Otras PCR: PCR en tiempo real (cuantitativa) Curso PCR Inmaculada Martín Burriel Curso PCR

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1 Otras PCR: PCR en tiempo real (cuantitativa) Curso PCR Inmaculada Martín Burriel Programa: Miércoles 18 de enero (10 h) Aula Grados: PCR en Tiempo Real (teoría) Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real: Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones. Ejemplo: Perfiles de expresión génica en scrapie Protocolo experimental (15 h) Aula Grados Diseño de primers y sonda (Primer express). Validación de primers. Optimización de la reacción: Matriz de primers Matriz de sonda Curva standard. Normalización de datos de expresión 1

2 Programa: Jueves 19 de enero (10h) LAGENBIO: Práctica: Realización de una PCR en tiempo real. Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real : Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones. Ejemplo: Perfiles de expresión génica en scrapie PCR clásico La cantidad de producto no está relacionada con la cantidad de DNA inicial Herramienta cualitativa (presencia o ausencia) El bromuro de etidio es poco sensible, cuando se detecta ya se ha sobrepasado la fase exponencial 2

3 Técnicas de cuantificación Northern Blot PCR Competitivo o PCR Mimic Early expression of p53 responsive genes (24h) Bax CD95/Fas L C M GAPDH Martín-Burriel et al. (2004) 3

4 PCR Competitivo o PCR Mimic Overexpression of antiapoptotic and carcinogenic related markers Bcl-2 Tgf-b1 c-myc L C M PCR Competitivo o PCR Mimic Martín-Burriel et al. (2004) Toxicol Pathol 4

5 Necesidad de PCR en tiempo real Necesidad de cuantificar diferencias de expresión de un mrna Disponibilidad de muy pequeñas cantidades de mrna en algunas prácticas laboratoriales: Células obtenidas de microdisección por láser Pequeñas cantidades de tejido Biopsias embrionarias Especimenes de gran valor PCR en Tiempo Real Nuevos químicos Nuevas plataformas instrumentales Detección de productos PCR en tiempo real Permite observar la cinética de la reacción 5

6 Fases de la PCR Exponencial: En cada ciclo se dobla el producto. Lineal: enlentecimiento, consumo de componentes, principio de degradación. Meseta: Parada de la reacción, agotamiento de componentes, degradación de productos. Fases de la PCR Logarítmica Lineal 6

7 Detección en la fase exponencial Detección en la fase de meseta Problemas de cuantificación en la fase de meseta 7

8 PCR en Tiempo Real Toma los datos mientras se producen. Cuantificación más exacta sin necesidad de métodos laboriosos. Existe una relación cuantitativa entre la cantidad inicial y la cantidad de producto PCR en un ciclo dado. Flurocromos: SYBR Green Se intercala en el surco menor del ADN de doble cadena y emite fluorescencia. No es equimolecular. Necesaria curva de disociación. 8

9 Curva de disociación Tª Melting: - Composición de bases del fragmento - Tamaño del fragmento. -Tm dimeros < Tm fragmento Curva de disociación 9

10 Curva de disociación Muestras problema Controles negativos y sin RT Ventajas e inconvenientes PCR con SYBR Green: Más barato Los mismos reactivos sirven para analizar cualquier fragmento La especificidad viene dada únicamente por los primers No es equimolecular Se necesita realizar una curva de disociación 10

11 Sondas TaqMan Actividad 5 exonucleasa de la Taq polimerasa. Reporter: FAM, VIC. Quencher: TAMRA. Importante tªm (~70ºC). Equimolecular. Especificidad Diseño de sondas entre dos exones 11

12 Equimolaridad TaqMan SYBR Green Sondas MGB R MGB NFQ NFQ: Quencher oscuro, no emite fluorescencia. Disminuye Baseline. Aumenta sensibilidad. MGB: Se une al surco pequeño. Aumenta la Tªm. Aumenta la eficiencia. 12

13 Ventajas e inconvenientes PCR con Sondas TaqMan: Más caro Utilización de sondas específicas para cada fragmento a analizar La especificidad viene dada por los primers y la sonda Es equimolecular No necesita curva de disociación Aplicaciones de la PCR-TR Glosario de términos. Cuantificación: Absoluta Relativa Determinación de mutaciones. Ensayos +- 13

