Dr Javier Gómez Román Serviciode Anatomía Patológica Hospital Universitario Marqués de Valdecilla Santander
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- Vanesa Hidalgo Suárez
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2 Dr Javier Gómez Román Serviciode Anatomía Patológica Hospital Universitario Marqués de Valdecilla Santander
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4 Guión 1. De qué estamos hablando? 2. Incertidumbres 3. Problemas metodológicos 4. Posibles respuestas
5 Tipos de biomarcadores basados en la respuesta inmune CD8 + T cell TCR MHC Secreted factors CD8 + T cell Treg CD4 + T cell Cell-surface molecules Tumour MDSC APC NK Treg Whiteside TL. Front Oncol. 2013;3:1-8
6 Tipos de biomarcadores basados en la respuesta inmune CD8 + T cell TCR Cell-surface molecules MHC Tumour Secreted factors CD8 + T cell Infiltrado inmune: Treg Correlación entre el tipo y CD4 + T cell localización de la población inmune y el pronóstico MDSC APC NK Treg WhitesideTL. Front Oncol. 2013;3:1-8; Galon J, et al. Immunity. 2013;39:11-26; Fridman WH et al. Nat Rev Cancer. 2012;12:
7 Tipos de biomarcadores basados en la respuesta inmune CD8 + T cell TCR MHC Moléculas segregadas: Citoquinas, Factores de crecimiento y otras proteínas que regulan el comportamiento del sistema inmune periférico y también en el interior Tumourdel tumor Cell-surface molecules La actividad se modula por sustancias producidasasimismo por células tumorales Treg Secreted factors CD8 + T cell CD4 + T cell APC Treg MDSC NK Kwak M, et al. Front Oncol. 2013;3:10 1. Fridman WH, et al. Nat Rev Cancer. 2012;12: ; 2. Alshaker HA, et al. Cancer Cell Int. 2011;11:3.
8 Tipos de biomarcadores basados en la respuesta inmune CD8 + T cell TCR Cell-surface molecules Treg MHC Tumour Secreted factors CD8 + T cell Moléculasde superficie celular: Células inmunes y células diana CD4 + T cell características proporcionan un valor APC Treg Muchas de estas moléculas son inducidas e inducibles La presencia de estos marcadores y sus predictivo MDSC NK Ceeraz S, et al. Trends Immunol. 2013;34: ; 1. Greaves P, Gribben JG. Blood. 2013;121: ; Wang S, Chen L. Cell Mol Immunol. 2004;1:37-42.
9 Checkpoints (Puntos de control) Mecanismo fundamental de evasión de la respuesta inmune: Cuando se activa un checkpoint finaliza la respuesta inmune Moléculas implicadas en este mecanismo: Cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4 (CTLA-4) Programmed cell death protein 1 (PD-1) y sus ligandos PD-L1 (B7-H1) and PD-L2 (B7-DC) T-cell immunoglobulinmucin-3 Lymphocyte activationgene-3 Otras
10 Competición CD28 (estimulador) y CTLA-4 (inhibidor) CD80 y CD86 B7-H1 y B7-DC
11 Rutas de control CTLA-4 PD-1 Expresión del receptor Células T activadas Células T activadas, B y NK Ligandos B7.1 (CD80), B7.2 (CD86) PD-L1 (B7-H1), PD-L2 (B7- DC) Impide la activación de células T INICIAL Suprime la actividad de linfocitos T en tejidos Mecanismos de modulación inmune Compite con CD28 (estimulador) e impide su acción Disminuye la actividad de los linfocitos T CD4+ Se expresa en linfocitos Treg y promueve la inmunosupresión Limita la actividad de células B y NK Interacciona con linfocitos Treg estimulando su acción inmunosupresora PD-L1 Interacciona con CD80
