ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de Azúcar ISSN:

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1 ICIDCA. Sobre los Dervados de la Caña de Azúcar ISSN: Insttuto Cubano de Investgacones de los Dervados de la Caña de Azúcar Cuba Rbas, Maurco; Lorenzo, Magdalena; Porto, Olga Metodología estadístca para la cualfcacón de equpos de cromatografía de gases ICIDCA. Sobre los Dervados de la Caña de Azúcar, vol. XLI, núm. 3, septembre-dcembre, 2007, pp Insttuto Cubano de Investgacones de los Dervados de la Caña de Azúcar Cudad de La Habana, Cuba Dsponble en: Cómo ctar el artículo Número completo Más nformacón del artículo Págna de la revsta en redalyc.org Sstema de Informacón Centífca Red de Revstas Centífcas de Amérca Latna, el Carbe, España y Portugal Proyecto académco sn fnes de lucro, desarrollado bajo la ncatva de acceso aberto

2 Maurco Rbas, Magdalena Lorenzo, Olga Porto Insttuto Cubano de Investgacones de los Dervados de la Caña de Azúcar (ICIDCA) e.mal: RESUMEN El Laboratoro de Alcoholes y Bebdas (LABEB) del ICIDCA debe trabajar bajo las normas nternaconales de caldad, específcamente la ISO 17025: Se presenta una metodología de análss estadístco y dseño expermental para cualfcar equpos de cromatografía gaseosa. Se muestra una nvestgacón que ncluye la especfcacón de los parámetros de control, cualfcacón del equpamento y método de valdacón. Se hace hncapé en las herramentas utlzadas para determnar la habldad y caldad del sstema para detectar las concentracones adecuadas de propanol en las muestras. Como resultado del estudo se pudo conclur que todos los parámetros de funconamento del equpo de cromatografía gaseosa de LABEB están en los rangos aceptables para su uso. Palabras clave: cromatografía gaseosa, cualfcacón, análss estadístco, rones ABSTRACT The Laboratory of Alcohols and Drnks (LABEB) of ICIDCA must be work under a qualty management of nternatonal ISO 17025: 2006 General requrements for the competence of testng and calbratng laboratores. In ths paper, we present a methodology of statstcal analyss and expermental desgn for gas chromatography equpment qualfcaton. We show specally the nvestgaton about specfcaton parameters control, equpment qualfcaton and method valdaton. We also focus on the tools used follow the profcency and the qualty system for detectng the propanol concentratons n the samples. As a result of ths study we conclude that all parameters of the gas chromatography equpment are n the acceptable ranges for ther use. Keywords: gas chromatography, qualfcaton, statstcal analss, rums 52 ICIDCA No. 3, 2007

3 INTRODUCCIÓN El Laboratoro de Alcoholes y Bebdas (LABEB) del ICIDCA se dedca a supervsar la produccón de rones de caldad para la competenca en el mercado nterno y externo; para esto realza una sere de determnacones analítcas a muestras de rones medante un equpo de cromatografía gaseosa con una columna caplar, gas portador hdrógeno e nyector automátco. La correcta calbracón de equpos tan sofstcados como son los cromatógrafos gaseosos (CG) utlzados en estas determnacones analítcas, es el paso prelmnar en la valdacón de un método analítco (2) y da solucón a uno de los problemas que se presentan en nuestro país para la acredtacón de los laboratoros. Este trabajo propone una metodología de análss estadístco y dseño expermental para calbrar equpos de cromatografía de gases (3). Dcha metodología está basada en la estmacón de todos los ndcadores de caldad que descrben el funconamento del equpo así como su sgnfcacón estadístca y puede ser generalzada a cualquer laboratoro de ensayos químcos que cuente con un equpamento smlar al nuestro. Este trabajo consttuye un aspecto mportante para el cumplmento de las exgencas de las Normas de Caldad, específcamente la ISO 17025: 2006 (1), para la acredtacón de los laboratoros de ensayos o calbracón tenendo en cuenta los requstos esencales de segurdad y efcaca especfcados para brndar servcos analítcos de alta confabldad en un mínmo de tempo. MATERIALES Y MÉTODOS La metodología utlzada en este trabajo ncluye cuatro pasos fundamentales (4, 5): 1. Descrpcón de los prncpales parámetros que caracterzan el funconamento del equpo y son factbles de controlar. 2. Determnacón de las varables de respuestas meddas por el equpo e dentfcacón de los posbles factores que nfluyen en su varabldad. 3. Desarrollo de una estratega expermental con el objetvo de estmar todas las posbles fuentes de varacón en los resultados y evaluar la sgnfcacón de cada una. 4. Con la nformacón recolectada, se realza un análss de los datos basado en la combnacón de métodos descrptvos e nferencales que permten llegar a conclusones acerca de s el equpo está apto o no para su uso. Para aplcar la msma, se empleó un equpo de cromatografía gaseosa de la marca Shmadzu GC-17A que presenta las sguentes característcas: Dspone de una columna caplar SupelcoWax de 60 m x 0.32 d. x 0.5 m con una temperatura de 50 C. Presenta un nyector automátco con una temperatura de 260 C. La nyeccón se realza con dvsón de flujo y en modo splt con una relacón 1:25. Contene un detector de llama (FID) que trabaja a una temperatura de 300 C. Se utlza como gas portador hdrógeno, con un flujo de 1 ml/mn. Tempo máxmo del cromatograma 15 mn. Para controlar el funconamento del equpo, se consderaron los sguentes parámetros (7, 8, 9, 10): Exacttud de flujo (EF): Consste en determnar s exsten dferencas sgnfcatvas entre el valor de flujo del gas portador prevamente fjado 1 ml/mn y los valores meddos medante un flujómetro. Este parámetro se cuantfca medante el cálculo de la desvacón relatva entre el valor promedo de las observacones y el valor fjado prevamente. Se acepta una exacttud de flujo EF< 10 %. F EF = F fjo gas gas fjo Fgas *100 Lnealdad del nyector (LI): Aquí se evalúa la capacdad del equpo para detectar dstntos volúmenes de nyeccón, tenendo en cuenta que el área por debajo de un pco en el cromatograma es proporconal al volumen de muestra nyectado. ICIDCA No.3,

