Investigación de métodos compatibles con la agricultura ecológica para el control del Gusano cabezudo (Capnodis tenebrionis (Linnaeus, 1758))

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1 Investigción de métodos comptibles con l gricultur ecológic pr el control del Gusno cbezudo (Cpnodis tenebrionis (Linneus, 1758)) Mdrid, 2012

2 MINISTERIO DE AGRICULTURA, ALIMENTACIÓN Y MEDIO AMBIENTE Edit: Ministerio de Agricultur, Alimentción y Medio Ambiente Secretrí Generl Técnic Centro de Publicciones Ctálogo de Publicciones de l Administrción Generl del Estdo: NIPO: Coordinción: Subdirección Generl de Clidd Diferencid y Agricultur Ecológic, Dirección Generl de l Industri Alimentri (Ministerio de Agricultur, Alimentción y Medio Ambiente) PROYECTO: AEG C4-1 EQUIPO PARTICIPANTE INVESTIGADOR PRINCIPAL: Instituto Ncionl de Investigción y Tecnologí Agrri y Alimentri (INIA). Grupo de Entomologí Agroforestl Mnuel González Núñez PERSONAL INVESTIGADOR: Instituto Ncionl de Investigción y Tecnologí Agrri y Alimentri (INIA). Grupo de Entomologí Agroforestl José Rfel Estebn Durán, Guillermo Cobos Hernández An Cobo Romero Junt de Extremdur. Centro de Investigción Agrri. Finc L Orden - Vldesequer (Bdjoz) José Del Morl De l Veg Frncisco Pérez Rojs Modesto Senero Fernández Jesús De L Cruz Blnco Antonio Guisdo López Universidd de Jén. Deprtmento de Químic Inorgánic y Orgánic Antonio Ortiz Hernández Frncisco Hidlgo Rosles Universidd de Córdob. Lbortorio de Entomologí Agroforestl, Deprtmento de Ciencis y Recursos Agrícols y Forestles Enrique Vrgs Osun Hni K. Aldebis Rfel Ortiz Grcí Consejerí de Agricultur y Agu de l Región de Murci. Oficins Comrcles Agrris Jvier Melgres de Aguilr Cormenzn Dvid González Mrtínez Centro de Agricultur Ecológic y de Montñ. CAEM. INIA Plsenci (Cáceres) Igncio Armendáriz González 2

3 ÍNDICE 1. Introducción Descripción del problem Posible plicción de herrmients de prevención y control de C. tenebrionis en fruticultur ecológic Objetivos del proyecto Actividdes relizds y resultdos Evlución de brrers físics y repelentes pr l prevención del tque de C. tenebrionis (grupo INIA) Recogid de dultos en el cmpo y mntenimiento en el lbortorio Ensyos de evlución de brrers físics Ensyos de repelenci/disusión de superficies trtds con colín y/o ceites esenciles Evlución en lbortorio de l repelenci y/o toxicidd de vrios trtmientos sobre l diet nturl y su posible efecto sobre l longevidd y fertilidd de los insectos Investigción y puest punto de entomoptógenos pr el control biológico de C. tenebrionis (grupos de Córdob y Bdjoz) Aislmiento de entomoptógenos (grupo decórdob) Obtención de los inóculos (grupo Universidd de Córdob) Bioensyos de ctividd insecticid de isldos de Beuveri bssin (grupo Universidd de Córdob) Investigción y puest punto de entomoptógenos pr el control biológico de C. tenebrionis (grupo de Bdjoz) Investigción de l eficci de trmps refugio pr cptur de dultos invernntes de C. tenebrionis. (grupo de Bdjoz) Determinción de los refugios de invernción de los dultos de C. tenebrionis en plntciones de frutles prsitdos por el insecto. Cptur de dultos Ensyo pr comprobr el poder insecticid de vrios insecticids medinte pulverizción y espolvoreo contr dultos de C. tenebrionis (L.) Mejor de l diet rtificil utilizd comúnmente pr l limentción rtificil de lrvs de C. tenebrionis Ensyo pr vlorr l eficci de tres trtmientos contr lrvs neonts de C. tenebrionis en el suelo Estudio de semioquímicos implicdos en el comportmiento de C. tenebrionis. (Universidd de Jén) Aislmiento e Identificción de componentes volátiles emitidos por hospedntes vivos, con lo que conseguimos un perfil volátil rel emitido por especies del género Prunus Bioensyos de compuestos cndidtos inducir un comportmiento determindo entre individuos dultos. Ensyos de ren y/o túnel de viento

