BIOLOGÍA MOLECULAR DEL MELANOMA
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- Monica Contreras Martínez
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1 BIOLOGÍA MOLECULAR DEL MELANOMA José Luis Rodríguez Peralto DR. JOSÉ LUIS RODRÍGUEZ PERALTO HOSPITAL 12 DE OCTUBRE,
2 UN PROBLEMA DE SALUD IMPORTANTE Tumor maligno muy agresivo (79% muertes por cáncer de piel) En Europa 2.5% de todos los cánceres. 1-2% de muerte por cáncer (5000 muertes por melanoma en Europa cada año) Incremento de la incidencia en las últimas décadas (15 veces en los últimos 50 años). España: 15: habitantes (según zonas) casos nuevos año. No incremento de la mortalidad en la misma proporción (diagnóstico precoz) Pronóstico ominoso en fases avanzadas. Resistencia a la quimioterapia
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4 Distribución del espesor de Breslow mm 1-1.5mm >1.5mm? BRESLOW
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6 BACKGROUND - Los Rayos UV son la causa más importante del MC (Melanoma Cutaneo) - Hipótesis: La variabilidad Clinical en Melanomas quizá sea debida a la diferente susceptibilidad genética de los melanomas a la luz ultravioleta -Método: Comparar las alteraciones genéticas en numero de copias de DNA (CGH arrays) y el status de BRAF y NRAS (PCR) -126 MM (Melanoma) (incluidos en parafina de 7 centros) - 30 MC inducidos por daño solar crónico (cara) - 40 MC no inducidos por daño solar crónico (tronco, brazos y piernas) - 36 MC acrales (palmas, plantas, subungueales) - 20 M mucosos
7 CGH to BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) Pinkel Hibridizati on J. Cruz uses a oligonucleotide platform (Agilent) with sequences (vs 4000 in BACs arrays)
8 Melanomas cutáneos no inducidos por daño solar Gains Losses Amplifications Homozygous deletions Melanomas cutáneos inducidos por daño solar Gains Losses Amplifications Homozygous deletions MELANOMAS DE MUCOSAS Gains Losses Amplifications Homozygous deletions MELANOMA ACRAL Gains Losses Amplifications Homozygous deletions BASADOS EN LAS ALTERACIONES GENÉTICAS, SE PUEDEN CASIFICAR CORRECTAMENTE LOS MELANOMAS EN 4 GRUPOS CON UN 70% DE PRECISIÓN Si hacemos sólo dos grupos: MM que surgen en piel CON daño solar y SIN se pueden clasificar con un 84 % de precisión
9 Genes alterados en lesiones melanocíticas NRAS Q61 BRAF V600E Common Atypical Congenital Common nevus HRAS G12V Blue nevus Halo nevus Spitz nevus Spitz nevus
10 Biología Molecular en el Melanoma : Múltiple Entidades Tumorales ckit BRAF GNAQ BRAF ckit?? CyclinD1 KIT
11 BIOLOGÍA DEL MELANOMA RADIAL VERTICAL METÁSTASIS PROGRESIÓN EN TRES FASES CLINICO-HISTOLÓGICAS RELACIONADA CON ALTERACIONES EN REGULACIÓN DEL CICLO CELULAR Y APOPTOSIS
12 TISSUE-ARRAY (MATRICES TISULARES) Herramienta que permite el estudio simultáneo de numerosas muestras usando las mismas condiciones y criterios Preservación del bloque original
13 RESULTADOS Cada fase en la progresión del melanoma se caracteriza por un pérfil de expresión proteico específico RADIAL VERTICAL METASTASIS Cell cycle Cyc A Cyc D1 CDK1 CDK2 P21 RB prb HDM-2 Adhesion Apoptosis Survivin Transcription factors STAT-1 Membrane receptors C-KIT Caveolin Others Topoisomerase II BMI-1 Caderina E B Catenina p120 Cell cycle Cyc D1 CDK2 p27 MIB-1 Adhesion Apoptosis Survivin Transcription factors MUM-1 PKCB Membrane receptors C-KIT DNA repair MLH-1 Caderina E B Catenina p120 Cell cycle Cyc D1 Cyc D3 CDK6 p16 p21 Apoptosis BCL-2 Transcription factors STAT-1 PKCB MUM-1 DNA repair MLH-1 MSH-2 Others Topoisomerase II RING 1B