4 Precsón del nyector (PI): Está relaconado con la estmacón de la varabldad de las áreas por debajo de un pco en el cromatograma para dstntos valores observados por un analsta, una muestra e gual volumen de nyeccón. Se aceptan valores del coefcente de varacón cv< 4 %. Precsón del flujo (PF): Estma la varabldad que presenta el tempo de retencón de los pcos cromatográfcos para un volumen fjo de muestra. Se aceptan valores de coefcente de varacón cv< 2 %. Arrastre del nyector (AI): Este ndcador permte evaluar la presenca de resduos de muestra en el nyector producto de alguna defcenca. Se consdera como váldo un por cento de arrastre nferor al 0.1 %. Es una medda del grado en que una sustanca nyectada en un análss, aparece en el análss sguente. Lnealdad del detector (LD): Mde la habldad del detector para reportar lecturas de concentracones de componentes más altas en la medda que se nyecte un volumen de muestra con mayor concentracón del componente, o sea, exste una relacón lneal fuerte entre las concentracones de los componentes nyectados y la respuesta obtenda por el detector. Rudo del detector (RD): Consste en realzar lecturas de cromatograma sn nyeccón de muestra con el objetvo de observar la varabldad exstente en el cromatograma con respecto a una línea horzontal que representa el valor promedo. Derva del detector (DD): En este caso, se mde la dferenca entre la respuesta fnal del cromatograma y la ncal en cuanto a la altura del pco para lecturas realzadas sn nyeccón de muestra en un ntervalo de tempo determnado. Se aceptan valores de Lfnal L nc DD = 60.0* tfnal t nc Exacttud del detector (ED): Evalúa la capacdad del detector para medr la concentracón de un componente determnado en dferentes muestras con gual volumen de nyeccón, pero con concentracones dferentes del componente. Se analzan las dferencas sgnfcatvas entre los valores prefjados de concentracones y las lecturas reportadas por el equpo. En otras palabras, la exacttud del detector se defne como el grado de concordanca entre la señal establecda para la deteccón y la obtenda por el nstrumento. Se expresa como la dferenca relatva entre la concentracón nyectada del componente y la detectada por el equpo. Se acepta una exacttud del detector ED< 10 %. C ED = ny C C ny det *100 Todos estos parámetros son estmados a partr de una solucón donde prevalece un componente. Para realzar el estudo, se decdó trabajar con una solucón de propanol y las respuestas del cromatograma están dadas fundamentalmente en la capacdad del equpo de detectar las concentracones de propanol presente en la muestra. Para realzar los expermentos, se decdó medr el flujo del gas portador antes de realzar la nyeccón con el objetvo de controlar que su valor se mantenga aproxmadamente constante. Otras medcones realzadas son: área del pco cromatográfco correspondente al propanol tempo de retencón del propanol altura del pco y concentracón de propanol detectada Se conoce que algunas de las varables de respuestas menconadas anterormente son sensbles a cambos en el volumen de nyeccón de muestra y la concentracón de los componentes dentro de la nyeccón. En nuestro caso, se decdó realzar la cualfcacón del equpo utlzando una solucón de propanol mezclada con una solucón hdroalcohólca (40 % de etanol y 60 % de agua) varando los sguentes factores en los rangos ndcados: 1. Volumen de nyeccón de muestra: (0.2, 0.5, 1.0) l. 2. Concentracón de propanol en la muestra: (6.0, 18.0, 36.0)g/100 L. Se realzaron tres réplcas de un dseño factoral 3 2 en cuatro bloques aleatorzados de gual tamaño que corresponden a dos seccones de trabajo durante dos días de expermentacón. Este dseño permtó est- 54 ICIDCA No. 3, 2007