4 Ensyos de cmpo con trmps cebds con distintos compuestos/mezcl Identificción de componentes presentes en distints prtes de los dultos mcho y hembr de C. tenebrionis Instlción en cmpo de distintos componentes y mezcls procedentes de insectos y hospedntes. Uso de distintos diseños de trmps, utilizndo l vrible cromátic como posible punto crítico Agrdecimientos Conclusiones Publicciones y otros trbjos de difusión de los resultdos

5 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Descripción del problem El coleóptero Cpnodis tenebrionis (Linneus 1758) (Buprestide), conocido comúnmente como gusno cbezudo, constituye un de ls plgs más importntes de los frutles de hueso y en menor medid de los frutles de pepit en todo el áre mediterráne. En Espñ los dños más considerbles se citn en cerezo, lbricoquero, lmendro, melocotonero y ciruelo y su incidenci es especilmente importnte en ls zons mediterránes de cultivo (Levnte, Bleres y Andlucí), en el Norte de Extremdur y ocsionlmente en Argón. El dño lo producen por un prte los escrbjos dultos (Figur 1) en los brotes tiernos principlmente, de los que se limentn durnte todo el periodo ctivo, royendo l cortez, yems y peciolo de ls hojs, que cen l suelo denuncindo su presenci. Aunque en árboles grndes estos dños suelen ser pequeños; en árboles jóvenes l defolición de los mismos, durnte el verno, lleg comprometer serimente su vid. Pero el dño más importnte es el que provocn ls lrvs (Figur 1) l limentrse de ls ríces y el cuello de los frutles: los dultos hcen l puest en el suelo en l zon cercn l pié de los árboles y l lrv penetr hst encontrr ls prtes subterránes de los árboles, de ls que se liment formndo glerís en l zon subcorticl. A veces, según como el insecto vy destruyendo los hces vsculres del frutl, éste v presentdo un nticipd decrepitud, bien lterl o bien totl, terminndo por morir premturmente (Figur 1). Hy numeross cits de plntciones enters destruids por este insecto y l incidenci es myor en plntciones de secno, y que l humedd del suelo es un fctor limitnte de l plg l producir l muerte de huevos y lrvs neonts. De hecho es en los ños de sequí cundo dquiere myor importnci l plg. L plicción de riegos mnt y ls lbores de suelo ern considerds práctics eficces pr prevenir l plg. En ls moderns plntciones de riego loclizdo, donde el suelo permnece seco y sin lbrr junto l tronco de los árboles, el problem tom un relevnci importnte. Figur 1. Izquierd: Cpnodis tenebrionis: dulto (rrib) y lrv (bjo). Derech: síntoms/dños, lmendro muerto en plen vegetción. El periodo de ctividd de los dultos se extiende lo lrgo de tod l primver, el verno y el otoño. Ls poblciones de dultos están constituids por los insectos invernntes y los recién slidos del suelo. Ls observciones relizds permiten concluir que los dultos invernntes emergen del suelo desde finles de julio hst medidos de septiembre (según ls zons) y el 5

