricción Secuenciación Probe Probe Probe Probe Probe Probe
22 Detección y tipificación de HPV por PCR tipo específica Primers tipo-específicos Regiones blanco: fragmentos de E6 o E7 PCR convencional o PCR en tiempo real Requiere una reacción de PCR para cada tipo viral (Gravitt y col., J. Virol Methods 2003)
23 ATENCIÓN PARA UN DIAGNÓSTICO MOLECULAR CONFIABLE, SE DEBE TENER EN CUENTA EL CONTROL DE CALIDAD: Muestras patrones Reactivos validados Protocolos estandarizados Operadores entrenados Paneles de control de calidad
24 APLICACIÓN CLINICA DE LA TIPIFICACIÓN DE HPV: CONCEPTOS ACTUALES
25 DIAGNÓSTICO DE LESIONES ANOGENITALES INDUCIDAS POR HPV. EVALUACION CLINICA COLPO / PENESCOPIA CITO HISTOLOGIA ESTUDIOS VIROLOGICOS
26 DETECCIÓN Y GENOTIPIFICACIÓN DE HPV CUÁNDO TIENE VALOR CLÍNICO? AYUDA AL DIAGNÓSTICO: discordancia o duda clínico-cito-histo-colposcópica. ESCLARECIMIENTO DE ASCUS ORIENTACIÓN TERAPÉUTICA Y DE SEGUIMIENTO CONTROL POST-TRATAMIENTO MEJORA EL SCREENING
27 PERSPECTIVAS EN LA PREVENCIÓN: VACUNAS CONTRA VIRUS PAPILOMA HUMANO
28 Vacunas contra HPV Antígenos VLP HPV16 VLP HPV18 + AS04 adyuvante Sal Aluminio (Al(OH) 3 ) + MPL Inmunoestimulante AS04 contenido en vacuna Antígenos VLP HPV16 VLP HPV18 VLP HPV6 VLP HPV11 + Adyuvante Sal Aluminio (Hidroxifosfato sulfato de aluminio amorfo [AAHS]) Cervarix TM es una marca del grupo de compañías GlaxoSmithKline. Gardasil es una marca registrada de Merck & Co. Inc. AAHS-contenido en vacuna
29 Las vacunas contra HPV son eficaces (Seguimiento promedio de 7 años) (Kohen, Science, 2005) Cuadrivalente (Gardasil; Merck): licenciada por ANMAT en octubre 2006 Bivalente (Cervarix; GSK): licenciada por ANMAT en marzo 2008 (Villa y col, Lancet, 2005; Harper y col, Lancet 2006; Joura y col., Lancet 2009)
30 La vacuna induce Ac neutralizantes VACUNAS CONTRA HPV: MODO DE ACCION IgG anti L1, tipo-específico, que evitan que el virus ingrese a la célula IMPIDEN LA NFECCIÓN. VPH Canal cervical Epitelio cervical TRANSUDACIÓN Anticuerpo neutralizante No es una vacuna terapéutica, NO tiene acción sobre infecciones preexistentes Vaso sanguíneo Daño epitelial Membrana basal 1. Parr EL, et al. J Virol 1997; 71: ; 2. Nardelli-Haefliger D, et al. J Natl cáncer Inst 2003; 95: ; 3. Schiller JT, et al. Nat Rev Microbiol 2004; 2: ; 4. Kemp TJ, et al. Clin vacuna inmunol 2008; 15:60 64; 5. Poncelet, et al. ESPID, Poto, Potugal, 2007; Resumen 37, Sesión ES2; 6. David MB, et al. Poster presentado at ESPID, 2008; 7. Fraser C, et al. vacuna 2007; 25: ; 8. Stanley M. VPH Today 2007; 11:1 16; 9. Einstein M. Cancer Inmunol Inmunother 2007; 57:
31 Gardasil Estudio fase II: niveles de anticuerpos hasta 7 años. VPH 16 erum clia GMT (mmu/ml) (Escala log 10 ) Se 10,000 1, * * * vaccination Gardasil Infección natural Nivel del anticuerpos más alto que el de la infección natural VPH 18 Serum clia GMT (mmu/ml) Escala (larga) 10,000 1, * * * vaccination Gardasil Infección natural Nivel del anticuerpos similar al nivel de la infección natural meses Adaptado de Olsson SE, et al. Vaccine 2007; 25: ; Villa LL, et al. Vaccine 2006; 24:
32 Cervarix Estudio fase IIb: niveles de anticuerpos hasta 9,4 años Seropositividad 98% en todo los puntos de tiempo 10,000 VPH 16 EU/ml 1, Nivel de anticuerpo 13 veces mayor que el nivel de una infección natural ,000 Seropositividad 98% en todo los puntos de tiempo VPH 18 EU/ml 1, Nivel de anticuerpo 11 veces mayor que el nivel de una infección natural Meses ( Naud P et al, 27th International Papillomavirus Conference, 2011).
