CUANTIFICACION: ABSOLUTA O RELATIVA

Transcripción

1 CUANTIFICACION: ABSOLUTA O RELATIVA ABSOLUTA se determina el Nº exacto de copias extrapolando el valor desde una curva standard o de calibración. Standard: DNA recombinante en un plásmido, DNA genómico, amplicón producto de PCR/ RT-PCR, oligos largos, etc. Se debe amplificar con la misma eficiencia y los valores obtenidos deben ser reproducibles intra e inter ensayos. Muestra de concentración conocida : se diluye desde p ej. desde a 10 2 Se hace la qpcr (triplicados) y se grafica el Ct vs log 10 Nº de copias. Concentración muestra desconocida por interpolación a partir de la regresión lineal y = pendiente. X + b log 10 Nº de copias = Ct y intercept slope Pendiente (slope): es una medida de la eficiencia de la PCR. E = 10-1/slope Cuando E = 2, pendiente es -3,32 b : ordenada al origen (y intercept) da la sensibilidad 26

2 ABSOLUTA Se usa para: conocer la carga viral y monitorear el progreso de una enfermedad, hacer genotipado, discriminación alélica, marcadores de cáncer, detección de OGM (organismos modificados genéticamente), etc. Se informa en alguna unidad. Pej. Nº de copias/ml de sangre o gramo de tejido Ej: Para hepatitis B se puede hacer una qpcr que determina y cuantifica la presencia del virus y la genotipificación del virus mediante las curvas de melting o de disociación. Los productos de la qpcr, se pueden distinguir en la curva de melting si el contenido de G+C es distinto Genotipificación de 20 muestras conteniendo 10 con genotipo B y 10 con genotipo C. La curva de melting para cada genotipo muestra las diferencias. 27

3 La línea Genesig promovida por la casa USBiological te brinda un kit diseñado para la detección y diferenciación de los virus Dengue (detecta los cuatro subtipos sin deferenciarlos), Zika (ZIKA) y el Chikungunya (CHIKV) de manera simultánea.

4 Control exógeno: se agrega para ver que no haya inhibición de la PCR que provenga de la muestra Referencia pasiva: es para normalizar fluctuaciones de fluorescencia debidas al aparato no tiene que ver con la amplificación de un producto 5 FLUORÓFOROS que emiten a distinta longitud de onda 29

5 Cuantificación Relativa : no es necesario una curva de calibración. Se analizan cambios en la expresión de un gen en respuesta a un tratamiento, comparando y relativizando a otro control sin tratar y normalizando con un control endógeno o gen de referencia cuya expresión no cambia en respuesta al tratamiento (gen de referencia o gen house keeping [genes cuya expresión tiene que ver con la supervivencia celular]: actina, proteínas ribosomales, gliceraldehído 3P dh, ciclofilina, etc, ). La normalización con el gen endógeno corrige diferencias en el agregado de cdna a cada tubo, errores de pipeteo, etc. (variaciones de la muestra, sample to sample ) y variaciones cinéticas en la PCR ( run to run ). Tiene que amplificarse con la misma eficiencia sino se cometen errores. CONTROLES - negativo (sin muestra): para controlar contaminación de los reactivos, ver dímeros de primers. - control sin retrotranscribir (si el molde inicial es RNA): para controlar contaminación con ADN - control positivo: si es necesario controlar la presencia de inhibidores de la pcr (sales biliares, heparina, hemo, son inhibidores) se hace agregando un fragmento conocido (puede ser en otro tubo que se amplifica en paralelo) o amplificando 30 un gen endógeno.

6 IMPORTANTE!! 1) El housekeeping debe tener expresión invariable con el tratamiento (actina, prot. ribosomales, etc) 2) El requerimiento para usar este método es que el gen de referencia y el gen de interés tengan la misma eficiencia, sino se cometen errores. 31

7 Si las eficiencias de amplificación no son iguales, tenemos que aplicar la corrección por la eficiencia cinética de la PCR Starting quantity (pg total RNA) Fold change = (E target) ΔCt target / (E normalizador) ΔCt normalizador E = 10 [-1 /slope] ΔCt target = Ct GI cal - Ct GItrat ΔCt normalizador = Ct norm cal- Ct norm trat 32