6 periodo de puest v desde mitd de primver hst el finl del verno. Ls lrvs suelen completr el ciclo en dos ños. Los periodos tn lrgos de ctividd y puest en los dultos y los hábitos endófitos y subterráneos de ls lrvs hcen que se extrordinrimente difícil controlr con eficci est plg. Si los problems ocsiondos por el Gusno cbezudo son muy grves pr csi l generlidd del sector de cultivdores de frutles de hueso, lo es todví mucho más en el cso de plntciones con sistem de producción ecológic, y que l no estr permitido en este sistem l utilizción de insecticids de síntesis, no hy disponible ningun estrtegi de control. En l ctulidd los métodos disponibles pr el mnejo de l plg incluyen: ) Métodos indirectos o de prevención: Quem del mteril vegetl fectdo. Uso de lámins de polietileno enterrds en torno l bse de los árboles pr impedir l penetrción de ls lrvs. Riego mnt de los árboles con riesgo de tque pr evitr l puest y destruir huevos y lrvits. En ls plntciones de riego loclizdo, mntenimiento de l humedd en l bse del tronco de los árboles durnte el periodo de puest. b) Métodos directos de control: Trtmientos químicos contr los dultos: consiste en plicr en pulverizción un insecticid sobre l cop de los árboles en ls épocs en que éstos cuden comer del follje. Se recomiendn dos trtmientos, uno en primver (myo, junio), cundo los dultos invernntes cuden comer ntes de hcer l puest y otro en otoño (septiembre) contr los de l nuev generción. Según l litertur los insecticids más indicdos son los ctivos por ingestión, principlmente fosfordos y crbmtos. L myorí de estos productos y no están utorizdos, ni siquier en los sistems de producción convencionl. Trtmientos químicos contr ls lrvs: trtndo el suelo en l zon próxim l pie con insecticids medinte espolvoreo o pulverizción. El momento idóneo pr est plicción es el de l eclosión de ls puests, que suele ser desde principios de julio hst medidos de gosto. De los productos recomenddos en l bibliogrfí pr estos trtmientos (lindno, chlorpyrifos isofenfos + foxim, cipermetrin, fipronil) l myorí y están fuer del registro y ninguno de ellos es comptible con l Agricultur Ecológic. Dd l dimensión del problem y l creciente implntción de sistems de producción ecológic de frutles, se hce necesrio el desrrollo de métodos lterntivos l uso de insecticids de síntesis que controlen con eficci est plg Posible plicción de herrmients de prevención y control de C. tenebrionis en fruticultur ecológic. Control biológico Debido l dificultd de controlr est especie con insecticids químicos, se hce necesrio el desrrollo de lterntivs biológics. Se hn citdo lgunos prsitoides y depreddores nturles de est especie, pero prece que su ppel es secundrio y por si mismos no son cpces de controlr l plg. El uso de ptógenos es un técnic vible en l luch contr plgs que está lcnzndo cd vez myor vlor por trtrse de medids de control respetuoss con el mediombiente y que colborn l sostenibilidd de los ecosistems. Debido que los hongos y los nemtodos entomoptógenos penetrn en el insectos huésped trvés del tegumento y que muchos de ellos utilizn el suelo como sustrto de supervivenci e invsión, mbos grupos pueden ser 6

7 cpces de prevenir l colonizción de ls ríces por ls lrvs neonts de C. tenebrionis y, por tnto, evitr los dños cusdos por est especie. Uso de semioquímicos L presenci de compuestos semioquímicos se h estudido en numeross fmilis de coleópteros. Entre los distintos tipos de feromons, existen ls de gregción, que son emitids por un sexo (normlmente los mchos) y que sirven como señl pr sus conspecíficos de mbos sexos induciéndoles un comportmiento gregtivo, con l finlidd de protegerse, reproducirse, limentrse o un conjunto de ells. Ls feromons sexules son emitids por un sexo e indicn l otro sexo l loclizción de potenciles prejs pr l cópul. Ests suelen ser emitids por ls hembrs, cundo se trtn de corto lcnce o contcto (comunes en Cermbícidos). En el cso de ls de lrgo lcnce, veces son emitids por los mchos. En generl, el mecnismo químico de l gregción suele ser mucho más complejo que el que sólo induce un comportmiento sexul; y que suelen interctur mezcls multicomponente de metbolitos secundrios procedentes de plnts y los procedentes de los propios insectos. El uso de estos semioquímicos pr mnipulr el comportmiento de coleópteros ofrece muchs posibiliddes en el control de plgs medinte vris estrtegis como el trmpeo msivo, confusión sexul (mting disruption) y progrms Push/Pull. Estos tryentes tmbién pueden utilizrse pr estudir los movimientos de plgs hci zons de riesgo en el cso de insectos con vuelos de mplio recorrido (monitoring). En especies que se gregn en grn número, como podrí ser el cso de C. tenebrionis, según observciones en cmpo, el trmpeo msivo medinte un tryente efectivo podrí tener un grn impcto gronómico pudiendo ser un técnic vible como herrmient pr el control de ls poblciones de este bupréstido. Esto y se h conseguido por ejemplo en escolítidos. En el cso de que C. tenebrionis utilizr un feromon sexul, tmbién se podrí usr ést medinte l estrtegi de trmpeo msivo. A pesr de los trbjos y estudios relizdos en vris fmilis de Coleópteros, no existín ntes de este estudio referencis sobre l existenci y el tipo de posibles feromons utilizds por ls especies de l fmili Buprestide. Sólo existí un referenci de un feromon emitid por ls hembrs de Agrilus plnipennis, unque tmbién está presente en ls emisiones de los mchos. Este desconocimiento obligb trtr el estudio desde diferentes estrtegis pr estudir los distintos tipos posibles de feromons. Por ello se propuso llevr cbo dos estudios prlelos pr trtr de determinr l existenci de feromons de contcto (feromons sexules de corto lcnce), y por otro ldo feromons sexules o de gregción de lrgo lcnce. Uso de brrers físics El uso de lámins de polietileno enterrds en torno l bse de los árboles hbí sido propuesto como otr posible form de prevenir los tques de ls lrvs C. tenebrionis. Los dultos hcen l puest, pero ls lrvs no logrn lcnzr l prte subterráne del árbol y mueren. Aunque el coste en mno de obr hce que este método se difícilmente plicble en ests plntciones de secno, como el lmendro, donde los márgenes económicos son muy reducidos, si tendrí posibilidd en cultivos más rentbles como ciruelo, lbricoquero, cerezo y melocotonero. Por ello er de interés estudir est estrtegi de cr integrrl en el mnejo de l plg, estudindo l eficci de distintos mteriles hoy disponibles. Uso de repelentes El hecho de que C. tenebrionis relice l puest en l bse del tronco o en l tierr poc distnci del mismo, nos hcí pensr en l convenienci de investigr l eficci de repelentes o disusorios pr evitr l puest de ls hembrs y de est mner prevenir el tque de ls lrvs. Y Del Cñizo en los ños 50 postulb l utilizción de insectífugos contr el C. tenebrionis mencionndo experiencis llevds cbo impregnndo los troncos con un mezcl de lquitrán, nftlin y cl viv. En l Agricultur Ecológic está utorizdo el uso de un grn gm de productos repelentes de plgs entre los que se incluyen decocciones de hierbs, extrctos de plnts y minerles y unque muchos de ellos se utilizn de form muy generlizd ún no se h estudido suficientemente su eficci. En el cso de C. tenebrionis no existe ún ningún estudio sobre el efecto que sobre ellos pueden tener este tipo de sustncis. 7