33 o Edad óptima VACUNA CONTRA HPV: Algunas respuestas pendientes Población a vacunar Ideal: antes de la exposición al virus. Edad de IRS: variaciones entre países y culturas ANMAT aprobó: Cuadrivalente: Mujeres 9-26 años Bivalente: Mujeres años Prioridad en salud pública: niñas 9-13 años En Argentina: niñas de 11 años (Wright y col, Vaccine, 2006; CDC advisory committee recomends HPV vaccination)
34 VACUNA CONTRA HPV: Algunas respuestas pendientes Otros grupos etarios Población a vacunar? Vacunación de mujeres sexualmente activas ( Catch-up vaccination ) Beneficio demostrado para mujeres negativas para HPV-DNA y serología para los HPVs vacunales. No se decarta la vacunación en mujeres adultas mayores (Wright y col., Vaccine, 2006; CDC advisory committee recomends HPV vaccination)
35 VACUNA CONTRA HPV: Algunas respuestas pendientes Reemplazo de gentipos: Ocupación de los nichos de los virus vacunales por otros hasta ahora menos diseminados? Virus estable, larga coevolución con su hospedador La competencia por nichos es poco probable En un mismo individuo, las infecciones por distintos tipos virales son independientes unas de otras La vigilancia post-vacunal dará la última palabra (Stanley y col, Vaccine, 2006)
36 VACUNA CONTRA HPV: Algunas respuestas pendientes Impacto en los programas de screening? Una vez iniciada la vacunación, se requerirán décadas para poder observar los efectos sobre la incidencia del cáncer cervical No todos los tipos virales carcinogénicos están incluidos en las vacunas SE DEBE CONTINUAR EL SCREENING, PERO REDISEÑADO Nuevo rol laboratorial de la detección de DNA de HPV (Franco y col, Vaccine, 2006)
37 PREVENCION SECUNDARIA: tamizaje Se propone reducir la incidencia y mortalidad por CC a través de la detección temprana, mediante la implementación de estrategias para lograr la alta cobertura de la población objetivo, la alta calidad del test de tamizaje, y el adecuado seguimiento y tratamiento de las lesiones precancerosas y cáncer.
38 Principales etapas en el desarrollo del cáncer de cérvix Infección transitoria Infección persistente Cérvix normal Infección Eliminación Progresión Cérvix infectado Regresión Lesión Precancerosa (HSIL ó CIN 2/3) Invasión Cáncer (Adaptado de Schiffman y col., 2007)
39 Prevalenc cia de HPV (%) PREVALENCIA DE HPV E INCIDENCIA DE CANCER CERVICAL POR EDAD Edad (años) Prevalencia HPV alto riesgo: - < 30 años: ~ % - > 30 años: 3-7 % Incidencia Cánce er de cérvix (Casos por )
40 Métodos virológicos de alta sensibilidad clínica [5.000 copias] (Captura Híbrida) principal herramienta para el rediseño del tamizaje о Beneficio adicional: registro de prevalencia de HPV y enfermedades asociadas. Tipificación viral selectiva sobre muestras HPV +. о Ayudaría a determinar la duración de la protección о Deben desarrollarse algoritmos adaptados a las situaciones locales