8 ASA PCR o ASP (allele( allele-specific amplification): permite detectar mutaciones de una simple base en un DNA dado En la PCR el último y penúltimo nt del extremo 3 del primer determinan que ese primer sea extendido por la polimerasa. En eso se basa la ASA PCR para distinguir alelos que tienen cambios en un aminoácido. LA MUTACIÓN QUE SE ANALIZA ESTÁ EN EL EXTREMO 3 DE UNO DE LOS CEBADORES Es importante que la polimerasa no tenga actividad correctora de pruebas (3-5 ). Cada alelo se amplifica en un tubo distinto usando el primer que distingue el alelo y otro que anille en una región conservada. Los oligos deben tener una longitud de nt (de esa forma el mismatch tiene mayor influencia sobre la T annealing). Además en ese tubo si se amplifica también un control interno que puede ser otra secuencia del gen que esté conservada en los dos alelos es un buen control porque la ausencia de amplificación ya nos está dando un diagnóstico. Los individuos pueden ser homocigotas o heterocigotas para los alelos amplificados. Ejemplos: -Determinación de Apolipoproteína E en dislipidemias: existen 3 alelos distintos ApoE2, E3, E4 que tienen aa cambiados en las posiciones 112 y 158 de la proteína. El alelo E4 confiere mayor riesgo de enfermedades cerebro vasculares. 33

9 Fibrosis quística es una enfermedad autosómica recesiva. Mutaciones en el Gen regulador de la conductancia transmembrana de la Fibrosis Quística (CFTR): codifica una proteína (1480 aa) que funciona como un canal de cloruro. Mutación más frecuente en Argentina F508, es una deleción de tres pares de bases (CTT) en el exón 10 que resulta en la pérdida de un aminoácido (fenilalanina) en la posición 508 de la proteína. Se puede diagnosticar por PCR alelo específica. Asa PCR para fibrosis quística: Se realizan dos pcr que difieren en el par de primers utilizados. Una de ellas con el par ALN/C16D y la otra con el par F508/C16D. La secuencia de los primers utilizados es: ALN: 5 GGCACCATTAAAGAAAATATCATCTT CTT 3 C16D 5 GTTGCCATGCTTTGATGACGCTTC 3 (Primer común) F508 5 GGCACCATTAAAGAAAATATCATTGG 3 El tamaño del fragmento amplificado es de 76 pb para el par de primers con F508 y tiene una diferencia de 3 pb con el fragmento amplificado con los primers del ALN). Esta diferencia de 3 pb sólo se puede apreciar en geles de buena resolución como el gel de Poliacrilamida. Homocigota Normal: tendrá sólo la banda correspondiente al tubo amplificado con el primer ALN. Homocigota mutado: sólo se verá la banda correspondiente al tubo amplificado con el primer F508. Heterocigota Mutado: ambas bandas que diferirán en la posición del gel en 3 pb. 34

10 ALN : Alelo normal; F508 :alelo enfermo Región conservada: Primer común (PC) ADN ALN 3 5 GGCACCATTAAAGAAAATATCATCTT CTTTGGTGG.... GAAGCGTCATCAAAGCATGGCAAC ADN F508 5 GGCACCATTAAAGAAAATATCATTGG TGG..... GAAGCGTCATCAAAGCATGGCAAC 3 1) ADN paciente OligoALN y PC 2) ADN paciente Oligo F508 y PC OligoALN 5 GGCACCATTAAAGAAAATATCATCTT CTT Oligo F508 5 GGCACCATTAAAGAAAATATCATTGG TGG 3 5 Persona con alelo normal OligoALN: GGCACCATTAAAGAAAATATCATCTT CTT CCGTGGTAATTTCTTTTATAGTAGAA PC Persona con alelo mutado OligALN:GGCACCATT AAAGAAAAT ATC AT CTT 3 CCGTGGTAA.TT TT.TCT.T.T.TATAGTA.ACC PC 3 5 Normal Heteroc Homoc.mutado pb 79pb 76pb 76pb 35

11 PCR ANIDADA (NESTED PCR) Se usan dos pares de primers que anillan sobre un fragmento pero que deben tener distintas temperaturas de melting, de forma tal que durante la primer PCR los primers internos no se anillan porque tienen temperatura más baja y no se pegan al molde. Aumenta la sensibilidad y especificidad de la determinación porque se vuelve a reamplificar la secuencia con otro par de oligos internos 36