5 mar la varabldad producda por causas no controlables como día de expermentacón, seccón de trabajo (mañana, tarde) y réplca de expermentacón. Para cada bloque de expermentos se realzaron tres determnacones del flujo de gas portador que fueron tomadas en tres nstantes de tempo (al nco, en el medo, al fnal). Para evaluar el arrastre del nyector fue necesaro realzar medcones después de haber procesado dferentes condcones expermentales, calculándose en todos los casos el por cento de arrastre. RESULTADOS Y DISCUSIÓN En la fgura 1 se realza el ploteo de caja de bgotes de los valores de concentracón de propanol detectados por el equpo para cada una de las réplcas. El gráfco de la zquerda muestra una menor varabldad de la segunda réplca comparada con las otras dos. Al profundzar en las causas de este comportamento se pudo determnar la exstenca de un error en la ejecucón de dos condcones expermentales que fueron rectfcadas obtenéndose el gráfco de la derecha. Éste muestra cajas de bgotes muy smlares en cuanto a los valores promedos y desvacón estándar entre las tres réplcas con un coefcente de varacón de 2.47 % por lo que este factor aparentemente no tene nfluenca en la dspersón de los resultados. Las concentracones de propanol detectadas por el equpo para el nvel más alto de este compuesto se alejan notablemente del cuerpo de la caja. Este comportamento es lógco tenendo en cuenta que el últmo nvel ensayado es de 36.0 g/100 L, el doble del segundo. Tabla 1. Resultados de las medcones del flujo d e gas portador (ml/mn) Bloque Día Turno FGas FGas FGas Inc Medo Fnal X S CV EF X S CV (%) EF (%) Fgura 1. Representacón gráfca por cajas de bgotes de los datos ICIDCA No. 3,

6 Exacttud de flujo (EF) Otra de las varables meddas en el equpo es el flujo de gas portador. En la tabla 1 se reportan los valores promedos de flujos y coefcentes de varacón para cada bloque de expermentos. En ella se apreca que todos los coefcentes de varacón son menores de 0.5 % reportándose exacttud de flujo nferores al 5 %. Esto se nterpreta como una buena establdad del flujo de gas portador durante las experencas realzadas. Fgura 2. Ecuacón de ajuste regresonal Tabla 2. Resultados de la evaluacón del arrastre del nyector Vol ( L) Conc (g/100l) Tempo Ret. (mn) Área Pco Altura Pco (Mv) Conc g/100l Tabla 3. Resultados de la evaluacón de la lnealdad del detector Conc (g/100l) Vol ( L) Tempo Ret. (mn) Área Pco Altura Pco (Mv) Conc g/100 L Arrastre del nyector (AI) Los expermentos para evaluar el arrastre del nyector después de haber ejecutado dstntas condcones expermentales nos ndcan que las concentracones de propanol detectadas en todos los casos son nferores a 0.5 g/100 L. Esto representa una cantdad de 5*10-9 g/ L de arrastre. Los expermentos que presentaron pequeños arrastres son los que se realzaron después de haber ejecutado una condcón expermental con el volumen máxmo de nyeccón. Lnealdad del detector (LD) Los resultados expermentales que aparecen en la tabla 3 muestran que la concentracón de propanol detectada aumenta lnealmente en la medda en que se ncrementa el volumen de nyeccón desde 0.2 Esto sgnfca una buena capacdad del detector para determnar la concentracón de propanol en dferentes volúmenes de muestras. En la fgura 2 se apreca el modelo cuadrátco con un coefcente de correlacón múltple r 2 = El coefcente correspondente al térmno lneal es postvo confrmando la relacón entre la concentracón de propanol y el volumen de nyeccón explcada anterormente. Exacttud del detector (ED) La exacttud del detector fue evaluada consderando un volumen de nyeccón de 1 L y se varó la concentracón de la nyeccón entre 6 g/100 L y 36 g/100 L. En la tabla 4 se calculan los valores de exacttud del detector, sendo en todos los casos nferor al 10 %. La fgura 3 revela el buen ajuste que presenta el modelo lneal con un coefcente de correlacón múltple superor a El térmno de la pendente del modelo es postvo, ndcando que a medda que se aumenta la concentracón de 56 ICIDCA No. 3, 2007