41 RED DE LABORATORIOS DE HPV: una perspectiva regional en la vigilancia epidemiológica
42 Red Argentina de Laboratorios de HPV Actualmente son parte de esta Red 11 provincias argentinas.
43 Red Global de Laboratorios de HPV: Misión Generar una Red Mundial de Laboratorios que puedan realizar una efectiva vigilancia y monitoreo del impacto de la vacunación contra HPV, a través de la actualización, capacitación y el establecimiento de un programa de control de calidad (
44 Red Global de Laboratorios de HPV: Estructura Inicio: niveles de responsabilidad 2 Labs. Mundiales de Referencia Suecia y EEUU 8 Laboratorios Regionales de Referencia Argentina, Australia, India, Japón Sudáfrica, Suiza, Tailandia y Túnez Laboratorios Nacionales de Referencia Centro colaborador: Inst. Nac. de Estándares Biológicos y Control, UK
45 HPV LabNet Laboratories GLOBAL WHO HPV REFERENCE LABORATORIES Prof. Joakim Dillner University of Lund SE Malmö, SWEDEN Dr. Elizabeth Unger Centers for Disease Control Atlanta, GA 30333, USA REGIONAL WHO HPV REFERENCE LABORATORIES Prof. Anna-Lise Williamson Dr. Maria Alejandra Picconi Institute of Infectious Disease and Molecular Medicine Oncogenic Viruses Service Faculty of Health Sciences National Reference Laboratory for Papillomavirus University of Cape Town Natl. Institute of Infectious Diseases - ANLIS "Dr. Malbran" Cape Town, SOUTH AFRICA Buenos Aires, ARGENTINA Region: Africa Region: America (PAHO) (Since March 2009) Dr. Emna Ennaifer-Jerbi Tunis Pasteur's Institute Belvédère, TUNISIA Region: Eastern Mediterranean Dr. Alok Chandra Bharti Division of Molecular Oncology Institute of Cytology and Preventive Oncology Noida , INDIA Region: South-East Asia Assistant Prof. Denise Nardelli-Haefliger Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV) Lausanne, SWITZERLAND Region: Europe Dr. Sukhon Sukvirach National Cancer Institute Rajthewe, Bangkok 1040, THAILAND Region: South-East Asia Prof. Suzanne Garland Dr. Iwao Kukimoto Department of Microbiology and Infectious Diseases Center for Pathogen Genomics The Royal Women's Hospital National Institute of Infectious Diseases (NIID) Parkville, VIC 3052, AUSTRALIA Tokyo , JAPAN Region: Western Pacific Region: Western Pacific
46 Red Global de Laboratorios de HPV: Actividades 1) Asesoramiento científico y técnico 2) Garantía de Calidad (QA/QC) 3) Entrenamiento 4) Comunicación (HPV LabNet Newsletter) 5) Vigilancia virológica El trabajo se desarrolla en estrecha relación con las autoridades sanitarias locales.
47 Vigilancia laboratorial de la infección por HPV en la era vacunal La genotipificación requiere métodos de alta sensibilidad analítica [1-10 copias] (basados en PCR) Evaluación del impacto de la vacunación sobre la prevalencia de los genotipos relacionados con la vacuna (tipos incluidos en la fórmula y protección cruzada contra virus relacionados) Discriminación de los tipos presentes en infecciones múltiples Monitoreo de un potencial reemplazo de genotipos (Stanley y col, Vaccine 2006; Pagliusi y col, Dis Markers, 2007; Meeting Report, OMS, 2007, Eklund et al 2010 )
48 HPV WHO position paper La vacuna contra HPV sebe ser La vacuna contra HPV sebe ser introducida como parte de una estrategia coordinada que incluya educación, información, tamizaje, etc.
49 1º Taller de genotipificacion de HPV en el marco de la HPV LabNet de OMS Buenos Aires, abril participantes de 14 países latinoamericanos
50 CONCLUSIONES Todo cáncer de cérvix es precedido por una infección persistente con tipos de HPV de alto riesgo oncogénico. El comportamiento biológico de los HPVs de alto y bajo riesgo es DIFERENTE: HPV de alto riesgo > tendencia a PERSISTIR El HPV utiliza la maquinaria biosintética de la célula: NO hay antivirales específicos NO se trata la infección, sino la enfermedad asociada HPV amplia distribución: > 70% de mujeres tendrán contacto durante su vida sexual Infección TRANSITORIA: autolimitada, SIN secuelas oncopatogénicas Infección PERSISTENTE: condición previa para lesiones preneoplásicas Mujeres con HSIL están en riesgo de desarrollar cáncer cervical, esta progresión no suele ser inmediata, sino que demora años
51 CONCLUSIONES Vigilancia laboratorial de la infección por HPV en la era vacunal Métodos de alta sensibilidad analítica permitirán evaluar con seguridad que las vacunas prevengan infecciones por tipos virales específicos y sus enfermedades asociadas Tamizaje poblacional en la era vacunal Métodos de alta sensibilidad clínica para detectar enfermedad. Algoritmos adaptados a las situaciones locales
52 La historia natural de la infección por HPV y de sus enfermedades asociadas brinda elementos para optimizar los programas de prevención de cáncer de cérvix Prevención PRIMARIA: VACUNACIÓN Edad blanco: niñas (antes de IRS) Evita la infección Prevención SECUNDARIA: TAMIZAJE Edad blanco: mujeres > 30 años Mayor valor predictivo positivo en la detección de lesiones preneoplásicas CURABLES
53 Laboratorio de Virus Oncogénicos Instituto Malbran, Buenos Aires (Argentina) Visita del Prof. Harald zur Hausen, premio Nobel en Medicina 2008 Nov GRACIAS POR SU ATENCION
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