8 Otro producto utorizdo en Agricultur Ecológic e interesnte pr incluir en ests investigciones sobre efectos de repelenci en dultos es el colín, un minerl del tipo de los luminosilictos, de color blnco, no poroso, poco brsivo, de grno fino y con form de lámin, que se dispers fácilmente en gu y es químicmente inerte en un mplio rngo de ph. Además según l bibliogrfí no tiene efectos negtivos sobre l slud humn ni sobre el medio mbiente y el desrrollo de resistenci en los insectos plg es poco probble debido su modo de cción. El myor éxito en control de plgs se h conseguido en el cso de homópteros como l psil del perl y ls plgs del olivo Bctrocer olee (Gmel.) y Prys olee (Ber.), sobre ls que prece demostrr tener un importnte efecto disusorio de l puest. No se sbe muy bien cuál es su mecnismo de cción: según un hipótesis los insectos son incpces de reconocer l plnt u órgno huésped cundo está cubierto con el colín, por otro ldo se cree que los insectos son repelidos debido que l superficie trtd les result desgrdble. El resultdo observdo es un reducción de l limentción y l puest sobre los huéspedes trtdos. Empleo de trmps refugio Según l bibliogrfí un de ls crcterístics de este insecto es su cpcidd de refugirse durnte el invierno, pr retornr su ctividd en primver. En generl en l nturlez, los refugios citdos se encuentrn en el suelo, formdos por hierb sec, piedrs, pils de leñ sec, fisurs del suelo, hojs secs o culquier otro sustrto que le pued dr protección. Est crcterístic permití venturrse l inicio del proyecto por el cmino de l determinción de un refugio trmp en l zon de goteo del árbol, tl y como se hce con otros coleópteros. 2. OBJETIVOS DEL PROYECTO Medinte el presente proyecto se proponí investigr en el desrrollo de diversos métodos de control de l especie comptibles con l Agricultur Ecológic, bordndo el problem desde vrios frentes que se mterilizbn en los siguientes objetivos: OBJETIVO 1. Evlución de brrers físics y repelentes pr l prevención de C. tenebrionis. OBJETIVO 2. Investigción y puest punto de entomoptógenos pr el control biológico de C. tenebrionis. o Reconocimiento y selección de entomoptógenos utóctonos socidos ls poblciones de C. tenebrionis. o Puest punto del control biológico medinte entomoptógenos. OBJETIVO 3. Investigción de l eficci de trmps refugio pr cptur de dultos invernntes. OBJETIVO 4. Estudio de semioquímicos implicdos en el comportmiento de C. tenebrionis. OBJETIVO 5. Difusión de los resultdos. L investigción en cmpos tn diversos h hecho necesri l prticipción coordind de vrios grupos de investigción especilizdos en ls diferentes línes de investigción. Por ello el proyecto se estructur en 4 subproyectos con objetivos específicos: Subproyecto 1 (Lbortorio de Entomologí Agroforestl, INIA) Evlución de brrers físics pr evitr l penetrción de ls lrvs neonts de C. tenebrionis Investigción del uso de repelentes pr evitr l puest de los dultos de C. tenebrionis. Subproyecto 2 (Lbortorio de Entomologí Agroforestl, Deprtmento de Ciencis y Recursos Agrícols y Forestles. Universidd de Córdob) o Investigción y puest punto de entomoptógenos pr el control biológico de C. tenebrionis. 8