12 2012 Usaron el clon 5H1 monoclonal desarrollado en un laboratorio Dr Lieping Chen original article El umbral de positividad usado es del 5% Safety, Activity, and Immune Correlates of Anti PD-1 Antibody in Cancer The new england journal of medicine Suzanne L. Topalian, M.D., F. Stephen Hodi, M.D., Julie R. Brahmer, M.D., Scott N. Gettinger, M.D., David C. Smith, M.D., David F. McDermott, M.D., John D. Powderly, M.D., Richard D. Carvajal, M.D., Jeffrey A. Sosman, M.D., Michael B. Atkins, M.D., Philip D. Leming, B M.D., David R. Spigel, M.D., Scott J. Antonia, M.D., Ph.D., Leora Horn, M.D., Charles G. Drake, M.D., Ph.D., Objective Response Drew M. Pardoll, M.D., Ph.D., Lieping Chen, M.D., Ph.D., William H. Sharfman, M.D., Robert A. Anders, M.D., Ph.D., 1.0 Janis M. Taube, M.D., Tracee L. McMiller, M.S., Haiying Xu, B.A., Alan J. Korman, Ph.D., Maria Jure-Kunkel, Ph.D., Shruti Agrawal, 0.8 Ph.D., Daniel McDonald, M.B.A., Georgia D. Kollia, Ph.D., Ashok Gupta, M.D., Ph.D., Jon M. Wigginton, M.D., and Mario Sznol, M.D. 16/ Proportion of Patients /25 No Objective Response 17/17 Melanoma RCC 0.0 Positive (N=25) PD-L1 Status 0/17 Negative (N=17) Association between Pretreatment Tumor PD-L1 Expression and Clinical Response Response Status PD-L1 Positive PD-L1 Negative Objective response No objective response All 9 (36) 16 (64) 25 number (percent) 0 17 (100) 17 Total 9 (21) 33 (79) 42 Lung Cancer P=0.006 for association by Fisher s exact test
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14 Guión 1. De qué estamos hablando? 2. Incertidumbres 3. Problemas metodológicos 4. Posibles respuestas
15 Change in Baseline Target Lesions (%) a A. Best percent change in target lesion tumor burden Pts PD-L1 Status (5% cut-off) Negative Incertidumbres Positive B. PFS La expresión de PDL1 por las células tumorales podría ser un biomarcador de respuesta a Nivolumab? Existen casos negativos que se benefician del tratamiento Usando únicamente el criterio de expresión de PD-L1 podrían perderse pacientes que se beneficiarían del tratamiento El problema es que aquí hablamos de EXPRESIÓN y ésta como tal es variable a lo largo del tiempo y depende de tratamientos previos La detección dependerá además del tipo de reactivo y
16 Metodología En el estudio de NEJM 2012, de 296 pacientes enrolados sólo se hizo análisis de biomarcadores de manera retrospectiva en 42 (18 casos de carcinoma pulmonar) Se usó tejido fijado en formol e incluido en parafina Clon 5H1. Punto de corte de positividad 5% Células evaluables mayor de 100 Estamos evaluando el ligando cuando el fármaco va dirigido al receptor Puede existir activación del receptor no unido a ligando (activación constitutiva) o ligandosdesconocidos Casos negativos para PD-L1 que respondan al fármaco ya que podrá activarse la ruta PD1 por otros mecanismos
17 IFNγmediated upregulation of tumor PD- L1 PD-L1/PD-1-mediated inhibition of tumor cell killing receptor Priming and activation of T cells Linfocito Immune cell modulation of T cells Stromal PD-L1 modulation of T cells Chen DS, Irving BA, Hodi FS. Clin Cancer Res. 2012;18:6580. PD-L2 mediated inhibition of TH-2 T cells
18 Incertidumbres La expresión de PDL1 por las células tumorales podría ser un biomarcador de respuesta a Nivolumab? Existen casos negativos que se benefician del tratamiento Por tanto, usando únicamente el criterio de la expresión de PD-L1 podrían perderse pacientes que se beneficiarían del tratamiento El problema es que aquí hablamos de EXPRESIÓN y ésta como tal es variable a lo largo del tiempo y depende de tratamientos previos La detección dependerá además del tipo de reactivo y las condiciones experimentales y del tejido
19 LETTER doi: /nature13954 PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance Paul C. Tumeh 1,2, Christina L. Harview 1, Jennifer H. Yearley 3, I. Peter Shintaku 1, Emma J. M. Taylor 1, Lidia Robert 1, Bartosz Chmielowski 1,2, Marko Spasic 1, Gina Henry 1, Voicu Ciobanu 1, Alisha N. West 1, Manuel Carmona 1, Christine Kivork 1, Elizabeth Seja 1, Grace Cherry 1, Antonio J. Gutierrez 1, Tristan R. Grogan 1, Christine Mateus 4, Gorana Tomasic 4, John A. Glaspy 1,2, Ryan O. Emerson 5, Harlan Robins 5,6, Robert H. Pierce 3, David A. Elashoff 1,2, Caroline Robert 4 & Antoni Ribas 1,2
