hiperhídricas limita considerablemente la aplicación de métodos de mejoramiento por vías biotecnológicas (Mayor et al., 2001).

Transcripción

1 ASPECTOS SOBRE EL CULTIVO IN VITRO DE GIRASOL ABORDADOS EN EL INIFAT An Juli Rodríguez, Reinldo López, Ynisbel Sánchez, Dymí Pérez, Norm Mrrero, Odlys Pérez, Odlys Llorente y Guillermo Brito. Instituto de Investigciones Fundmentles en Agricultur Tropicl Alejndro de Humboldt (INIFAT), Cub. E mil: jrm@inift.co.cu RESUMEN El girsol se encuentr entre los cutro cultivos oleginosos más importntes del mundo, cultivándose tnto en píses desrrolldos como subdesrrolldos, debido sus bjos requerimientos de producción y por su utilidd, tnto en l limentción humn como niml. Por ello bordr los spectos relciondos con el cultivo in vitro de girsol result importnte, teniendo en cuent demás, que este es un cultivo considerdo reclcitrnte pr ests técnics. En los últimos ños en el INIFAT se relizron estudios sobre l cllogénesis, regenerción direct de plnts, sí como l germinción de embriones inmduros diferentes tiempos de polinizción y conservción de ls semills. Se encontró que el myor crecimiento de los cllos se produjo en el medio constituido por 5 mg/l de BAP y el explnte hipocotilo. L regenerción de los brotes resultó mejor en el medio que contení l menor dosis de AIA y BAP estudid. En el cso de l germinción de los embriones, se determinó que un período de siete dís de permnenci de ls semills en refrigerción estimuló l germinción y el crecimiento de ls plántuls in vitro. En todos los genotipos fue posible l obtención de plántuls los 4 dís de conservds ls semills, sí como su dptción condiciones mbientles. Plbrs clves: girsol, cllogénesis, regenerción direct y embriones INTRODUCCION El girsol (Helinthus nnuus) está entre los cultivos productores de ceite más importntes del mundo. Debido sus bjos requerimientos de producción, lt clidd de ceite, contenido de proteín y utilizción de tods ls prtes de l plnt, su cultivo se h extendido en píses desrrolldos y subdesrrolldos (Škorié, 1992). Se h plntedo que el girsol se encuentr entre ls especies considerds reclcitrntes pr ls técnics de cultivo in vitro (Freyssinet y Freyssinet, 1988), donde l regenerción de plnts complets está influencid por ls condiciones de cultivo, por el genotipo y por sus intercciones. Esto unido l bj cpcidd de regenerción y l ocurrenci de plántuls 83

2 hiperhídrics limit considerblemente l plicción de métodos de mejormiento por vís biotecnológics (Myor et l., 21). El género Helinthus comprende especies con un mplio rngo de rsgos económicmente importntes, sin embrgo, su uso en el cruzmiento del girsol está limitdo por l pobre comptibilidd sexul y l esterilidd de los híbridos interespecíficos (Lprr et l., 1997). Ls técnics de cultivo in vitro constituyen un lterntiv válid con el fin de solucionr este problem. Un ejemplo de ello lo es el cultivo de embriones inmduros el cul es un instrumento poderoso en el mejormiento pr el rescte de plnts obtenids prtir de cruces incomptibles. El cultivo de embriones tmbién puede ser usdo pr obtener línes en un período de tiempo reltivmente corto, con lo que se logr reducir el intervlo genercionl pr l obtención de mteriles selectos de girsol (Aspiroz et l., 1987). Se h plntedo demás, que l resistenci imidzolinons observd en cmpo puede ser verificd en plántuls desrrollds prtir de embriones inmduros (Nestres, 28) Por otr prte George (1993) plnteó que el mteril de plnts puede ser conservdo pr ser usdo con propósitos posteriores, lo que ument su posibilidd de empleo. Esto tmbién h sido borddo por Zorzoli et l., (1996). Además, se hn relizdo investigciones medinte el empleo de diferentes reguldores del crecimiento, sí como con diferentes prtes de l plnt, donde se hn obtenido logros importntes en l inducción de cllos, regenerción y orgnogénesis (Greco et l., 1984; Witrzens et l., 1988; Filippone, 1992; Geneviere et l., 1995; Nestres et l., 1996; Lprr et l., 1997), sí como obtención de vrintes somclonles resistentes Alternri helinthi (Gllenberg et l., 199). A pesr de los resultdos obtenidos debe continurse profundizndo en estos trbjos, y que l estr involucrdos diferentes fctores pr obtener éxito, en ocsiones no hy repetibilidd. Los objetivos de este trbjo fueron: disponer de metodologís pr l cllogénesis, regenerción direct y multiplicción in vitro, conocer ls condiciones necesris pr el estblecimiento del cultivo de embriones, sí como conocer l respuest de diferentes genotipos. 84