7 Conc. Prop. Iny. (g/100 L) Tabla 4. Estudo del efecto de varar la concentracón de la nyeccón Vol ( L) Tempo Ret. (mn) Área Pco Altura Pco (Mv) Conc g/100 L ED (%) Fgura 3. Ecuacón de ajuste regresonal propanol en la nyeccón tambén se ncrementa proporconalmente la concentracón de etanol detectada. Por otro lado, el térmno ndependente no es sgnfcatvamente dferente de cero. Análss de varanza multfactoral A contnuacón se procedó a realzar un análss de varanza multfactoral para la varable concentracón de propanol detectada tenendo en cuenta los dstntos componentes de la varanza controlados en los expermentos. Los resultados de la tabla 5 destacan como efectos sgnfcatvos sobre los valores de concentracón de propanol, detectada por el equpo, solamente los cambos de volumen y concentracón de la nyeccón. Este resultado se corresponde con lo esperado por un equpo que funcone correctamente. El análss de resduo ndca que la varabldad de los valores estmados de la concentracón de propanol detectada se mantene constante en todo el rango de concentracones observadas. No exste un patrón que refleje lo contraro. En la fgura 4 se observa que a bajos volúmenes de nyeccón (0.2 L) el efecto de varar la concentracón de propanol en la muestra es muy pequeño en comparacón cuando se trabaja con volúmenes de (1 L). Esto nos dce que utlzar un volumen de muestra de (1 L) es sufcente para detectar las concentracones de propanol en la muestra por el equpo. Tabla 5. Análss de varanza multfactoral Analyss of Varance for LConc - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Rato P-Value MAIN EFFECTS A:Da B:Turno C:Rép D:Vol E:Conc INTERACTIONS DE RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) All F-ratos are based on the resdual mean square error. ICIDCA No. 3,

8 Fgura 4. Ploteo de resduales y gráfco de nteraccón Tempo de retencón Tabla 6. Estadígrafos muestrales de la varable tempo de retencón Día Cant. Desv. Coef. Meda Medana Obs. Estándar Varacón Tabla 7. Análss de varanza multfactoral del tempo de retenc ón Analyss of Varance for Tempo - Type III Sums of Squares Source Sum of Squares Df Mean Square F-Rato P-Value MAIN EFFECTS A: Vol B: Conc C: Rép RESIDUAL TOTAL (CORRECTED) All F-ratos are based on the resdual mean square error. El ANOVA para el tempo de retencón (tabla 7) dentfca como efecto sgnfcatvo solamente a la varacón del volumen de nyeccón. Este resultado es totalmente aceptable puesto que a mayor volumen de nyeccón mayor es el tempo de retencón. La fgura 5 muestra este efecto. Por otra parte, el tempo de retencón presenta un coefcente de varacón nferor al 0.4 % para cada día de expermentacón. Este valor concuerda con el resultado del ANOVA donde la varabldad del tempo de retencón producto de la réplca no fue sgnfcatva. El ploteo de resduales para esta varable no refleja nngún patrón que ndque falta de homogenedad de las varanzas. Análss del dseño de expermento En este punto se evalúa desde el punto de vsta del dseño del expermento la matrz expermental obtenda ncluyendo solamente en el modelo aquellos factores sgnfcatvos. Se obtuvo un modelo empírco de segundo orden con nteraccones que permten correlaconar los valores de concentracón de propanol detectada por el equpo en dependenca del volumen de nyeccón y la concentracón de la nyeccón. Se observa que todos los coefcentes ncludos dentro del modelo son sgnfcatvos (tabla 8) destacándose los efectos lneales de los factores. Por otro lado, el modelo 58 ICIDCA No. 3, 2007