20 La expresión de PD-L1 es dinámica tras el tratamiento Basal Tras tratamiento CD8 T PD-L1 CD8 T PD-L1 MPDL3280A Biomarkers and Associations With the Clinical Activity of PD-L1 Blockade in a MPDL3280A Study Powderly J 1, Koeppen H 2, Hodi FS 3, Sosman J 4, Gettinger S 5, Desai R 2, Tabernero J 6, Soria JC 7, Hamid O 8, Fine G 2, Xiao Y 2, Mokatrin A 2, Wu J 2, Anderson M 2, Irving B 2, Chen DS 2, Kowanetz M 2 1 Carolina BioOncology Institute, 2 Genentech, Inc., 3 Dana Farber Cancer Institute, 4 Vanderbilt- Ingram Cancer Center, 5 Yale University, 6 Vall d Hebron University Hospital, 7 Institut Gustave Roussy, 8 The Angeles Clinic and Research Institute Expresión de PD-L1 por células tumorales y linfocitos proliferados Powderly J, et al. Presentación Oral ASCO 2013 (abstr. 3001)
21 Many of the discrepancies identified can be explained by the fact that PD-L1 is an inducible receptor, highly dynamic, and subject to change over time. PD-L1 positive tumour cells are usually localised adjacent to tumour-infiltrating lymphocytes, often forming a line of demarcation between the tumour tissue and the immune infiltrate. PD-L1 expression as a potential predictive biomarker Immunotherapy Alberto Fusi, Lucia Festino, is a major Gerado breakthrough Botti, Giuseppe Masucci, in cancer treatment. Ignacio Melero, The *Paul PD-1, Lorigan, PD-L1, Paolo and A Ascierto PD-L2 pathways are key Christie immune NHS Foundation checkpoints Trust, Manchester, and the UK (AF, PD-1 PL); Istituto inhibitors, Nazionale Tumori, Fondazione G Pascale, Napoli, Italy (LF, GB, PAA); nivolumab and pembrolizumab, have shown a survival University of Manchester, Institute of Cancer Sciences, Manchester benefit M20 4BX, in UK melanoma (PL); Karolinska and Institutet, lung cancer. Stockholm, Attention Sweden (GM); is now focused Clinica Universitaria on the identification Navarra, Pamplona, of predictive Spain (IM) biomarkers to paul.lorigan@christie.nhs.uk select patients for treatment. The question of whether expression of PD-L1 correlates with treatment outcomes has been addressed in most of the pivotal trials, but the answer is still unclear. Some of these inconsistencies are assay related, with no general consensus about which antibody to use, which cells to stain, and what cut-off value to choose. In the Checkmate 037 study 1 in patients with melanoma Vol 16 October Vol 16 October 2015
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23 Expresión del gen y la proteína de PD-L1 La asociación entre expresión génica y proteíca de PD-L1 sólo se vio a partir de los niveles más elevados (más del 80% de tinción) A menores rangos no existía asociación Harbison CT, et al. Poster WCLC 2013 (P )
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25 Incertidumbres La expresión de PDL1 por las células tumorales podría ser un biomarcador de respuesta a Nivolumab? Existen casos negativos que se benefician del tratamiento Por tanto, usando únicamente el criterio de la expresión de PD-L1 podrían perderse pacientes que se beneficiarían del tratamiento El problema es que aquí hablamos de EXPRESIÓN y ésta como tal es variable a lo largo del tiempo y depende de tratamientos previos La detección dependerá además del tipo de reactivo y las condiciones experimentales y del tejido
26 Tinción en células tumorales con antipd-l1 Anticuerpo de conejo anti-pd-l1 humano (clon 28-8) Tinción de membrana en células tumorales % Staining 1% 5% 20% 65% Positivo Control Negativo Antonia et al., WCLC, 2013
