c) método propio Evaluar todos los parámetros posibles, dependiendo del método.
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- María Rosa Carrizo Jiménez
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1 VALIDACIÓN Y CONFIRMACIÓN DE MÉTODOS 0 Veró Itroduccó El objetvo fal de la valdacó de u método aalítco e aegurar que lo reultado de la medcoe e lo aál de ruta e ecuetra lo ufcetemete cerca del valor verdadero (decoocdo) del cotedo del aalto e la muetra. El laboratoro elge lo método de eayo de acuerdo co la reglametacoe vgete (cuado e pertete), de acuerdo co lo requto del uuaro fal (clete), o a requermeto de éte. Ua vez elegdo el método exte tre pobldade: a) Que el método ea ormalzado y e aplque tal cual dce la orma. b) Que el método ea ua modfcacó de u método ormalzado. c) Que el método e haya dearrollado e el laboratoro o e haya obtedo de bblografía. Segú el cao elegdo, el alcace de la valdacó erá dferete: Método Parámetro de Valdacó a) Normalzado repetbldad, veracdad, certdumbre, límte de deteccó ( aplca), carta de cotrol (materal de refereca), partcpacó e eayo de apttud. b) Modfcacó de u Depededo de la modfcacó, e evalúa que parámetro debe er método ormalzado verfcado. c) método propo Evaluar todo lo parámetro poble, depededo del método. ) Parámetro de valdacó. Selectvdad Lealdad Límte de deteccó, Nvel crítco. Límte de cuatfcacó Precó (repetbldad y precó termeda) Veracdad Rago de trabajo Robutez Icertdumbre de medcó Sego Repetbldad Parámetro a valdar egú el método (cao c) Tpo de método Parámetro Compoete Cualtatvo Traza mayortaro Propedad fíca Selectvdad x x x - Lealdad - x depede depede L.de deteccó x x - - L.de cuatfc. - x - - Precó - x x x Veracdad - x x x Rago - x x x Robutez - x x x Icertdumbre x x x x
2 Efecto de la modfcacoe al método de eayo obre lo parámetro de valdacó (cao b) Método de extraccó Selectvdad, veracdad Matrz de la muetra Selectvdad, veracdad, precó, LD, LQ Exteó del rago Lealdad, precó Cambo e el ph Robutez Cambo de operador Repetbldad, veracdad Stema de deteccó Selectvdad, lealdad, rago de trabajo 3) Determacó de lo parámetro de valdacó. 3.) Selectvdad epecfcdad. Segú la técca aalítca utlzada, e hará etudo de electvdad teedo e cueta lo guete: Como e mpractcable coderar toda la terfereca poble, e acoeja etudar lo cao má mportate (que produzca má terfereca) y probable. La electvdad de u método puede expreare cuattatvamete por medo de la razó máxma tolerada (maxmum tolerated rato - Trmáx), que e la relacó etre la cocetracó de terfereca (Ct) repecto del aalto (Ca), que produce u devío e la repueta aalítca que produce u ego e la etmacó de la cocetracó del aalto que cae fuera del tervalo de cofaza que derva del cálculo de la certdumbre expadda. Eto o empre e aplcable ya que prevamete hay que coocer la aturaleza de la poble terfereca para poder realzar el eayo. Llevar a cabo aál de: a) Blaco de reactvo. b) Solucoe de aalto e el olvete adecuado egú la técca y e cocetracoe mlare a la preete e la muetra de eayo. c) Matrz lbre de aalto. (de er ecearo, preparar ua matrz tétca a partr de lo coocmeto prevo de la muetra). d) Matrz co agregado de aalto (uar cocetracoe mlare a b). 3.) Lealdad S correpode, egú el método aalítco, realzar curva de calbracó de acuerdo a lo guete. a) El aalta determa el ámbto leal e fucó de lo coocmeto prevo de la magtud a medr. Ete debe er tal que e la medda de lo poble caga aproxmadamete e el cetro de la curva. b) Aalzar al meo e puto de la curva, cludo el blaco. c) Lo puto deberá etar gualmete epacado. d) Hacer tre replcado de cada puto, e lo poble de maera aleatora. Evaluar la lealdad del método por medo de ua peccó vual de la recta, gráfco de reduo y etadítca de la regreó. E fucó de lo reultado obtedo y de la caracterítca de la muetra, e determará poterormete la etratega a egur e la medcoe de ruta, e decr, el uo de u olo puto, alguo o todo lo puto de la calbracó.