9 o Reconocimiento y selección de entomoptógenos utóctonos socidos ls poblciones de C. tenebrionis. o Puest punto del control biológico medinte entomoptógenos (lbortorio). Subproyecto 3 (Servicio de Investigción y Desrrollo Tecnológico. Centro de Investigción l Orden (Bdjoz) Investigción y puest punto de entomoptógenos pr el control biológico de C. tenebrionis. o Prospecciones de entomoptógenos utóctonos en el Comunidd Extremeñ. o Puest punto del control biológico medinte entomoptógenos (evlución en cmpo). Investigción de l eficci de trmps refugio pr cptur de dultos invernntes. Subproyecto 4 (Deprtmento de Químic Inorgánic y Orgánic, Universidd de Jén) Estudio de semioquímicos implicdos en el comportmiento de C. tenebrionis. 3. ACTIVIDADES REALIZADAS Y RESULTADOS 3.1. Evlución de brrers físics y repelentes pr l prevención del tque de C. tenebrionis. (grupo INIA) Recogid de dultos en el cmpo y mntenimiento en el lbortorio A lo lrgo de los tres ños de proyecto se relizron cpturs de dultos de C. tenebrionis pr llevr cbo con ellos los ensyos de lbortorio. Los dultos se cpturron en primver-verno en plntciones de melocotonero, lbricoquero y cerezo en Murci y Extremdur. Los individuos trídos del cmpo se mntenín en cjs ventilds o julones limentándolos con hojs y brotes de membrillero y lmendro, que se cmbibn cd dos o tres dís (Figur 2). En el fondo de ls cjs o julones se colocb tierr tmizd como sustrto de puest.. Ls cjs se mntuvieron en los insectrios del lbortorio de Entomologí del INIA 25ºC y 60%HR, que se modificbn 30ºC y 50%HR cundo se querí ctivr l oviposición. Figur 2. Adultos de Cpnodis tenebrionis en julones de crí con rms de membrillero. 9

10 Ensyos de evlución de brrers físics Pr l fbricción de un brrer físic de fácil instlción en el cmpo y bjo coste se eligió un mteril no tejido bse de un fibr sintétic de polipropileno, Abfor, de uso extendido como membrn de cobertur folir pr prevenir dños por escrch en cultivos hortícols. En estos ensyos se llenbn cjits con tierr tmizd hst l mitd y l membrn -brrer cubiert por completo por otr cp de tierr. En l superficie de ls cjs se depositbn lrvs y/o huevos y se estudib su cpcidd de penetrr l mll durnte un periodo de un semn. En dichos ensyos l fibr Abfor colocd en doble cp no permitió el pso de ningun lrv C. tenebrionis y por tnto se postul como un posible brrer contr ls misms, enterrándol en los lcorques de los árboles. Tbl 1. Eficci de l fibr Abfor como brrer físic pr ls lrvs neonts de C. tenebrionis. Ensyo I: prtiendo de huevos; ensyo II: prtiendo de lrvs L1. Los vlores de un mismo ensyo seguidos de distint letr son diferentes significtivmente (ANOVA, α=0,005) Lrvs que supern l brrer (%) Ensyo I Ensyo II Testigo (gs) 36,5 ± 13,4 47,5 ± 4,3 Fibr Abfor simple 49,2 ± 10,6 35,0 ± 10,2 Fibr Abfor doble - 0,0 ±.0,0 b Ensyos de repelenci/disusión de superficies trtds con colín y/o ceites esenciles En 2009, medinte ensyos de elección y no elección, se estudió el posible efecto repelente y disusorio sobre l oviposición de diferentes sustncis l ser plicds sobre l superficie de puest. Se ensyron los siguientes formuldos: Tbl 2. Productos evludos contr Cpnodis tenebrionis en ensyos de trtmiento de l superficie Producto Dosis Surround WP (Colín) 5 % Esenci de lvnd 0,3 % Surround WP (Colín) + Esenci de lvnd 5% 0.3% Ensyos de elección Se ofrecín los dultos sustrtos de tierr tmizd trtdos y no trtdos (Figur3). El efecto se evluó medinte el índice de repelenci (IR) y el índice disusorio de puest (IDP), según ls siguientes fórmuls: 10