27 Claro que lo entiendo. Incluso un niño de cuatro años podría entenderlo. Que me traigan un niño de cuatro años!
28 Guión 1. De qué estamos hablando? 2. Incertidumbres 3. Problemas metodológicos 4. Posibles respuestas
29 Problemas preanalíticos y analíticos con PD-L1 Variables preanalíticas Pieza de resección, biopsia, citología Método de fijación Tiempo de procesado Heterogeneidad intratumoral Expresión geográfica (interfase tumor/estroma, interior tumoral, interfase con tejido no neoplásico) Múltiples test y plataformas Ausencia de pruebas estandarizadas Plataformas diferentes
30 Association of PD-1, PD-1 ligands, and other features of the tumor immune microenvironment with response to anti-pd-1 therapy Janis M Taube, Alison P. Klein, Julie R Brahmer, et al. Expresión de PD-L1 de membrana Se asocia geográficamente aunque no de manera universal con áreas de infiltrado linfocitario No hay relación entre tamaño de biopsia y expresión de PD-L1. Se pueden usar biopsias pequeñas No incluyen citologías
31 Clon SP263 Ventana PD-L1
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36 250 Muestras días vs 11 días de archivo o nuevas? Keynote 010 Herbst EB, ASCO 2016
37 Problemas preanalíticos y analíticos con PD-L1 Variables preanalíticas Pieza de resección, biopsia, citología Método de fijación Tiempo de procesado Heterogeneidad intratumoral Expresión geográfica (interfase tumor/estroma, interior tumoral, interfase con tejido no neoplásico) Múltiples test y plataformas Ausencia de pruebas estandarizadas Plataformas diferentes
38 20 casos con muestras pareadas Histology Primary % Met % Primary Pos/Neg Met Pos/Neg Concordance 1 Adeno 25 10POSITIVE POSITIVE Concordant 2 Adeno POSITIVE POSITIVE Concordant 3 Adeno POSITIVE POSITIVE Concordant 4 Adeno 0 0NEGATIVE NEGATIVE Concordant 5 Adeno 0 0NEGATIVE NEGATIVE Concordant 6 Adeno 5 10POSITIVE POSITIVE Concordant 7 Adeno POSITIVE POSITIVE Concordant 8 Adeno 0 0NEGATIVE NEGATIVE Concordant 9 Adeno 85 30POSITIVE POSITIVE Concordant 10 Adeno 1 0NEGATIVE NEGATIVE Concordant 11 Squamous 0 0NEGATIVE NEGATIVE Concordant 12 Squamous 20 5POSITIVE POSITIVE Concordant 13 Squamous 70 70POSITIVE POSITIVE Concordant 14 Squamous 90 95POSITIVE POSITIVE Concordant 15 Squamous 5 0POSITIVE NEGATIVE Discordant 16 Squamous 15 80POSITIVE POSITIVE Concordant 17 Squamous 0 0NEGATIVE NEGATIVE Concordant 18 Squamous 0 40NEGATIVE POSITIVE Discordant 19 Squamous 0 0NEGATIVE NEGATIVE Concordant 20 Squamous 15 40POSITIVE POSITIVE Concordant
39 Problemas preanalíticos y analíticos con PD-L1 Variables preanalíticas Pieza de resección, biopsia, citología Método de fijación Tiempo de procesado Heterogeneidad intratumoral Expresión geográfica (interfase tumor/estroma, interior tumoral, interfase con tejido no neoplásico) Múltiples test y plataformas Ausencia de pruebas estandarizadas Plataformas diferentes
40 OncoTargets and Therapy Dovepress open access to scientific and medical research Open Access Full Text Article ORIGINAL R ESEARCH Prognostic value of programmed cell death-ligand 1 expression in patients with non-small-cell lung cancer: evidence from an updated meta-analysis Table 1 Clinical characteristics of qualified records in meta-analysis Author Year Country Type Stage Cutoff Antibody Source Type Catalog Mu et al People s Republic of China NSCLC I III Media H-score NR MAB NR Ma et al People s Republic of China NSCLC I IV H-score 3 Rabbit MAB NR Chen et al People s Republic of China NSCLC I III H-score 3 Rabbit PAB NR Zhang et al People s Republic of China ADC I III H-score 80 Rabbit PAB SAB Yang et al People s Republic of China ADC I IV Percentage 5% Rabbit PAB AP Velcheti et al 23, * 2014 Greek NSCLC I IV AQUA scores Mouse MAB Clone 5H1 Velcheti et al 23,# 2014 USA NSCLC I IV AQUA scores Mouse