Caso 1, Patología Molecular en Cáncer Colorectal. Federico Rojo Fundación Jiménez Díaz
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- Paula Ramos Montoya
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1 Caso 1, Patología Molecular en Cáncer Colorectal Federico Rojo Fundación Jiménez Díaz
2 Caso FJD Varón de 64 años, trabajador de la construcción, no fumador, anticoagulado, operado de hernia inguinal hace 12 años En otro centro, septiembre 2013, referido a digestivo por cuadro de un mes de evolución de epigastralgia de predominio nocturno sin relación con la ingesta y hematoquecia. Colonoscopia: A 12 cm del MAE, neoformación de 7cm de longitud con extensión a sigma distal, de aspecto infiltrativo, que ocupa >75% de circunferencia de la luz.
3 Biopsia: adenocarcinoma moderadamente diferenciado.
4 TAC toraco-abdominopélvico con contraste. Hígado: lesiones hipodensas confluentes que ocupan el lóbulo izdo, sugestivas de metástasis. RM DE RECTO: Tumoración excrecente de 6cm de longitud, con signos de afectación transmural y con adenopatías perirrectales Estadio T3bN2aM1, con MRC invadido. Presentado en comité de tumores, se solicita RAS para valoración de tratamiento.
5 Estudio de KRAS mediante Therascreen KRAS RGQ PCR assay Estudio de KRAS mediante Cobas KRAS mutation assay Nanodrop 1000 Spectrophotometer DNA Conc 33.2ng/ul 260/280= /230=1.37 Ct=28.40 Ct=35.11 GGT >GAT, G12D (GLY12ASP)
6 Estudio de KRAS mediante Therascreen KRAS RGQ PCR assay Estudio de KRAS mediante Cobas KRAS mutation assay Nanodrop 1000 Spectrophotometer DNA Conc 23.8ng/ul 260/280= /230=1.65 Ct=25.05 Ct=33.29 GGT >AGT, G12S (GLY12SER) Cobas wt
7 Estudio de KRAS mediante Pyro RAS assay, PyromarkQ24 Extracción de DNA #1 Extracción de DNA #2
8 Ante la discrepancia de resultados entre técnicas y ensayos, y la no confirmación clara de la mutación en KRAS_12, se decide considerar el caso como no mutado en el Comité
9 Tratamiento: 3 meses FOLFOX-cetuximab con muy buena respuesta y tolerancia. Septiembre 2013 Diciembre 2013
10 Cirugía de las metástasis hepáticas de los segmentos II, III y IV. Fibrosis y un área residual de adenocarcinoma.
11 Estudio de RAS mediante Therascreen y Pyro KRAS assays Nanodrop 1000 Spectrophotometer DNA Conc 457.4ng/ul 260/280= /230=2.15 Ct=28.11
12 TAC: Cambios postquirúrgicos hepáticos con imagen de colección que habrá que valorar en la evolución a corto plazo. Neoadyuvancia con capecitabina Cirugía de recto, con pcr
13 Sources of variability in molecular testing Allred, DC. Mod Pathol 2010
14 Preservation of DNA in FFPE archieved tissue samples Buffered 4% Formaldehyde / 10% Formalin minimal prefixation time lag, 2 hours duration of fixation (3 to 6 hours) absolutely avoid low ph No Bouin, No Acid Formaline, No B5, No AZF, No decalcified samples (bone biopsies) Lab A Lab B Lab C Lab E Lab D Rojo, F. SPMM 2011
15 Formaldehyde effects on DNA preservation in tissue samples The formaldehyde initiates DNA denaturation at the AT-rich regions of DNA creating sites for chemical interaction. There are four interactions of formaldehyde with DNA: 1) Formaldehyde is added to the nucleic acid base to form a hydroxymethyl group (-CH2 OH). 2) Slower electrophilic attack of N-methylol on an amino base to form a methylene bridge between two amino groups. 3) Formaldehyde treatment can generate AP (apurinic and apyrimidinic) sites via hydrolysis of the N-glycosylic bonds. 4) Slow hydrolysis of the phosphodiester bonds leading to short chains of polydeoxyribose with intact pyrimidines. Shi, SR et al. J Histochem Cytochem 2002 Gillespie, JW et al. Am J Pathol 2002 Klopfleisch, R et al. Histol Histopathol 2011 Tang, W et al. Cold Spring Harb Protoc 2009 Srinivasan, M et al. Am J Pathol 2002
16 DNA sequence alterations due to formalin fixation in archival specimens FFPE tissues exhibit a high frequency of nonreproducible sequence alteration because of cross-linking cytosine nucleotides on DNA strands. Taq-DNA polymerase fails to recognize the cytosine and incorporates an adenine in the place of a guanosine, creating an artificial C-T or G-A mutation. Error rate is ~12%. Williams, C et al. Am J Pathol 1999 Hofreiter, M et al. Nucleic Acids Res 2001 Akbari, M et al. J Mol Diag 2005 Lamy, A et al. Mod Pathol 2011
17 Low copy number DNA template can render PCR error in a sequence-dependent manner 50% mutant aleles 20% mutant aleles 10% mutant aleles Williams, C et al. Am J Pathol 1999 Hofreiter, M et al. Nucleic Acids Res 2001 Akbari, M et al. J Mol Diagn 2005 Lamy, A et al. Mod Pathol 2011
18 Formaldehyde effects on DNA preservation in tissue samples Up to 1 mutation artifact per 500 bases have been recorded and has been suggested that a higher rate of depurination at lower ph can favor misincorporation of noncomplementary nucleotides Shi, SR et al. J Histochem Cytochem 2002 Gillespie, JW et al. Am J Pathol 2002 Klopfleisch, R et al. Histol Histopathol 2011 Tang, W et al. Cold Spring Harb Protoc 2009 Srinivasan, M et al. Am J Pathol 2002
19 Conclusiones Estandarización de la fase preanalítica de las muestras Confirmación de los resultados de las mutaciones de RAS por métodos alternativos y repetir la determinación en la evolución de la enfermedad Utilización de métodos estandarizados
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