3 Etmacó de lo parámetro de la regreó: Medr la repueta aalítca de lo patroe de cocetracó coocda, por trplcado (=3). Para el cao e que e mde 6 patroe por trplcado, el úmero de vele de dferete cocetracó (p) e 6, y el úmero total de puto de la recta de calbrado (m) e 8. El aál de lo dato, mplca el cálculo de la pedete A y la ordeada al orge B de la recta de regreó, ajutada a la ecuacó y = A x+ B. Lo valore etmado de A y B e calcula medate: Q m ( x x)( y y) xy = A = = Q m xx ( x x) = () B = y A x () dode x e la cocetracó de cada uo de lo m patroe, x e el promedo de la cocetracoe de calbrado, e la repueta e cada puto e y e el promedo de la y repueta de lo patroe de calbrado. Ademá de A y B, e calcula el devío etádar de eto parámetro, medate la guete fórmula: y/ x A = (3) Q xx B = x y/ x m + Q (4) xx edo el devío etádar de lo reduo de la regreó: y/ x = m = ( y y) m (5) dode y e la repueta expermetal a cada patró e y repreeta la repueta etmada e cada puto, o ea, y = Ax + B. Eto parámetro da ua dea de la bodad de la regreó. E deeable que ea lo má pequeño poble, a pear que u valor etá lmtado por el rudo trumetal. La dtrbucó de lo reduo, e decr el modo e que lo valore ( y y) debe er aalzada, hacer u gráfco para ver la adecuacó de lo dato al modelo leal. Obervacó: el coefcete de correlacó, a pear de u amplo uo como dcador de lealdad, reulta egañoo e apropado para ete f, y o debe er uado (ref A3) y / x
4 3.3) Límte de deteccó y cuatfcacó. El límte de deteccó que e la míma cocetracó detectable de maera cofable por la técca, e calcula e fucó del devío etádar de la cocetracó predcha para ua muetra blaco ( 0 ). Para etmar ete valor, e ua la guete ecuacó: y/ x x 0 = + + (6) A m Qxx uualmete e ua =3, como ya e mecoó ate. El límte de deteccó e gual a: LOD = t 0,05;m- 0 El valor t, e obtee de la tabla de dtrbucó Studet: TABLA Dt t cola alfa=0,05 GL t GL t 6,3 3,77,9 4,76 3,35 5,75 4,3 7,74 5,0 8,73 6,94 0,7 7,89 3,7 8,86 7,70 9,83 3,69 0,8 39,68,80 5,67,78 77,66 fto,64 El límte de cuatfcacó LOQ, que e la míma cocetracó cuatfcable e forma cofable, e toma como la cocetracó correpodete a 0 vece el devío etádar: LOQ = 0 0 Por lo que e aegura que el devío etádar relatvo (DSR) para ua cocetracó gual al LOQ ea del 0%, el que e toma como el máxmo DSR aceptable para cuatfcar.