11 IR: 100 x ((ANT-AT)/(ANT+AT)) ANT = Número de dultos en superficie no trtd AT = Número de dultos en superficie trtd IDP: 100 x ((HNT-HT)/(HNT+HT)) HNT = Número de huevos en sustrto no trtdo HT = Número de huevos en sustrto trtdo Figur 3. Izquierd: cjs utilizds en los ensyo de trtmiento de l superficie de puest. Derech: huevos de Cpnodis tenebrionis. Ensyos de no elección : Se colocbn en l cj de ensyo sustrtos de tierr tmizd, todos ellos pulverizdos superficilmente con el mismo repelente cndidto o con gu destild en el control. Figur 4. Resultdos de los ensyos de repelenci/disusión de superficies trtds con colín y/o ceites esenciles. 11

12 Los resultdos de estos ensyos se exponen en l Figur 4. Los más relevntes son los siguientes: - El ceite de lvnd con jbón potásico se comportó como repelente de C. tenebrionis (índice de repelenci del 55.0% ls 2 hors del trtmiento) unque no produjo un disminución significtiv de l puest. - El colín (Surround WP) no mostró efecto repelente pero sí un importnte efecto disusorio sobre l puest (índice disusorio de l puest del 51,3%) Evlución en lbortorio de l repelenci y/o toxicidd de vrios trtmientos sobre l diet nturl y su posible efecto sobre l longevidd y fertilidd de los insectos Se ofrecieron los dultos rms y brotes de membrillero pulverizdos con los productos evlur o con gu. Los productos y dosis utilizdos en estos ensyos fueron: Tbl 3. Productos evludos plicdos en l diet de Cpnodis tenebrionis Nombe comercil Principio ctivo y riquez Dosis Surround WP Colín 5% Jbón de pots 50% Oletbio To esenci de Tomillo rojo 50% 0,3% Align Azdirctin 3.2% 0,15% Los ensyos se relizron en cjs ventilds de plástico en ls que se introducín los dultos y ls rmits trtds y en cuyo fondo se colocb tierr tmizd como sustrto de puest. Se evluó el efecto de los trtmientos sobre l longevidd, l reproducción y l limentción de los dultos, registrndo cd 3-4 dís l mortlidd, el número de huevos puestos por hembr y el mteril vegetl consumido (hojs, peciolos y cortez) Figur 5. Izquierd: cjs utilizds en los ensyo de trtmiento de l diet. Derech: dultos sobre rms de membrillero. En los ensyos de no elección l limentción con rmits trtds con colín (Surround) o con zdirctin (Align) cusó l muerte nticipd de los insectos. A los 10 dís de inicido el trtmiento hbín muerto l totlidd de los trtdos con colín, y los 25 los trtdos con zdirctin. En cmbio, l mortlidd en los trtdos con Oletbio no difirió de l del control sin trtr, que fue de tn solo el 20% lo lrgo de todo el ensyo. Tmbién colín y zdirctin produjeron un reducción muy significtiv del número de huevos puestos por ls hembrs, y l zdirctin disminuyó l cntidd de limento ingerido por los insectos. 12