MAB Clone 5H1 D Incecco et al Italy NSCLC IIIB IV H-score 3 NR NR ab58810 Azuma et al Japan NSCLC I III H-score 30 Rabbit PAB NR Mao et al People s Republic of China ADC I III H-score 3 Mouse MAB Clone 2H11 Lin et al People s Republic of China NSCLC IIIB IV Media H-score NR NR ab58810 Tang et al People s Republic of China NSCLC IIIB IV H-score 5 Rabbit MAB NR Notes: H-score SI (staining intensity) PP (percentage of positive cells). SI was determined as 0, negative; 1, weak; 2, moderate; and 3, strong. PP was defined as 0, negati cohort. Abbreviations: NSCLC, non-small-cell lung cancer; ADC, adenocarcinoma; HR, hazard ratio; CI, confidence interval; AQUA, automated quantitative analysis; MAB, monoclona
41 Ensayo Análisis Positividad Nivolumab (BMS) (anti PD1) Manual (5H1 Topalian) Dako Automatizado (28-8 Antonia) Células tumorales Tejido de archivo Tinción de membrana de cualquier intensidad ORR con puntos de corte del 1% y 5% Expresión de PD-L1 56%: 1% corte 49%: 5% corte Respuestas Topalian (n=42) PD-L1 positivo: 36% PD-L1 negativo: 0% Brahmer 2014 (n=68) PD-L1 positivo: 15% PD-L1 negativo: 14% Gettinger 2014 (n=17) PD-L1 positivo: 50% PD-L1 negativo: 0% Atezolizumab MPDL 3280A (Roche) (anti-pd- L1) Ventana (SP-142) Automatizado Células inmunes infiltrantes en el tumor Intensidad de la IHQ 25% PD-L1 alto (IHC 2,3) 75% PD-L1 bajo (IHC 0,1) Rizvi 2014 (n=53) IHC 3 (n=6): 83% IHC 2,3 (n=13): 46% Todos (n=53): 23% Pembrolizumab (Merck) (MK-3475; anti-pd-1) DAKO (22C3) Expresión de PD- L1 en células tumorales y estroma Fuerte ( 50 de células tumorales) vs débil (1 49%) por IHC 67% PD-L1 positivo 33% PD-L1 negativo Garon 2014 (n=194) PD-L1 positivo: 23% PD-L1 negativo: 9% Durvalumab MEDI4736 (AZ) (anti-pd-l1) Ventana (SP-263) Automated Assay IHQ frente a PD- L1 en muestras fijadas en formol e incluidas en parafina Desconocida Desconocida Brahmer 2014 (n=58) PD-L1 positivo: 25% PD-L1 negativo: 3%
42 Y si leemos un poco Estos estudios difieren en: El tipo de anticuerpo La fijación o preservación tisular Las plataformas usadas (automáticas o manuales) La definición de positividad Las células diana para definir la positividad El tipo de tinción estimada como positiva (citoplasma o membrana)
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49 Resumen La expresión de PD-L1 es dinámica y heterogénea dependiendo de tratamientos y otras circunstancias Existen casos que se benefician entre los que tienen baja o nula expresión de PD- L1 Es preciso clarificar aspectos sobre la selección de pacientes y sobre las técnicas utilizadas Los tratamientos con Pembrolizumab en cáncer de pulmón requieren el uso de inmunohistoquímica con el kit 22C3 de Dako Los tratamientos con Nivolumab en cáncer de pulmón (escamoso y no escamoso) no requieren estrictamente inmunohistoquímica si bien recomiendan el uso de kit 28-8 de Dako
50 Qué nivel de expresión es significativo desde el punto de vista clínico? El 1, el 25, el 50%? Dónde observar la positividad? Únicamente en células tumorales? En TIL? El biomarcador usado para uso en rutina debe tener en cuenta: La variabilidad en el tiempo de recepción de la muestra El tipo de muestra (primario, metástasis) (citología, biopsia) El tipo de anticuerpo y la plataforma La definición de la tinción (membrana, citoplasmática) Reproducibilidad Aspectos a aclarar
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52 Guión 1. De qué estamos hablando? 2. Incertidumbres 3. Problemas metodológicos 4. Posibles respuestas