5 3.4) Precó y precó termeda. E coveete (e cao que ea poble) utlzar tre vele de cocetracó (bajo, medo, alto) cubredo el rago de trabajo co u úmero de replcado e cada vel de cocetracó m. E coveete que e ecuetre etre y 5. Se aalza replcado de cada muetra de vel m durate u mímo de 5 día ( p). No e ecearo que ea día egudo. Co eto dato e realza u aál de la varaza (ANOVA) del cual e puede obteer ua etmacó de la repetbldad (precó) y precó termeda, y compararla, coderado lo dferete día como prcpal fuete de varacó. Cálculo de la varaza de repetbldad: S r = edo p = j= z ( z z ) j p ( ) = j= z j (7) la varaza etre día e calcula: S = p = B edo z = ( z z) p p = j= p Sr (8) z j y la varaza de precó termeda e calcula: S = S + S (9) R r B Calcular lo devío etádar de la varaza mecoada, obteedo la raíz cuadrada de la mma. Calcular lo devío etádar relatvo para cada parámetro: RSD RSD SD r r = (0) R z SDR = () z Para comparar la varabldad etre día co la repetbldad, e hace u tet de Fcher: Se calcula la varaza etre día ( ) pero corregr por la repetbldad ( ): E r S = p = E ( z z) p y e calcula e etadítco F: S F = S el valor F, e compara co el de la tabla F para α=0.05 co p- grado de lbertad e el umerador y p-p grado de lbertad e el deomador.(tabla ). E r
6 Tabla Tabla de Fcher alfa = 0,05 GL Num GL De ,5 9,0 9, 9, 9,3 9,3 9,4 9,4 9,4 9,4 3 0,3 9,55 9,8 9, 9,0 8,94 8,89 8,85 8,8 8,79 4 7,7 6,94 6,59 6,39 6,6 6,6 6,09 6,04 6,00 5,96 5 6,6 5,79 5,4 5,9 5,05 4,95 4,88 4,8 4,77 4,74 6 5,99 5,4 4,76 4,53 4,39 4,8 4, 4,5 4,0 4,06 7 5,59 4,74 4,35 4, 3,97 3,87 3,79 3,73 3,68 3,64 8 5,3 4,46 4,07 3,84 3,69 3,58 3,50 3,44 3,39 3,35 9 5, 4,6 3,86 3,63 3,48 3,37 3,9 3,3 3,8 3,4 0 4,96 4,0 3,7 3,48 3,33 3, 3,4 3,07 3,0,98 4,84 3,98 3,59 3,36 3,0 3,09 3,0,95,90,85 4,75 3,89 3,49 3,6 3, 3,00,9,85,80,75 3 4,67 3,8 3,4 3,8 3,03,9,83,77,7,67 4 4,60 3,74 3,34 3,,96,85,76,70,65,60 5 4,54 3,68 3,9 3,06,90,79,7,64,59,54 6 4,49 3,63 3,4 3,0,85,74,66,59,54,49 7 4,45 3,59 3,0,96,8,70,6,55,49,45 8 4,4 3,55 3,6,93,77,66,58,5,46,4 9 4,38 3,5 3,3,90,74,63,54,48,4,38 0 4,35 3,49 3,0,87,7,60,5,45,39,35 4,3 3,47 3,07,84,68,57,49,4,37,3 4,30 3,44 3,05,8,66,55,46,40,34,30 3 4,8 3,4 3,03,80,64,53,44,37,3,7 4 4,6 3,40 3,0,78,6,5,4,36,30,5 5 4,4 3,39,99,76,60,49,40,34,8,4 30 4,7 3,3,9,69,53,4,33,7,,6 35 4, 3,7,87,64,49,37,9,,6, 40 4,08 3,3,84,6,45,34,5,8,, ,03 3,8,79,56,40,9,0,3,07, ,00 3,5,76,53,37,5,7,0,04, ,96 3,,7,49,33,,3,06,00, ,94 3,09,70,46,3,9,0,03,97,93 Ete mmo etudo de comparacó de varaza, puede realzare utlzado la herrameta etadítca de Excel Aál de la varaza de u factor. S el valor F calculado e mayor que el F de tabla, quere decr que hay dfereca gfcatva etre la varaza y eto requere u etudo para aalzar la caua de tal dfereca y u poteror elmacó.