14 Activadores de Ciclo Celular NEVUS FASE RADIAL FASE VERTICAL METÁSTASIS CYC- D1 0 % p % p % p % CYC- D3 0 % p % p % p %
15 Inhibidores del Ciclo Celular NEVUS FASE RADIAL FASE VERTICAL METÁSTASIS p16 INK4 100 % p % p % p %
16 Inhibidores del Ciclo Celular NEVUS FASE RADIAL FASE VERTICAL METÁSTASIS p27 KIP 70% p % p % p %
17 Apoptosis NEVUS FASE RADIAL FASE VERTICAL METÁSTASIS SURVIVINA 0% p % p % p % BCL-2 100% p % p % p %
18 Moléculas de adhesión Cada fase del crecimiento del Melanoma se define por un marcador específico Cadherina E B Catenina N Caderina Cadherina E B Catenina B Catenina Nuclear N Caderina Sin diferencias
19 M CELL DIVISION Cyclin A Degradation AUMENTO DE ACTIVADORES DE CICLO CELULAR G2 DNA REPAIR Cyclin B Degradation CDK1 CycA/B G2 G0 p16 P Rb _ Rb CycD CDK4/6 P S DNA REPLICATION CDK2 CycA p14 p27 CDK2 CycE Hdm2 p53 p21 + G1 _ PÉRDIDA DE INHIBIDORES DE CICLO CELULAR
20 TNF TNFR DEATH LIGAND DEATH RECEPTOR APOPTOSIS FADD CASP 3,6,7 CASP 8 NF-kB BID SURVIVIN APOPTOSOMA SMAC C-IAP Surv Bcl-2 CASP9 NF-kB Bcl-6 BCL-2 FLIP Bcl-XL Bcl-XL BAD BAX Cyt C APAF-1 CELL SURVIVAL p53
21 Aplicaciones prácticas de la patología molecular al diagnóstico, pronóstico y tratamiento del melanoma TRATAMIENTO
22 TRATAMIENTO Cirugía: excisión quirúrgica con márgenes de seguridad. Disección ganglionar electiva Extirpación quirúrgica si metástasis aisladas Radioterapia regional Inmunomoduladores farmacológicos Quimioterapia
23 IFN a2b : en melanomas de riesgo intermedio (Breslow 1.5-4mm) o riesgo alto de recidiva sistémica (Breslow >4 mm y/o afectación linfática). Eficacia limitada % mejoría supervivencia libre de enfermedad, pero no disminuye mortalidad. Quimioterapia: en estadios avanzados. Dacarbacina/Temozolomida. Útil en menos del 20% de los pacientes. Respuestas transitorias. IL-2: aprobado para el estadío IV. Útil en un pequeño porcentaje de pacientes. Larga estancia hospitalaria. Toxicidad importante
24 Ningún tratamiento sistémico ha demostrado prolongar significativamente la supervivencia en melanomas metastásicos... En 30 años, no ha habido, hasta ahora, ningún avance relevante que suponga una nueva opción de tratamiento
25 Una nueva era?
26 - Anti B-RAF PLX4032 Vemurafenib Dabrafenib - Anti CTLA-4 Ipilimumab
27 Vemurafenib inhibe kinasa BRAF mutated V600 RAS RTK 50%* of melanomas ATP ATP BRAF V600mut VEMURAFENIB (PLX4032, RG7204, RO ) MEK ERK Cellular Proliferation Cellular Survival *Total V600 mutation rate for BRIM-3 (cobas 4800 BRAF V600 Mutation Test); 9.9% of the cobas-positive cases subjected to retrospective Sanger sequencing had V600K mutations
28 Cell growth and survival The role of BRAF Growth factor Receptor tyrosine kinase Cell membrane RAS-RAF pathway RAS BRAF MEK BRAF is a protein involved in sending signals in cells for cell growth ERK Normal cell proliferation and survival Normal cell growth Nucleus
29 Mutated BRAF The role of V600 Growth factor Receptor tyrosine kinase Cell membrane RAS BRAF mutation A single codon mutation (V600) in the gene for the BRAF protein leaves it switched on Mutated BRAF is present in many cancers: >50% melanomas ~10% colorectal ~8% all solid tumors ERK MEK Abnormal cell growth Excessive cell proliferation and survival Nucleus
30
31 MELANOMA: INIBIDORES DE LA MUTACIÓN BRAF V600E June, 2011 cobas Real-time PCR 50% Melanomas RAS BRAF V600mut RTK ATP MEK ERK VEMURAFENIB Cellular Proliferation Cellular Survival
32 MELANOMA: INIBIDORES DE LA MUTACIÓN BRAF V600E Resistencia y recidivas en la gran mayoría de los pacientes tratados Heterogeneidad de la expresión de BRAF intra / inter-tumoral? BRAF WT BRAF V600E Dr. Santos Briz et al.