12 Ej. de nested PCR en un solo tubo 1) Amplificación del fragmento largo Tm de los primers externos= 80ºC ciclos con una PCR de dos temperaturas: desnaturalización a 94 ºC - 20 ; anillado y extensión a 72ºC-30. [Concentración primers externos 0.1 microm] 2) Amplificación del fragmento largo con los primers residuales y inicio de la amplificación del fragmento corto. Tm de los primers internos= 50 ºC 16 ciclos con una PCR de tres temperaturas desnaturalización 94 ºC - 20 anillado ºC con reducción de 2 ºC en cada ciclo hasta llegar a la Temp de los primers internos; extensión a 72 ºC [Concentración primers nested 0.4 microm] 3) ciclos con una PCR de tres temperaturas desnaturalización 88 ºC - 20 (para que se desnaturalice completamente sólo el fragmento nested, la menor temp de desnat. resulta en mayor rendimiento ). anillado ºC, extensión a 72 ºC

13 PCR ASIMÉTRICA Permite generar ADN de cadena simple para usarlo como sonda o como templado para las reacciones de secuenciación, se usan dos primers diferentes pero uno es completamente consumido durante la amplificación y se amplificará la hebra del primer restante. Cuando queda un solo primer el proceso de amplificación ya no será exponencial sino lineal y la cantidad de producto que se obtiene es mucho menor. PCR 50:1 o 100:1 primers (15-20 ciclos de amplificación exponencial) amplificación se vuelve lineal para una hebra Precipitar ADN con AcNH 4+ 2M - 50 % Isopropanol (para concentrar el ADN y eliminar dntps y exceso de primer) Ej. Si quiero obtener la hebra Top, PB genera molde en los primeros ciclos y cuando se agota PB, el PT genera la hebra Top Top Bottom 5 3 PT50 PB

14 PCR INVERSA Se pueden amplificar fragmentos de ADN de secuencia desconocida,, que están flanqueando un fragmento de secuencia conocida.. Se diseñan los primers en el sentido inverso ( ) a la PCR standard ( ) -se digiere el ADN del organismo que tiene la secuencia conocida (pej., una mutante obtenida por inserción de un transposón) con una enzima de restricción X. -se circularizan los fragmentos a través de ese sitio con ligasa -se diseñan los primers sobre la zona conocida pero en dirección opuesta. El templado va a ser el ADN digerido previamente, se amplifica y se obtiene un fragmento que contiene las secuencias desconocidas unidas por el sitio de restricción X. Funciona bien para genomas menores a 10 9 pb. -el sitio de restricción X lo podemos identificar haciendo un southern en el que usamos como sonda la región conocida, y si obtenemos un fragmento de 1 a 4 kb que será el que vamos a amplificar. -La amplificación es más eficiente con ADN lineal que circular, se puede cortar con una enzima (Y) que corte en la secuencia conocida y no en la desconocida. La PCR inversa es muy útil para recuperar el sitio de integración de transposones, virus, transgenes, etc, o para generar sondas en caminatas cromosómicas 39

15 X X X Y Y 40 40

16 RACE 5 5 (rapid amplification de extremos 5 ) 5 Cuando se preparan bibliotecas de cdna se pueden obtener cdnas que son más cortos por lo general debido a estructuras secundarias del RNAm y que carecen del 5. cómo podemos obtener la secuencia completa para clonarla? (a) En la región que conocemos diseñamos un primer específico reverso que se extiende con TR y llega hasta el 5 cuya secuencia no conocemos. Para amplificarlo por PCR, como no conocemos ese 5, se agrega un tallo homopolimérico (p.ej. C) con transferasa terminal, y luego se hace la PCR con un oligodg que tiene un sitio de restricción para poder clonar el fragmento amplificado. ( También se puede ligar un primer (b) Desventaja: como la especificidad está basada en un solo primer se pueden obtiener productos inespecíficos. a b 41

17 RACE 3 3 Cuando no se clonó el 3 p.ej en las bibliotecas de cdna preparadas con N6 se puede hacer 3 RACE si conocemos un fragmento de secuencia central 42