3 MATERIALES Y MÉTODOS Cllogénesis: Mteril Vegetl: ápices, hipocótilos, epicótilos, cotiledones y hojs de plántuls del genotipo de girsol: Cburé-15 (C-15), Cubsol-113 (C-113), Cubsol- 83 (C-83) y Cubsol- 65 (C-65), germinds in vitro. Medios de cultivo: Murshige y Skoog, 1962 (MS), modificdos con los reguldores del crecimiento: BAP (1, 5 y 7mg/L), ácido 2,4- Diclorofenoxicético (2,4 -D) (1 mg/l) y Acido indol cético (AIA) (1 mg/l). Evlución: crecimiento de los cllos (g). Análisis estdístico ANOVA pr un diseño fctoril, progrm estdístico STATITCF Regenerción direct: Mteril Vegetl: cotiledones mduros (C-65, C-83, C-113, C-15, híbrido). Medios de cultivo: MS modificdo con AIA y BAP o AIA y Kinetin (6-Furfurilmino purin). Incorporción de AgNO3. Evlución: según Tbl I Cultivo de embriones: Mteril Vegetl: embriones inmduros de diferentes genotipos. Exp.1 (selección del medio): MS (1/2) y MS modificdo con ANA, Kin. y Acido Giberélico o BAP y ANA, los15 dís de polinizdos. Exp. 2: embriones colectdos los 9, 12 y 15 dís en MS (1/2). Evlución: germinción culittiv y presenci de cllos. Conservción de embriones: Mteril Vegetl: cbezuels en nylon, o semills en frscos plásticos. Tiempos de refrigerción de ls semills:, 7, 4, 55 y 7 dís. MS con l mitd de los nutrientes Evlución: % de contminción y germinción, ltur de ls plántuls. En estos csos se empleó ANOVA con un diseño completmente letorizdo desblncedo y Duncn l 5% de significción. 85

4 Tbl 1. Experimentos relizdos pr l regenerción direct EXPEIMENTO REGULADOR GENOTIPO EVALUACION Experimento 1 1 AIA y 2 Kin. 1 AIA y BAP,5 AIA y BAP Cburé-15 Cubsol-113 % regenerción de brotes % formción cllos Subcultivo 1 Idem Cburé-15 % regenerción de brotes, % formción cllos, # brotes / explnte regenerdo., regenerción culittiv (*) Subcultivo 2 Idem Cburé-15 % formción cllos, % brotes hiperhídricos, Experimento 2,5 AIA y BAP,5 AIA, BAP,,34 AgNO 3 Cubsol- 83 Cubsol- 65 Híbrido Experimento 3 MS (1/2) Cubsol- 83 Cubsol- 65 Híbrido % brotes con botones florles * regenerción culittiv: 1: comienzo de regenerción 2: mitd de explntes regenerdos 3: regenerción bundnte % brotes hiperhídricos, % brotes con ríces % brotes con botón florl RESULTADOS Y DISCUSIÓN Cllogénesis Al nlizr el comportmiento de los cutro medios de cultivo estudidos y los cutro explntes, se observron diferencis significtivs tnto entre los medios, como entre los explntes, demás en l intercción entre mbos (Tbl 2). Tbl 2: Análisis de vrinz con el genotipo C-15, cutro explntes y cutro medios de cultivo. S.C. G.L C.M. D.E. C.V. MEDIO 12, * - - EXPLANTE 3,85 3 1,28* - - M x E 3,4 9,38* - - ERROR 11,27 112,1,32 7,3 % Al nlizr l intercción de los medios con los diferentes tipos de explntes (Fig. 1) se encontró que los mejores crecimientos de los cllos se obtuvieron en el hipocótilo y epicótilo del medio que contení 5 mg/l de BAP, sin diferencis significtivs entre ellos, seguidos por el ápice en ese mismo medio y el hipocótilo en los medios con 1 mg/l de BAP y 1 mg/l de AIA. 86