33 DISCUSIÓN Revision Literatura: REFERENCE YEAR METHODS CONCLUSION 1 Lin et al. January 2011 single/cell mutation analysis, shifted termination assay, subcloning Intra tumoral heterogeneity 2 Capper et al. May 2011 IHC VE1 and PCR/sequencing Intra tumoral homogeneity 3 Capper et al. October 2011 IHC VE1 and PCR/sequencing Intra and Inter tumoral homogeneity 4 Yancovitz et al. January 2012 MS-PCR, Conventional sequencing, Laser capture microdissection/ SNaPshot technology Intra and Inter tumoral heterogeneity 5 Colombino et al. June 2012 Automated DNA sequencing Inter tumoral heterogeneity 6 Willmot et al. September 2012 Sanger sequencing Intra tumoral homogeneity after treatment with Vemurafenib 7 Long et al. January 2013 IHC VE1, PCR-HRM Sequencing Intra tumoral homogeneity 8 Willmot et al. February 2013 IHC VE1 Intra tumoral heterogeneity 9 Busam et al. March Kristensen et al. May 2013 IHC VE1, Sequenom Mass ARRAY system Quatitative real time PCR, Pyrosequencing Intra tumoral heterogeneity Intra tumoral homogeneity (rare subclones) 11 Boursault et al. August 2013 IHC VE1, Roche PCR Inter and Intra tumoral homogeneity (4.5% discordant)
34 RESULTADOS RT-qPCR Cobas PARES CONCORDANTES % DISCORDANTES % TOTAL Hospital 12 Octubre 26 83,9 5 16,1 31 Hospital Macarena 26 83,9 5 16,1 31 Hospital Salamanca 38 82,6 8 17,4 46 TOTAL 90 83, ,7 108 PARES METAS MULTIPLES CONCORDANTES % DISCORDANTES % TOTAL Hospital 12 Octubre 9 81,8 2 18,2 11
35 RESULTADOS RT- PCR Cobas (18/108) PRIMARIO METASTASIS CASOS DISCORDANTES: Primarios: BRAF MUT : 10 casos Metástasis: BRAF WT : 10 ganglios Primarios: BRAF WT : 8 casos Metástasis: BRAF MUT : 4 ganglios 5 piel/subcutáneo BRAF MUT BRAF WT
36 RESULTADOS RT- PCR Cobas (18/108) PRIMARIO METASTASIS IHQ anti-braf BRAF MUT BRAF WT
37 El análisis estadístico de los datos demuestra que la sensibilidad de la inmunohistoquímica es del 100% y la especificidad del 97%.
38 RESULTADOS RT- PCR Cobas (18/108) PRIMARIO METASTASIS IHQ anti-braf BRAF MUT BRAF WT
39 RESULTADOS RT- PCR Cobas (18/108) IHQ anti-braf (1/18) PRIMARIO METASTASIS PRIMARIO METASTASIS BRAF MUT BRAF WT Paciente con dos melanomas primarios diagnosticados a la vez
40 IHQ anti-braf V600E : expresión homogénea RESULTADOS
41 NEGATIVO POSITIVO DÉBIL POSITIVO INTENSO RESULTADOS MELANOMA PRIMÁRIO METÁSTASIS IHQ anti-braf V600E IHQ anti-braf V600E IHQ anti-braf V600E IHQ anti-braf V600E IHQ anti-braf V600E IHQ anti-braf V600E
42 RESULTADOS RT- PCR Cobas (18/108) PRIMARIO METASTASIS SEC SANGER BRAF MUT BRAF WT
43 RESULTADOS RESULTADOS SEC: RT- PCR Cobas IHQ anti-braf PRIMARIO METASTASIS PRIMARIO METASTASIS V600K V600K V600K V600K V600K V600K V600K V600K V600K V600K V600K V600K V600K V600K
44 RESULTADOS RT-qPCR Cobas PARES CONCORDANTES % DISCORDANTES % TOTAL Hospital 12 Octubre 26 83,9 5 16,1 31 Hospital Macarena 26 83,9 5 16,1 31 Hospital Salamanca 38 82,6 8 17,4 46 TOTAL 90 83, ,7 108 RT-qPCR Cobas IHQ PARES CONCORDANTES % DISCORDANTES % TOTAL Hospital 12 Octubre Hospital Macarena Hospital Salamanca 45 97, TOTAL ,
45 CONCLUSIONES No hay heterogeneidad Intra- o Intertumoral de la mutación BRAF V600E La inmunohistoquimica es un método sensible y especifico para la identificación de BRAF V600E, sin embargo, los casos negativos deberían ser analizados por Cobas o secuenciados (V600K) 50% Mutado IHQ Nativo Tratamiento RT-PCR Mutado Nativo Los métodos de Cobas y SANGER pueden generar falsos negativos, principalmente en muestras con baja celularidad tumoral Tratamiento SEC