14 Aplicaciones de la PCR-TR Glosario de términos. Cuantificación: Absoluta Relativa Determinación de mutaciones. Ensayos +- Glosario de términos Cuantificación: Absoluta: Resultado final con unidades (carga viral, copias de mensajero, copias de un gen,...). Se necesita una curva patrón absoluta. Relativa: Resultado sin unidades. Proporciona un porcentaje de incremento o disminución (expresión génica). Se necesita curva patrón (al menos para prueba de primers). 14

15 Glosario de términos Referencia: Señal utilizada para normalizar el experimento. Pasiva: Fluorocromo en todos los tubos (ROX). Activa: endógena (housekeeping) o exógena (construcción). Calibrador: Muestra que usamos para comparar las demás. Glosario de términos Standard (patrón): Muestra de concentración conocida que nos permite construir la curva de calibrado. Threshold (umbral): C t es el ciclo en el cual se detecta un incremento significativo de Rn (fluorescencia). El sistema empieza a detectar la señal asociada al incremento exponencial de producto PCR (Fase exponencial) 15

16 Aplicaciones de la PCR-TR Glosario de términos. Cuantificación: Absoluta Relativa Determinación de mutaciones. Ensayos +- Métodos de cuantificación Curva estándar Delta Ct Método de Pfaffl 16

17 Curva estándar Curva estándar 17

18 Curva Patrón y=ax+b. Y=Ct, X=log [DNA]. Relaciona cada concentración con su Ct. Propia de cada pareja de primers. La pendiente depende de la eficiencia de los primers y no debería cambiar entre experimentos: 100% (a=-3.32). 75% (a=-4). Aceptable:-3-4. a> -3 contaminación por fluorescencia. Curva Patrón Correlación (R 2 ): R 2 =1 (perfecta). R (0.99). Seleccionar el umbral donde R 2 sea máxima. Mantener el umbral entre experimentos. Nº de réplicas: Al menos 2 réplicas por muestra. Desviación estándar 0.38 Muestra: Curva absoluta: muestra de [] conocida. Diluciones 1/5. 18

19 1. Cuantificación Absoluta Validación de la curva patrón: La precisión de la cuantificación dependerá de la precisión de los patrones. Patrones: DNA plasmídico. DNA genómico. Productos PCR. Grandes oligonucleótidos comerciales. Resultado final relativo a una unidad de interés: Copias/ng de RNA Copias/g tejido, copias/ml sangre. Copias/genoma. Copias/ célula. ATENCION DENOMINADOR 1. Cuantificación Absoluta Posibles curvas de calibrado (Expresión génica): Productos de RT-PCR u oligonucleótidos: Rápido, conocimiento preciso de [DNA]. Inestable, problemas en la reamplificación. DNA recombinante: Muy estable, sin problemas de amplificación, talla similar a transcritos. Construcción del DNArec, no tiene en cuenta la eficacia de la RT. RNA recombinante: Mimetiza la situación real de retrotranscripción (añadir RNA background). Muy inestable, clonación complicado, purificación, problemas de almacenamiento. 19

20 1. Cuantificación Absoluta Puntos críticos de la curva patrón: DNA o RNA puro y muy concentrado. Exactitud en la medida de la concentración inicial (7 veces). Pipeteo apropiado: dilución del DNA o RNA original hasta concentraciones similares a las muestras biológicas ( ). Estabilidad de las muestras patrón (RNA). 2. Cuantificación Relativa Curva patrón: Sencillez en la preparación. La cantidad de producto (n veces) se refiere a la obtenida en el calibrador (1x). No hay unidades. Se puede utilizar cualquier tipo de patrón para la obtención. 20

21 2. Cuantificación Relativa Puntos críticos de la curva patrón: Dilución adecuada del RNA o DNA patrón. La utilización de las mismas muestras en placas distintas permite comparar resultados. Se pueden utilizar patrones DNA para análisis de RNA. Se necesitan curvas patrón para el gen de estudio y el control endógeno. Cuantificación de la expresión génica Referencia activa: Muestra 1 Muestra 2 Gen problema 4 8 Control endógeno 2 16 ratio Control de la eficiencia de la Retro-transcripción. Control de la eficiencia de la extracción de RNA. Buscar referencias bibliográficas. Utilizar tres endógenos. 21