9 Fgura 5. Ploteo de resduales y gráfco de nteraccón propuesto logra explcar el 91.5 % de la varanza total de los datos. El análss de resduos confrmó las hpótess de normaldad de las observacones y además no reveló nngún patrón que ndque falta de homogenedad en las varanzas de las msmas. En la ecuacón que descrbe el modelo todos los coefcentes tenen sgno postvo. Esto confrma el hecho de que a medda que aumente el volumen y la concentracón de la nyeccón tambén aumentan los valores de concentracón de propanol detectados por el equpo. El modelo propuesto tene la forma sguente: z x x y y x y e 2 2 = * * * * * + 2 R = CONCLUSIONES Se mplementó una metodología de dseño expermental y análss estadístco para cualfcar equpos de cromatografía gaseosa. El ANOVA para la varable concentracón de propanol detectada por el equpo señaló como efectos sgnfcatvos los cambos de volumen y concentracón de la nyeccón, no así la varabldad producto de la repetbldad de las condcones expermentales. El ANOVA realzado para la varable tempo de retencón determnó como efecto sgnfcatvo el volumen de nyeccón. Como resultado de la aplcacón de la metodología se puede conclur que todos los parámetros de funconamento del equpo de cromatografía gaseosa del LABEB están en los rangos aceptables para su uso. Tabla 8. Coefcentes del modelo regresonal ajustado a la matrz expermental STAT. EXPERIM. DESIGN Regr. Coeffcents; Var.:LCONC; R -sqr=,91579; Adj:, level factors, 1 Blocks, 27 Runs; MS Resdual=11,55899 DV: LCONC Regressn -95,% Factor Coeff. Std.Err. t(21) p Cnf.Lmt Mean/Interc. 5,490600* 1,463063* 3,752812*,001171* 2,447994* (1)VOL (L) 6,841478*,801353* 8,537413*,000000* 5,174974* VOL (Q) 3,012733* 1,387983* 2,170583*,041575*,126264* (2)CONC (L) 7,945467*,801353* 9,915069*,000000* 6,278963* CONC (Q) 2,934400* 1,387983* 2,114146*,046636*,047930* 1L by 2L 6,799717*,981452* 6,928218*,000001* 4,758674* ICIDCA No. 3,

10 Notacón EF : Exacttud de flujo ml /mn. x : F : Flujo de gas promedo ml /mn. y : gas fjo F gas : Flujo de gas fjado prevamente F (): medante software gas t t : Tempo fnal (mn) A (): t fnal t ncal : Tempo ncal (mn) t : L fnal : Lectura fnal ( mv ) Lt (): L ncal : Lectura ncal ( mv ) Concpro (): t DD : Derva del detector ( mv / h ) Conc ny : z : Concentracón de propanol reportada por el equpo en el expermento (g/100 L) pco Volumen de muestra nyectado en el expermento (ul) Concentracón de propanol de la nyeccón en el expermento (g/100 L) Flujo de gas portador en el nstante de tempo de t. Área del pco cromatográfco Tempo de retencón (mn) Altura del pco cromatográfco Concentracón de propanol en el nstante de tempo t. (g/100l) Concentracón de la nyeccón (g/100l) REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. NC-180 / IEC 17025:2006 Requstos generales para la competenca de los laboratoros de ensayo y de calbracón. 2. NC/TS-368:04. Guía para la valdacón de métodos de ensayos químcos para almentos". Prmera Edcón págnas. 3. Ofcna Naconal de Normalzacón (NC). "Enfoque estadístco del control nterno de la caldad en los laboratoros de ensayo". Edcón en soporte dgtal Dallas, J. Métodos Multvarados Aplcados al Análss de Datos. Méxco: Internatonal Thonson Edtores S.A. de C.V., Castro, M.; Gascón, S.; Pujol, J.; Vcente, I. Valdacón de Métodos Analítcos A.E.F.I., Seccón Catalana, Comsón de Normas de Buenas Práctcas de Fabrcacón y Control, Hoagln, D.; Mosteller, F.; Tukey, J. Fundamentals of Exploratory Analyss of Varance. John Wley & Sons, INC, Rood, D. A Practcal Gude to the Care, Mantenance and Troubleshootng of Capllary GC Systems Okumura, K.; Imamura, Y. Determnaton of anlnes n rver water, sedment, and fsh samples by gas chromagraphy-mass spectrometry. Journal of Chromatography Scence 34: p , NC-ISO Gráfcos de control de Shewhart 60 ICIDCA No. 3, 2007