46 Tumor Response to Vemurafenib Baseline, 3/15/2011 Cycle 4 Day 1, 6/8/2011 PLX4032 = RG7204 = vemurafenib
47 Metabolic response to treatment with Vemurafenib McDermott U et al. N Engl J Med 2011;364:
48 Vemurafenib treatment: Computer tomography revealed regression of lung, liver and bone metastases following 8 weeks Vemurafenib treatment (with each pair of images shown for a different patient) 1.- Flaherty KT, et al. N Engl J Med 2010;363:
49 Vemurafenib: Inhibiton of BRAF V600 and the MAPK pathway in biopsies of Melanoma 1,2 GF Baseline [2] Day 15 Y-P RTK Y-P Ras GTP BRAF V600 perk emurafenib Zelboraf P P MEK ERK Cyclin D Cyclin D Cell cycle (Ki67) Ki67 1. Ribas A. HemOnc Today: Melanoma Flaherty KT, et al. N Engl J Med. 2010;363: June 1, 2014 page Roche
50 Two Paradigms for Advancing the Therapy of Metastatic Melanoma Immunotherapy Target host Targeted Therapy Target tumor Courtesy Dr. Ribas
51 Anti-CTLA-4 (Ipilimumab) Mechanism of Action T-cell activation T-cell inhibition T-cell potentiation T cell CTLA-4 T cell T cell TCR CD28 TCR CD28 CTLA-4 TCR CTLA-4 APC MHC B7 APC MHC B7 APC MHC B7 IPILIMUMAB blocks CTLA-4 CTLA-4 = cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 Fong L, Small EJ. J Clin Oncol 2008;26:
52 Evolution of Response: Patient Example Screening Week 96 Durable & ongoing response without signs of iraes Week 12 Initial increase in total tumour burden (mwho PD) Week 16 Responding Courtesy of K. Harmankaya, Vienna Harmankaya K, et al. Presented at EADO 2009, Vienna, Austria
53 Proportion alive K-M analysis of survival: Confirmation of Ipilimumab-driven Survival Benefit HR (95% CI) 0.72 ( ) Median OS 11.2 vs 9.1 months P value Ipilimumab + DTIC Ipilimumab + DTIC n=250 Placebo + DTIC n=252 Placebo + DTIC Estimated survival rate, % (95% CI) 1 year 2 year 3 year* 47.3 ( ) 36.3 ( ) 28.5 ( ) 17.9 ( ) 20.8 ( ) 12.2 ( ) *post-hoc analysis Years Number at risk: Ipilimumab + DTIC Placebo + DTIC Robert C, et al. N Engl J Med 2011;364:
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55 Role of PD-1 in Suppressing Antitumor Immunity APC B7.1 CD28 T cell Activation (cytokines, lysis, prolif., migration) MHC-Ag Tumor TCR Signal 1 PD-1 PD-L1 Inhibition (anergy, exhaustion, death) (-) (-) Tumor (-) Keir ME et al, Annu Rev Immunol 2008; Pardoll DM, Nat Rev Cancer 2012
56 Role of PD-1 in Suppressing Antitumor Immunity APC B7.1 CD28 T cell Activation (cytokines, lysis, prolif., migration) MHC-Ag Tumor TCR Signal 1 PD-1 PD-L1 Inhibition (anergy, exhaustion, death) (-) (-) Tumor (-) Anti- PD-1 Keir ME et al, Annu Rev Immunol 2008; Pardoll DM, Nat Rev Cancer 2012
57 Inhibición ckit Imatinib (STI-571, Gleevec ) 4 semanas Hodi et al. JCO, 2008
58 Inhibición ckit: Imatinib Casos aislados, responden ckit mutado N Yamaguchi et al. Clin Exp Dermatol 2010 Mutación K642E ckit
59 Inhibición ckit: Imatinib Solo aquellos pacientes con mutaciones en exones 11 o 13 de ckit responden D Guo et al. JCO 2011
60 CONCLUSIONES La determinación de la mutación de BRAF se puede efectuar bien por RTq PCR o por IHQ Existe una plataforma en España para realizar las determinaciones: Biomarker point Los tratamientos anti CTL4 que activan la inmunidad en el melanoma están bien consolidados Existen varios ensayos con resultados esperanzadores anti PD1 y PDL1 En algunos melanomas se puede utilizar la opción del tratamiento anti CKit
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