22 Análisis de expresión CON curva patrón Gen Referencia: GAPDH Gen Estudio: SPP Cantidad relativa Cantidad relativa T0 T7 0.49/ /0.38 Q = gen trat/q norm trat Q gen Ctrl/Q norm Ctrl =Fold Change Cuantificación Relativa La eficiencia de la PCR puede enmascarar resultados. 22

23 Método de Pfaffl (2001) Eficiencia: pendiente de la curva patrón Método de Pfaffl (2001) eficiencia =10-1/pendiente Si la eficiencia es del 100% e=10-1/ =2 23

24 Análisis de expresión SIN curva patrón Método de comparación de C t = 2- Ct Ct= C t, muestra - C t, calibrador C t, muestra : Valor de Ct para una muestra normalizado con el del control endógeno. C t, calibrador : Valor de Ct para el calibrador normalizado con el del control endógeno. Expresión gen/ Expresión basal del gen Expresión endógeno/ Expresión basal endóg =2 - Ct Análisis de expresión SIN curva patrón Método de comparación de Ct Se basa en la eficiencia de los primers Se refiere a la muestra con mayor cantidad de gen de estudio (o menor Ct) Q = e (menor Ct- Ct muestra) e =10-1/pendiente Si la eficiencia es del 100% e=10-1/-3.32 =2 Ejemplo 24

25 2. Cuantificación Relativa PCR Múltiple: Amplificación del gen de interés y el endógeno en el mismo tubo. Reporter: 6-FAM y JOE. Evitar competición en la reacción: Limitar la concentración de primers del gen más abundante. Cuantificación Relativa Elección del método: Estudio del gen de interés y del endógeno en tubos distintos y usar curva patrón: Rápida optimización y validación. Utilización del método 2- Ct : Se necesitan eficiencias de amplificación similares. No necesita curva patrón. Elimina los errores de dilución de la curva patrón. Preferible el método de Pfeffl una vez calculada la eficiencia PCR Múltiple: Más puesta a punto. Mayor rapidez de análisis. 25

26 Aplicaciones de la PCR-TR Glosario de términos. Cuantificación: Absoluta Relativa Determinación de mutaciones. Ensayos +- Polimorfismo de SNPs Sondas alelo-específicas. Utilización de sondas MGB/NFQ: Mayor discriminación. Utilización de oligos alelo-específicos y SYBR Green. Las curvas de disociación discriminan alelos. 26

27 Metodología ryr-1: CTG TGT TCC CTG TGT GTG TGC AAT GGT GTG GCC GTG GC TCC AAC Forward Sonda 12 FAM VIC Reverse CAA GAT CTC ATT ACT GAG AAC TTG CTG CCT GGC CGC Protocolo: Componentes de la reacción Volumen / Reacción ( l) TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG (2X) Final concentración 12,5 1X 40X Assay Mix (Mescla de cebadores y 0,625 1X sondas) DNA 2 Curso PCR ng H 2 O 9, Pre-lectura: 60ºC 1min PCR: 95ºC 10min 92ºC 15sec 60ºC 1min (x50) Post-lectura: 60ºC 1min Resultados CC CT NTC TT 27

28 Aplicaciones de la PCR-TR Glosario de términos. Cuantificación: Absoluta Relativa Determinación de mutaciones. Ensayos +/- Ensayos +/- Se marca el ensayo con sonda TaqMan o SYBRGreen. Adición de un control interno positivo (control de amplificación). Eliminar Falsos Negativos 28

29 Programa: Viernes 14 de enero (9:30 h) Aula Máster: PCR en Tiempo Real (teoría) Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real: Diagnóstico, expresión génica, análisis mutaciones. Ejemplo: Perfiles de expresión génica en scrapie Programa: Miércoles 20 de enero Aula Máster : Práctica: Realización de una PCR en tiempo real. Protocolo experimental: Diseño de primers y sonda (Primer express). Validación de primers. Optimización de la reacción: Matriz de primers Matriz de sonda Curva standard. Normalización de datos de expresión Ejemplo: estabilidad de HKG en scrapie. 29