5 Crecimiento de los cllos (g) bcd bc de 1 mg/l BAP 5 mg/l BAP 1 mg/l 2,4-D 1 mg/l AIA b e Hipocótilo Epicótilo Hoj Apice Explntes Fig. 1.- Intercción medio-explnte en el crecimiento de los cllos de girsol En el medio que contení 1 mg/l de AIA, se observó l formción de ríces dventicis en diferentes porcentjes, de cuerdo l tipo de explnte. En el hipocótilo (35 %), epicótilo (23 %) y hoj (11 %). L ocurrenci de ríces dventicis tmbién fue encontrd por Lupi et l. (1987) en cotiledones cultivdos en presenci del mismo reguldor, sí como por Liu (1992) en hipocótilos. En el cso de los ápices se produjo el crecimiento de plántuls con el 75 % de enrizmiento. Al cultivr los nudos en el mismo medio de cultivo hubo desrrollo de plántuls, lo que serí útil pr l propgción de mteriles de interés, y que unque los meristemos picles tmbién hn sido utilizdos por otros utores pr l micropropgción con diferentes reguldores del crecimiento (Lupi, et l. 1987) y se h logrdo l micropropgción trvés de cotiledones mduros (Zorzoli et l. 1996), el empleo de ápices puede ser otr ví utilizr pr estos fines. Tmbién es de señlr, l ocurrenci de lguns plántuls con inflorescenci, cuestión encontrd tmbién por otros utores (Greco et l., 1984; Nestres et l., 1996; Pterson, 1984 y Zorzoli et l., 1996). Según Greco et l. (1984) l florción in vitro de ápices regenerdos prtir de cllo derivdo de diferentes tejidos (segmentos de cotiledones, hojs, hipocótilos y ápices), o directmente de tejidos, pudier ser útil en estudios fisiológicos de florción. Sin embrgo, otros utores lo ven como un specto indeseble y hn reducido l florción premtur l empler un fotoperíodo de 11 hors (Zorzoli et l. 1994). Ls diferencis significtivs que se presentron l estudir los explntes hipocotilo y cotiledón, con cutro genotipos y dos medios de cultivo se presentn en l Tbl 3. 87

6 Tbl 3: Análisis de vrinz con cutro genotipos, dos explntes y dos medios de cultivo. S.C. G.L. C.M. D.E. C.V MEDIO 2,99 1 2,99* - - EXPLANTE 2,94 1 2,94* - - GENOTIPO,82 3,27 NS - - M x E 3,69 1 3,69* - - M x G 7,13 3 2,38* - - E x G 2,13 3,71* - - M x E x G,95 3,32 NS - - ERROR 11,27 144,23,48 43,2 % Tbl 4.- Intercción medio-genotipo y explnte-genotipo en el crecimiento de los cllos de girsol. MEDIOS GENOTIPOS X MEDIA EXPLANTES GENOTIPOS X MEDIA Csol 83 1,51 Csol 83 1,41 Cb b Cb b Csol b Hipocótilo Csol BAP Csol 65.8 c Csol b Csol c Csol b Cb c Cb b Csol bc Cotiledón Csol b 7 BAP Csol bc Csol b Teniendo en cuent l intercción medio-genotipo (Tbl 4), se preció que en los genotipos C- 83 y el C-15 hubo un incremento del crecimiento de los cllos significtivmente superior en el medio donde se ñdieron 5 mg/l de BAP, mientrs que en los genotipos restntes no se presentron diferencis significtivs entre medios. Cundo se nlizron los genotipos en cd medio independientemente se preció que el C-65 en el medio constituido por 5 mg/l de BAP presentó un crecimiento significtivmente inferior contrstntemente. En el medio que contení 7 mg/l de BAP, unque no hubo diferencis entre genotipos, se observó que presentó un vlor superior l resto, o se, que l precer responde mejor concentrciones myores de dicho reguldor del crecimiento. 88