13 En los ensyos de elección tmbién se observó un disminución de l longevidd de los insectos limentdos con rmits trtds con colín (Surround) y ún mucho más cusd en el cso de los trtdos con zdirctin (Align). En estos ensyos no se observó un clro efecto disusorio de l limentción por prte de estos productos. Se desprende de estos resultdos que el efecto de l zdirctin y el colín sobre los dultos de C. tenebrionis no es repelente sino tóxico o disusorio de l limentción. En otros ensyos efectudos pr estudir l reversibilidd del efecto tóxico de l zdirctin y de un mezcl de ést con colín se observó, que pesr de hber interrumpido l limentción con rmits trtds trs seis de trtmiento, los dultos siguieron muriendo premturmente, unque sobrevivieron lgunos de ellos (<10%). L limentción de los insectos trtdos disminuyó hst los dís trs el trtmiento, pero los pocos insectos que hbín sobrevivido volvieron limentrse Investigción y puest punto de entomoptógenos pr el control biológico de C. tenebrionis. (Grupos de Córdob y Bdjoz) Aislmiento de entomoptógenos (Grupo de Córdob) A prtir de muestrs de suelo Pr l búsqued de ptógenos que puedn ser eficces pr el control de C. tenebrionis, se tomron muestrs de suelo en diferentes locliddes del norte de l provinci de Córdob. Bjo l cop de cd árbol selecciondo se recogí proximdmente 1 kg de suelo tomndo 250 g en cd un de ls cutro orientciones. Ls muestrs se tomron limpindo primero l superficie de hierbs y piedrs y recogiendo después con un plet metálic el suelo de los primeros 10 cm. Ls muestrs se introdujeron en bolss de plástico trnsprente y se llevron l lbortorio en donde se mntuvieron en cámr frigorífic 4ºC hst que se procedió l islmiento de los hongos medinte l trmp Glleri. Pr ello en el Lbortorio de Entomologí Agroforestl se estbleció un poblción de l especie Glleri mellonell que se crí de form continud en condiciones de insectrio medinte un modificción del método descrito por Dutky et l. (1962). Pr l obtención de entomoptógenos con l trmp Glleri se siguió el método propuesto por Zimmermnn (1986) con lguns modificciones. El procedimiento fue el siguiente: - Ls muestrs de suelo se extienden sobre ppel de filtro y se homogeneizron, eliminndo piedrs, ríces y elementos gruesos. - El suelo se crib en tmiz de 5 mm de luz. - De cd muestr se tom un cntidd de entre g que se introduce en un bote de plástico de 15 cm de ltur y 11 cm de diámetro con tp perford pr permitir l ireción. - En cd bote se introducen 25 lrvs de G. melonell que se encuentrn l finl de su desrrollo. - Los botes se cierrn y se llevn l insectrio (tempertur: C; 60-65% de humedd reltiv y fotoperiodo de 16 hors de luz, 8 de oscuridd) donde se mntienen 8 dís. - Cd dí, los botes son voltedos con el fin de que ls lrvs, que tienden subir l superficie, se muevn constntemente trvés del suelo, umentndo sí l posibilidd de quedr infectds por orgnismos ptógenos que se encuentren en el suelo. - Termindo el periodo de 8 dís, ls lrvs se recogen de los botes, preciendo muchs de ells muerts. - Ls lrvs son trnsferids un cámr húmed durnte 8 dís tempertur de 28-30ºC pr celerr el desrrollo de los hongos entomoptógenos que estén infectndo ls lrvs. 13

14 Con ls lrvs que precín muerts y momificds por los hongos se procedió l islmiento del ptógeno utilizndo el medio de cultivo dptdo por Kessler et l. (2003) con lguns modificciones. Se hn obtenido medinte este procedimiento un totl de 43 isldos de hongos entomoptógenos: 27 de Beuveri bssin, 14 de Metrrhizium nisoplie y 2 de Pecilomyces spp. (Figur 13). Tmbién se hn encontrron nemtodos entomoptógenos en lguns de ls muestrs de suelo recogids. Los nemtodos hn sido multiplicdos en el lbortorio sobre lrvs de G. mellonell siguiendo l técnic de Woodring y Ky (1988). Figur 13. Porcentjes de muestrs de suelo con presenci de los distintos hongos isldos con l trmp Glleri prtir de muestrs de suelo de dehess del norte de l provinci de Córdob. A prtir de muestrs de Cpnodis tenebrionis. Se exminron dultos muertos (mchos y hembrs) de C. tenebrionis, envidos por el grupo dei INIA. Dichos ejemplres fueron desinfectdos previmente sumergiéndolos en un solución de hipoclorito sódico l 1% durnte 5 minutos, posteriormente se lvron en gu destild y se introdujeron en un cámr húmed durnte 8 dís. Trnscurrido este tiempo se observron los ejemplres pr detectr presenci de crecimiento de estructurs fúngics. De los 237 dultos de C. tenebrionis procesdos no se obtuvo ningún isldo Obtención de los inóculos purificdos pr l relizción de ensyos (Universidd de Córdob) Los isldos de B. bssin procedentes de ls muestrs de suelo se multiplicron con objeto de obtener suspensiones cuoss de conidis pr usr en los bioensyos de ctividd insecticid. L multiplicción se relizó medinte cultivo en plcs 28ºC en Sburud Mlt Agr (SMA) enriquecido con levdur l 2% Ls conidis resultntes se recogen medinte rspdo de ls plcs con gu destild estéril y mojnte (Tween 80) l 0,1% L suspensión se centrifug dos veces durnte 15 minutos 5000 rpm pr eliminr posibles exotoxins. El precipitdo resultnte se resuspende con un mínim cntidd de gu destild estéril y se gurd en cámr frigorífic 4 ºC. L concentrción de conidis por unidd de volumen, de determin medinte recuento en un hemtocímetro o cámr de Neubuer utilizndo el microscopio óptico. Adicionlmente, pr lmcenmiento lrgo plzo de los isldos, ls suspensiones cuoss de conidis se depositron en tubos con ren fin esterilizd. Todos los isldos se hn ñdido l Colección de isldos de hongos entomoptógenos del Lbortorio de Entomologí Agroforestl, lo que signific disponer de un mpli diversidd de genotipos con objeto de seleccionr con éxito los más infectivos. 14