30 Diseño primers Tamaño amplicon: pb %GC: 20-80% Máximo 2/5 G o C en el extremo 3 Longitud: 9-40pb (mejor 20pb, no se recomiendan longitudes <18pb) Diseño de primers y sonda (Primer express). 30

31 Tm: 58-60ºC Diseño de primers Tm: Tª en la que el 50% de las cadenas está unida y el 50% despegada Si se pega más del 50% más posibilidad de inespecificidades En tiempo real: Tª=Tm Diferencia de Tm entre los dos primers < 2ºC Diseño de primers Primer F: Tm 58ºC Primer R: Tm 60ºC PCR: 60ºC [Primer F] 31

32 Matriz de Primers Primer Forward Primer Reverse 50nM 300nM 900nM 50nM 2X 2X 2X 300nM 2X 2X 2X 900nM 2X 2X 2X Matriz de primers < Ct > Sensibilidad > Rn primers no limitantes 32

33 Diseño de sondas Tm sonda 10ºC > Tm primers Tm 70ºC la sonda se une inmediatamente antes de la mayor eficiencia de la polimerasa GC: 20-80% Longitud: 9-40b (si >30b sonda MGB) Nunca puede haber G en el extremo 5 (quencher natural) <4G continuas Procurar [C]>[G] Matriz de sonda Se realiza tras la optimización de los primers (para ello sonda a 250nM) Utilizar distintas [sonda]: de 25nM a 225nM Componentes de la reacción Volumen / Reacción ( l) Final concentración TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase 12,5 1X UNG (2X) Forward 1 900/300/50 nm Reverse 1 900/300/50 nm Sonda 1, nm H 2 O 8, DNA 1 50 ng Total 25 33

34 Matriz de sonda 250 nm 200 nm < Ct > Sensibilidad > Rn no limitante 150 nm 100 nm 50 nm Recta patrón Gen Referencia Nos muestra la eficiencia de los primers: 34

35 Recta Patrón: Gen de estudio 35

36 Control de la curva patrón Seleccionar el umbral (manualmente) para obtener la mayor correlación (>0.99) Asegurarnos de que las curvas de melting son adecuadas Confirmar que las pendientes de las muestras son iguales en vista logarítmica Eliminar muestras de las diluciones que se entrecrucen Eliminar muestras que se amplifican a Ct<10 La curva debe tener 5 o + puntos Etapas del análisis de expresión Extracción de RNA Retrotranscripción Análisis de la expresión del gen (genes) de referencia Análisis de la expresión del gen de estudio Normalización Análisis de los resultados 36

37 Retrotranscripción El paso más delicado por la baja eficiencia de la enzima Distintas retrotranscriptasas en función del experimento: Expresión génica (MLMv o modificaciones) rtth DNA polimerasa (virus y fragmentos de RNA difíciles) Primers: Random Hexamers expresión Poly(dT) Específico (la eficiencia de la RT dependerá del primer) virus Errores más comunes 1. Mal diseño de primers y sondas: Utilizar software: Obtener la Tm óptima, Evitar complementariedad entre primers, Observar estructura secundaria Atención al tamañio del amplicón Elegir primers en la unión de exones Eficiencia pobre 2. Pobre calidad del RNA: Los amplicones cortos (70-250bp) toleran cierta degradación Para una buena cuantificación, evitar la degradación 37

38 Errores más comunes 3. No utilizar master-mix: Los errores de pipeteo se amplifican Minimiza la variación entre muestres y réplicas Rox en master-mix. 4. Contaminación: Utilizar siempre un NTC 5. No utilizar un RT control Errores más comunes 6. Usar un control de normalización inadecuado: Elegir controles estables Existen referencias bibliográficas en nuestro modelo? 7. No hacer curvas de disociación con SYBR-Green: Podemos cuantificar dímeros o bandas contaminantes 8. No elegir adecuadamente baseline y threshold Baseline: 2 ciclos antes que el Ct de la muestra más abundante Threshold: en fase exponencia (al menos a 10 desviaciones estándar del inicio de baseline 9. Utilizar curvas estándar de rango inapropiado 38