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54 Problemas Una prueba diferente para cada fármaco no es práctico Cantidad limitada de tejido, tiempo, coste Sólo una prueba para todos los fármacos no es práctico Diferentes plataformas, características, guías Cada fármaco tiene diferente respuesta basado en química, biología y diferencias en los anticuerpos monoclonales Peligroso para los pacientes si: Pruebas aprobadas por FDA y los fármacos se entrecruzan por los consumidores en ausencia de una validación clínica y analítica Por tanto, parece necesario acordar mediante colaboración de la industria, un ensayo que permita la validación de los test diagnósticos poniendo las bases para una estandarización y desarrollo de guías prácticas
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56 Material y métodos 39 casos de Carcinoma pulmonar no microcítico inmunoteñidos en Dako y Ventana con los cuatro anticuerpos. Sin correlación con evolución clínica Tres patólogos evaluaron 156 portas (39x4) para la expresión de PD-L1 en células tumorales e inmunes Sin entrenamiento previo Cada patólogo evaluó cada caso con los puntos de corte de cada anticuerpo Por ejemplo todos los cristales con el punto de corte del 1% del 22C3 Se evaluó el acuerdo
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58 Los puntos representan la media de los tres patólogos por cada caso con cada anticuerpo Las líneas indican valores idénticos Sin puntos de corte Tres de los cuatro anticuerpos muestran similar proporción de positividad en células tumorales Porcentaje de células tumorales
59 Los puntos representan la media de los tres patólogosporcada caso con cada anticuerpo Las líneas indican valores idénticos Sin puntos de corte Todos los anticuerpos tiñen células innmunes pero de forma más variable Porcentaje de células inmunes
60 Número total entre paréntesis Cada diagrama de Venn expresa número de casos con acuerdo según puntos de corte 19 / 38 casos acuerdo en positividad Cinco casos negativos con acuerdo total SP142 Células tumorales y/o inmunes Acuerdo entre tests
61 De menor a mayor expresión de PD-L1 Marcado en azul (24 casos, 63,1%) acuerdo independiente de anticuerpo Marcado en negro (14 casos, 36,9%) casos discrepantes Concordancia en expresión
62 Conclusiones Tres anticuerpos (22C3, 28-8 y SP263) demuestran similar rendimiento con respecto al porcentaje de células tumorales reactivas SP142 tiñe menor cantidad de células tumorales Todos tiñen células inmunes pero con menor precisión en el acuerdo El 37% de los casos demuestran discrepancias entre los resultados proporcionados por los anticuerpos Existe la posibilidad de diferentes resultados entre los anticuerpos al usar los puntos de corte
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66 Andreas H Cheel, ASCO 2016
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75 Are we ready for immune checkpoint inhibitors for advanced non-small-cell lung cancer? score of 1 49% also benefited (0 76, ). At present, there appear to be no solid data to support the routine application of PD-L1 expression as a predictive biomarker before the use of immune checkpoint inhibitors. Because patients with a tumour proportion score of less than 1% were excluded from this study, it is unclear whether such patients would have a different response to pembrolizumab compared with the 1 49% subgroup. On the basis of previous findings from the KEYNOTE-001 study, 5 tumour response rate, median progression-free survival, and median overall survival might be similar in each subgroup. Given the data available, we caution about the use of a tumour proportion score of less than 1% as a negative predictive biomarker for this treatment. *Tony S K Mok, Herbert H Loong Department of Clinical Oncology, Faculty of Medicine, State Key Laboratory in Oncology in South China, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong Special Administrative Region, China tony@clo.cuhk.edu.hk TSKM has received honoraria from Boehringer Ingelheim, BioMarin
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