15 Bioensyos de ctividd insecticid de isldos de Beuveri bssin (Grupo Universidd de Córdob) Durnte 2010 y 2011 se hn relizdo los experimentos con isldos de B. bssin, pertenecientes l Colección de entomoptógenos del Lbortorio de Entomologí Agroforestl. Ests pruebs se relizron sobre lepidópteros y coleópteros, con el fin de detectr los isldos de myor potencil insecticid. Los bioensyos se llevron cbo en ls condiciones de insectrio. En primer lugr se relizron pruebs de infectividd que consistieron en l plicción tópic sobre el insecto de un suspensión de conidis. Todos los isldos se plicron l mism concentrción (5x10 7 conidis/ml) pr poder comprrlos entre sí. Pr cd isldo y especie se dispusieron grupos de lrvs o dultos (según l especie) en cjs individules de 3 cm de diámetro y 1,5 cm de ltur. L plicción del inóculo se relizó depositndo con un micropipet un got de volumen conocido en el dorso de cd individuo. A los testigos se les plicó un mezcl de gu destild con mojnte. Trnscurridos unos minutos, se les limentó introduciendo diet en cd un de ls cjs, que se cerrbn con tpder sin perforr pr mntener un humedd propici pr el desrrollo del hongo. Los ensyos se revisron dirimente, ñdiendo limento fresco y llevndo un control del número de individuos muertos y l fech de mortlidd. Los ejemplres muertos se trnsfirieron cámrs húmeds pr fvorecer el desrrollo del hongo. Trnscurridos 4-8 dís los individuos muertos por l infección del hongo precen cubiertos del micelio blnco crcterístico. Finlmente, se confirmb que l muerte de l lrv fue cusd por B. bssin, medinte l observción l microscopio de ls estructurs fúngics que recubrín el cuerpo del insecto. En lepidópteros. Con un totl de 12 isldos se hn relizdo ensyos sobre lrvs de G. melonell (procedentes de l poblción de crí en insectrio). Prlelmente se relizron ensyos sobre otros lepidópteros: lrvs de Ctocl spp., Dryobotodes spp., Dryobot lbecul y Cydi splendn. De los resultdos de los trtmientos con 12 isldos selecciondos, se concluye que todos ellos fueron infectivos en ls especies de lepidópteros utilizds, pero con importntes diferencis pr un mism especie hospeddor. El orden de ctividd de los isldos en lrvs de G. mellonell se correspondió bstnte bien con l ctividd sobre ls otrs especies de lepidópteros. En prticulr, ls pruebs sobre G. melonell permite detectr tnto los isldos que vn presentr myor infectividd como los de infectividd muy bj. En coleópteros. En 2010 se estbleció un poblción de Tenebrio molitor que h sido mntenid con slvdo de trigo siguiendo l metodologí descrit por Wever y McFrlne (1990). A prtir de est poblción se hn relizdo bioensyos de ptogenicidd sobre lrvs y dultos de est especie. Prlelmente se relizron ensyos con otros coleópteros: Curculio elephs y Gllerucell luteoll, procedentes de muestreos en poblciones de cmpo. L ctividd de los isldos sobre coleópteros mostró much más bj infectividd que sobre lepidópteros, con solo 4 isldos con efecto insecticid significtivo. Estos isldos fueron dos procedentes de muestrs de suelo (Refs. 14 y 31), uno de Rhynchophorus ferrugineus (Ref. Rf) y el otro de Curculio elephs (Ref. C1). En Cpnodis tenebrionis Los resultdos nteriores hn servido pr seleccionr un grupo de isldos con myor poder insecticid, los cules se están probndo medinte bioensyos de ctividd biológic sobre C. tenebrionis. Se hn relizdo bioensyos de infectividd sobre los dultos de C. tenebrionis procedentes de plntciones frutles de l loclidd de Plm del Río (Córdob) en los meses de Julio, Agosto y Septiembre. Se hn llevdo cbo dos tipos de bioensyos: 1) Comprción de l infectividd entre isldos, utilizndo l metodologí y indicd pr los ensyos con ls otrs especies. 15

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