7 Pr muchs especies h sido reportdo que l respuest ls condiciones de cultivo es fectd por el genotipo. En girsol Witrzens et l. (1988), encontrron que el genotipo tuvo efecto sobre el crecimiento de los cllos obtenidos prtir de embriones inmduros, sí como sobre l cpcidd de regenerr de los cultivos. Tmbién Nestres et l. (1998) reportron dependenci del genotipo en l hbilidd de regenerr y plnteron que éste ejerció un efecto pronuncido sobre l respuest morfogenétic del girsol. Con relción l intercción genotipo-explnte (Tbl 4), se evidenció que sólo hubo diferenci significtiv entre hipocótilos y cotiledones en el genotipo C-83, donde el myor crecimiento de los cllos se produjo en el explnte hipocótilo. En el resto de los genotipos no hubo diferencis significtivs entre explntes, unque hubo tendenci l incremento del crecimiento de los cllos obtenidos prtir de los hipocótilos en el cso de los genotipos C-113 y C-65. Al nlizr los explntes seprdmente, no se encontrron diferencis significtivs entre genotipos. Regenerción direct Al nlizr estdísticmente el número de brotes myores de un centímetro por explnte regenerdo (Fig. 2), no se observron diferencis significtivs entre los medios con AIA y BAP, que presentron los mejores vlores. Algo similr ocurrió l nlizr de form culittiv l regenerción, pero en este cso el medio con l menor concentrción de AIA y BAP, tuvo un comportmiento significtivmente superior l resto. L orgnogénesis direct hbí sido obtenid nteriormente en girsol prtir de cotiledones de semills mdurs por Nestres et l., 1996 y Myor et l., 21, sí como en otrs especies por Soneji et l., 2, Ainsley et l., 21, Chturvedy y Bhtngr, 21 y Woo et l., 21. Reg. de brotes c b b AIA/K in. 1 AIA/B AP,5 AIA/B AP brotes/exp. reg. regen. culit. Medios de cultivo Fig. 2.- Número de brotes / explnte regenerdo y regenerción culittiv (1: comienzo de regenerción, 2: mitd de explntes regenerdos, 3: regenerción bundnte) de brotes del genotipo C-15 (subcultivo 1). 89

8 Cundo se nlizó l evlución del segundo subcultivo, se observó que l regenerción continuó desrrollándose más bundntemente en el medio con l concentrción de,5 mg/l de AIA y BAP y el menor porcentje de formción de cllos y presenci de botones florles. En el medio que contení AIA y Kinetin, unque hubo menor porcentje de brotes hiperhídricos, l regenerción fue menos bundnte y el porcentje de formción de cllos fue myor, specto indeseble que debe evitrse cundo se dese que hy estbilidd genétic. En el nálisis de l incorporción de nitrto de plt l medio que hbí ddo los mejores resultdos y el empleo de diferentes genotipos (experimento 2), no se preciron diferencis significtivs entre medios de cultivo, ni entre genotipos, unque se observron mejores resultdos en los medios con Nitrto de plt. Myor et l. (21) hbín plntedo disminución de l presenci de plántuls hiperhídrics y botones florles con el empleo de Nitrto de plt, unque Bker et l. (1999) encontrron que produjo un pequeño efecto tnto positivo como negtivo en l reducción de l hiperhidricidd. Germinción de los embriones inmduros. Se encontrron diferencis significtivs entre los medios de cultivo los 15 dís posteriores l polinizción, donde se preció que mbos genotipos tuvieron vlores significtivmente superiores en el medio M1 con relción l M3 (Fig. 3). Los reguldores del crecimiento empledos en el medio M2 hbín sido utilizdos por Bohorov et l., (1985) con otrs condiciones de cultivo, en el primer reporte de cultivo de embriones exitoso con híbridos interespecíficos de Helinthus, donde demostrron que se podrín obtener plnts de interés pr estudios citogenéticos del género. Germinción b b b b Medio 1 Medio 2 Medio 3 C 15 híbrido Fig. 3.- Germinción de los embriones inmduros de girsol en tres medios de cultivo y dos genotipos los 15 dís posteriores l polinizción. El medio M3 tuvo el inconveniente de formr cllos en l bse de l plántul en un 67 % de los 9