7 3.5) Veracdad Se puede etmar a partr de etudo terlaboratoro, materale de refereca certfcado, o obre materal fortfcado ( Spke ). E cao que e cuete co u materal de refereca certfcado (MRC) e realza u úmero de determacoe del mecoado materal. Cada determacó cluye todo el proceo aalítco. S o e cueta co el MRC, e realza u fortfcado obre ua matrz aalto, o obre ua muetra que cotee aalto, pero deberá realzare el aál ate y depué del fortfcado. Se determa el ego de la guete forma: Sego = X X ref () o expreado como recuperacó: X R = (3) X ref Se evalúa medate ua prueba t la dfereca e etadítcamete gfcatva (α=0,05) t = X X ref ( uref ) + ( ) (4) edo: X ref : Valor del MRC X : promedo de la determacoe expermetale. U ref : certdumbre etádar del valor de refereca. S: devacó etádar de la determacoe expermetale. N: úmero de determacoe expermetale. El valor de t, e compara co el valor tabulado para - grado de lbertad y vel de gfcacó α=0,05. (TABLA 3) TABLA 3 Dt t cola alfa=0,05 GL t GL t,7 3,6 4,30 4,4 3 3,8 5,3 4,78 6, 5,57 7, 6,45 8,0 7,36 9,09 8,3 0,09 9,6,08 0,3,07,0 3,07,8 4,06
8 S el valor del t calculado e meor que el t de la tabla, e cocluye que o hay dfereca gfcatva. S extera dfereca gfcatva, lo reultado de la medcoe e corregrá por el factor correpodete o e decde o corregr, el ego e cotemplará e el cálculo de la certdumbre de la medcó. Ver el procedmeto de cálculo de certdumbre, para la cluó de eto dato e u cálculo, como aí també lo dato obtedo de etudo terlaboratoro. Muetra fortfcada: Proceder de maera mlar, auque e ete cao, hay que calcular la certdumbre de la muetra fortfcada que e calcula combado la certdumbre del certfcado del fabrcate, y la certdumbre debda al procedmeto de fortfcado. Ver procedmeto de cálculo de certdumbre. Recordar que e puede combar certdumbre que tega la mma udade, cao cotraro hay que traformarla e certdumbre relatva, hacer la combacó de la certdumbre, y luego volver a traformarla e certdumbre etádar para aplcar la fórmula (4). 3.6) Rago de trabajo El rago de trabajo queda defdo e fucó del tervalo de valore de la magtud que fue evaluado e lo puto precó y veracdad. 3.7) Robutez Peroal repoable del laboratoro, etablecerá qué parámetro del método de eayo podría er crítco y e realzará eayo co dcho parámetro modfcado. Se realzará ua catdad de eayo (mímo 3) e la codcoe habtuale del método y ua catdad gual de eayo co lo parámetro modfcado. Se calculará la meda y lo devío etádar de ambo grupo de medcoe y e realzará ua prueba t para dfereca de meda. S el valor del etadítco t e mayor que el valor crítco para u α=0.05 y (-) grado de lbertad, e coderará que el parámetro modfcado afecta la medcó. t = X X + (5) t: etadítco t, e compara co el valor de la tabla 3 para (-) GL. S el t calculado e mayor que el t de la tabla, e codera que el factor modfcado afecta a la medcó. Alteratvamete, extera varo factore a coderar, e podrá realzar u aál de la varaza de do o má factore, utlzado u deño factoral. E ete últmo cao, deberá terver peroal co lo coocmeto etadítco adecuado. 3.8) Icertdumbre de medcó Ver cálculo de certdumbre por eparado e otro documeto. 3.9) Sego ver ) Repetbldad ver 3.4
9 4) Iforme de valdacó Se realza u forme de valdacó, e el que e dcará la guete formacó: Alcace de la valdacó: Parámetro a medr (aalto, propedad fíca o químca, ídce, etc), matrz de la muetra y rago de valdacó. Itrumetal utlzado. Detallar lo equpo utlzado y u detfcacó. Detallar otro materale como er matrace, bureta, etc y u correpodete detfcacó. Muetra utlzada, materale de refereca y reactvo dcado el lote empre que ea poble. Peroal volucrado e la medcoe y que realzó el forme de valdacó (ombre y apelldo). La medcoe realzada cluyedo lo regtro que correpoda (por ej cromatograma). E cao de utlzar equpo mlare, epecfcar e qué equpo e hzo cada medcó. Lo reultado obtedo y la cocluoe. Fecha, frma y aclaracó del peroal repoable de aprobar el forme. Refereca () Guía para valdacó de método de eayo. DC-LE-05 V. /06/008 O.A.A. () Harmozed gudele for gle-laboratory valdato of method of aaly. Pure Appl. Chem., Vol. 74, No. 5, pp , 00 M. Thompo et al. (3) A practcal gude to aalytcal method valdato, cludg meauremet ucertaty ad accuracy profle. A Gutavo Gozález, M. Ágele Herrador. Tred Aalytcal Chemtry, Vol. 6, No. 3, 007.
10 INFORME DE VALIDACIÓN ) Alcace: Parámetro a medr: Rago: Matrz: ) Itrumetal utlzado: Equpo: Otro trumetal: 3) Muetra patró, etádare y/o materale de refereca. 4) Reactvo: Droga: Fabrcate: Lote: 5) Medcoe: 6) Reultado: 7) Cocluoe: 8) Peroal volucrado 9) Elaborado por: Fecha: 0) Aprobado por: Fecha:
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