9 csos pr l vriedd C-15 y un 33 % pr el híbrido, lo que demás de fectr l formción de ríces en éste, no es recomendble por l probbilidd de incrementr l vribilidd genétic y no ser beneficioso cundo se dese mntener l estbilidd del mteril (Lrkin y Scowcroft, 1981). Además, se preció formción de cllo en l cso del híbrido en el medio M2 en un 33 %. Sólo no hubo presenci de cllo en ls plántuls del medio M1, que es el que no poseí reguldores del crecimiento en su composición. Este medio tmbién fue el más efectivo en estudios relizdos en otrs vrieddes por Zorzoli et l., Al nlizr l respuest de l germinción de los embriones con relción los dís posteriores l polinizción se observó un comportmiento diferente en lgunos genotipos (Fig. 4). El C-113 y el híbrido presentron un comportmiento similr tnto los 9 como los 12 dís exhibiendo los mejores vlores de germinción sin diferencis significtivs. Los mejores vlores los 15 dís se preciron en el C-15 (Fig. 5). Germinción d d bc cd b b d d b b 9 dís 12 dís 15 dís C- 83 C- 65 C- 113 C 15 híbrido Genotipos Fig. 5.- Germinción de los embriones inmduros de girsol en cinco genotipos diferentes tiempos de polinizción. Este resultdo contrst con lo encontrdo en los estudios de Zorzoli et l., (1994), unque si h sido plntedo por otros utores l influenci del genotipo en trbjos de cultivo in vitro. De est form Witrzens et l. (1988) encontrron que el genotipo tuvo efecto sobre el crecimiento de los cllos obtenidos prtir de embriones inmduros, sí como sobre l cpcidd de regenerr de los cultivos y Nestres et l. (1998) reportron dependenci del genotipo en l hbilidd de regenerr plnts y plnteron que éste ejerció un efecto pronuncido sobre l respuest morfogenétic del girsol. Tmbién se encontró un comportmiento diferencil entre genotipos por Myor et l., (21) en estudios de orgnogénesis de girsol. Tmbién es de destcr que ls plántuls del C-83 los 9 dís fueron muy débiles, mientrs que ls de C-113 es mism edd tuvo plántuls vigoross, pesr de tener est vriedd embriones más pequeños que el resto. 91

10 Al nlizr que tipo de muestr fue l más idóne pr conservr embriones inmduros en refrigerción, se preció que los cpítulos gurddos en bolss de nylon sufrieron un rápid contminción, observándose y los siete dís hongos en los mismos, mientrs que l mntener ls semills suelts, envuelts en ppel dentro de frscos, el tiempo plntedo pudo extenderse, por lo que se utilizó est ví pr relizr el estudio posterior. Cundo se nlizron los porcentjes de contminción teniendo en cuent tres genotipos y tres tiempos de conservción medinte el empleo de ls semills conservds suelts, se pudo precir un incremento de l contminción l umentr los dís de exposición bj tempertur (Fig. 5), con excepción del genotipo C-15, en el que se presentó el myor porcentje de todos los tiempos estudidos, sin hber sido colocdo en refrigerción, lo que pudier deberse un problem no inherente l mteril. Porcentjes C-113 (cont.) 63 1 C-113 (ge rm.) CM-15 (cont.) CM-15 (ge rm.) C-15 (cont.) C-15 (germ.) dís 7 dís 4 dís Genotipos Fig. 5.- Comportmiento de l contminción y l germinción, en tres genotipos los diferentes tiempos de refrigerción de ls semills. En el cso de l germinción (Fig. 5), se observron porcentjes superiores l 72 % en todos los tiempos, encontrándose los vlores myores los 7 y 4 dís, mientrs en el genotipo C- 113 el vlor más elevdo ocurrió los 7 dís. Al nlizr l ltur de ls plántuls germinds en los diferentes trtmientos, se observó que en todos los genotipos l tendenci fue de incrementr los 7 dís de refrigerción. Altur (cm) b bc d cd bc bc e e C-113 C-15 CM-15 dís 7 dís 4 dís Genotipos 92

11 Fig. 4.- Comportmiento de l ltur de ls plántuls, en tres genotipos los diferentes tiempos de refrigerción de ls semills. Zorzoli et l., (1994), en estudios con otros genotipos y otrs condiciones, hbín observdo que prtir de los 43 dís el porcentje de contminción umentb debido l estdo necrótico de los cpítulos, por lo que sugirieron que el período de siembr de los mteriles podí prolongrse hst este tiempo.. Se puede plnter que un corto período de refrigerción (7 dís) estimuló los porcentjes de germinción y ltur de ls plántuls, unque con tiempos myores (55 y 7 dís) tmbién fue posible el crecimiento de plántuls con un desrrollo propido pr l dptción tierr. Se observó en csos isldos l ocurrenci de plántuls hiperhídrics, lo que tmbién h sido encontrdo por otros utores en el cultivo in vitro de girsol (Witrzens, 1988; Nestres, 1996; Myor, 21). En el ctul trbjo se logró l eliminción de este fenómeno l exponer ls plántuls en tubos de ensyo destpds, por 72 hors en cs de cristl, lo que no hbí sido plntedo con nterioridd. Esto contribuyó l climtción de ls plnts, donde csi un 1 % de plántuls se dptó tierr, observándose el mejor comportmiento comprdo con el mntenimiento de los tubos destpdos en el curto de cultivo por 24 hors y después ls plántuls colocds en gu por 48 hors, que hbí sido sugerido por otros utores (Zorzoli, 1996). En este cso l myorí de ls plántuls murieron l ser trsplntds cepellones. Ls plántuls se dptron tierr en cepellones y estuvieron lists pr ser trnsferids l suelo los 1 dís. El desrrollo se llevó cbo en bolss de nylon donde florecieron, y se obtuvieron semills cuyos embriones germinron in vitro. CONCLUSIONES Se desrrolló un metodologí pr el crecimiento de los cllos de girsol, determinándose el mejor explnte (hipocótilo) y medio de cultivo (5 mg/l de BAP) utilizr. Se justó l metodologí de regenerción direct de brotes prtir de cotiledones mduros, reportándose los mejores resultdos en el medio que contení l dosis menor de AIA y BAP. Se justron ls condiciones necesris pr el estblecimiento del cultivo de embriones inmduros, sí como su mntenimiento, encontrándose que un período de permnenci de 93

12 ls semills inmdurs durnte siete dís en refrigerción, estimuló l germinción y el crecimiento de ls plántuls in vitro. Se logró l dptción condiciones mbiéntles y el desrrollo hst l florción de ls plnts obtenids prtir de embriones inmduros. El genotipo jugó un ppel importnte tnto en l cllogénesis, morfogénesis, como el cultivo de embriones inmduros, de los genotipos cubnos de girsol estudidos. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Ainsley, P. J.; F. A. Hmmerschlng; G. W. Bertozzit Collins y M. Sedgley: Regenertion of lmond immture seed cotyledons. Plnt cell, tissue nd orgn culture, 67 (3): , 21. Aspiroz, HS, Vincourt T, Serieys P y Glis A (1987) L culture in vitro des embryos inmtures dns l ccelértion du cycle de sélection des dignées de tournesol et ses effects morphovégétlifs. Heli. 1: Bker, CM, et l., (1999) Plnt Cell, Tissue nd Orgn Culrure. 58: Bohorov, N, Atnssov A y Georgiev-Todorov J (1985) In vitro orgnogenesis, ndrogenesis nd embryo culture, in the genus Helinthus L. Z. Pflnzenzüchtg. 95, Chturvedi, R. y S. P. Bhtngr: High- frequency shoot regenertion from cotyledon explnts of wtermelon cv. Sugr Bby. In vitro Cell Dev. Biol.- Plnt, 37: , 21. Filippone, E, M Leone R Penz (1992) Recent dvnces in cell nd tissue culture. En: Enhncing Reserch on Tropicl Crops in Afric. Eds. G Thottppilly. LM Monti, DR Mohm Rj, AW Morre. 364 pp. Freyssinet, M. y G. Freyssinet: Fertile plnt regenertion from sunflower (Helinthus nnuus L) immture embryos. Plnt Sci., 56: , Gllenberg, P, Espinsse A y Crson M (199) In vitro production of somclonl vrints resistnt to Alternri Helinthi. En: Proceedingns: Sunflower Reserch Workshop.28. Geneviève, J.; R. Bronner y G. Hhne: Somtic embryogenesis nd orgnogénesis induced on the immture zygotic of sunflower (Helinthus nnuus L.) cultivted in vitro: role of the sugr. Plnt Cell Reports. 15: 2-24, George, EF (1993) Plnt propgtion by tissue culture. Prt 1. The technology. 2 d Edición. Greco, B.; O. A. Tnzrel, G. Crrozzo y A. Blnco: Cllus induction nd shoot regenertion in sunflower (Helinthus nnuus L). Plnt Science Letters, 36: 73-77, Lprr, H, Stroev P, Ivnov P y Hhne G (1997) Plnt regenertion from different explnts in Helinthus smithii Heiser. Plnt Cell Rep. 16: Lrkin, PJ y Scowcroft WR (1981) Somclonl vrition novel source of vribility from cell cultures for plnt improvement. Theor. Appl. Genet. 6: Liu, JH (1992) Adventitious rooting in hypocotyls of sunflower (Helinthus nnuus L) Lupi, MC, Bennici A, Locci F y Genni (1987) Plntlet formtion from cllus nd shoot-tip culture of (Helinthus nnuus L). Plnt Cell, Tissue nd Orgn Culture. 11:

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