Qué problemas se nos presentan actualmente en el diagnóstico de laboratorio de hepatitis B?

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Ángel Navarrete Campos
hace 6 años
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1 Mutantes HBV

2 Qué problemas se nos presentan actualmente en el diagnóstico de laboratorio de hepatitis B?

3 Ciertos resultados de laboratorio pueden generar dudas respecto de su veracidad. Pacientes con marcadores Anticuerpos Anti HBs Ag y Hbs Ag positivos Pacientes con Anticuerpos Anti HBs Ag positivos y DNA HBV positivos Donantes con serología negativa para AgHBs en bancos de sangre y HBV DNA positivo

4 Que son las mutaciones? Las mutaciones constituyen un acontecimiento natural que ocurre durante la replicación viral en donde los cambios de ácidos nucleicos puede traducirse en cambios en la secuencia de amino ácidos en la proteína. Esto se debe a la alta tasa de replicación y a la baja fidelidad de la polimerasa viral, debido a que carece de proof reading

5 Mutante Región mutada Mutaciones del HBV Mecanismo Agente Oportunidad Frecuencia E menos Gen precore Presión inmune (selección) Respuesta natural IFN o Infección crónica Frecuente Superficie Gen S Presión HBIg o Inmunización Muy poco inmune Vacuna en alta frecuente (escape) endemicidad YMDD Gen pol Terapéutica (resistencia) LAM Infección crónica Frecuente Métodos: para cada una de ellas, pueden utilizarse diferentes métodos (LiPA, PCR primer específica, PCR/hibridación específica, etc.) pero el método de referencia es la secuenciación de la región genómica específica. (Pawlotsky, Gastroenterology 2002;22: ) 1568) HOSPITAL ITALIANO - LABORATORIO CENTRAL - BIOLOGIA MOLECULAR

6 Mutantes de escape HBsAg se han reportado e identificado como tales en la literatura desde No tienen distribución geografica especifica Oon y col. Mencionan una tasa de mutantes de escape del 4.6% (16 de 345) en neonatos vacunados nacidos de madres positivas para HBsAg. El porcentaje de re-infecion debido a mutantes de escape por inmunoprofilaxis (HBIG) en tranplansplantados hepáticos presenta un rango entre el 8.3% y el 57%.

7 Kalinina y col. Reportó la primera evidencia que mutantes en el gen S HBV como causa de una hepatitis fulminante. Este fenomeno pudo haber disparado la muerte celular provocando la falla hepática. La mutación Gly 145 Arg fue una de las implicadas en este caso. Kalinina, et al A Dominant Hepatitis B Virus Population Defective in Virus Secretion Because of Several S-Gene Mutations from a Patient With Fulminant Hepatitis. Hepatology 34:

9 Wild-type gly at 145 Modelo de HsAg de Chen et al Proc. Natl. Acad. Sci. 93:

10 Mutant arg at 145

11 Mutantes de Escape más frecuentes? EL cluster de mutante HBsAg más común está presente entre los aa La de mayor prevalencia esta reportada en gly-145- arg en el segundo loop del determinante a del HBsAg. Otras menos frecuentes que se encuentran externas al doble loop o dentro del mismo son: Thr1126-Ser ; Met133-Leu; Asp 144- Ala; Gln129-His

12 Importancia clínica Las variantes de escape a la vacuna en los amino ácidos 144/145 puede establecer infecciones persistentes en niños. Cuando se compara pacientes transplantados de hígado infectados predominantemente con HBV salvaje con los infectados con mutantes de escape HBsAg (aa144/145), estos últimos presentan un curso clínico menos favorable y una sobrevida menor del graft Locarnini, S. A Hepatitis B Virus Surface Antigen and Polymerase Gene Variants: Potential Virological and Clinical Significance. Hepatology 27:

13 El 90% de los neonatos infectados con HBV serán portadores crónicos, con un porcentaje de mortalidad que oscila entre el % EL CDC estima que 22,000 madres positivas EL CDC estima que 22,000 madres positivas HBV que dan a luz,el porcentaje de mutantes de escape para HBsAg esta entre el % Por lo tanto el potencial de mutantes en esta poblaciónde recien nacidos estaría entre por año.

14 ATENCION EN... Individuos que solo presentan serologia positiva para Ac. anti HBc Pacientes con HBsAg y Anti HBsAg positivos Severa inmunosupresión en pacientes con Ac. anti HBsAg Resultados discordantes de HBsAg con diferentes ensayos Resultados serológicos como HBeAg positivo y HBsAg negativo Indicación: solicitar DNA HBV por PCR y en lo posible secuenciación del loop del HBsAg

15 Detección de DNA HBV positivo por NAT y HBsAg con resultado negativo o divergente en bancos de sangre Implicancia:» evitar la donación» realizar estudios para mutación» seguimiento clínico del donante

16 EVOLUCION DE MEDICINA TRANSFUSIONAL

17 Pilares Básicos Screening de Donantes Transfusion Segura Test NAT & Test Serologicos Perspectives in Health Vol. 10, No

18 Por que usar NAT en Bancos de Sangre NAT PCR es positivo antes que la serología Reduce el riesgo de transmitir infecciones Elimina los costos en salud para el diagnóstico y tratamiento de los mismos Mejora la confianza en la seguridad de las bolsas a transfundir

19 Ventajas : Marcadores negativos en el periodos de ventana Immunovariantes de cepas virales no detectatos por los test serologicos Chequeo de los procedimientos serologicos y viceversa. BUSCH, JAMA 289(8):

20 NAT HBV? HbsAg esta ausente en: Disminución de la replicación y síntesis de proteínas de HBV posterior a coinfección con HCV Mutaciones en el dominio de la polimerasa que resultan en una ineficiente replicación HBsAg presente pero no detectable Presencia de inmunocomplejos circulantes Mutaciones en el loop hidrofilico mayor

21 HBV Replicación H B V - D N A ( c o p i e s / m l ) 1,00E+10 1,00E+09 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 1,00E Days after infection 1 0,1 H B s A g ( n g / m l ) Replicación : 2.56 días Periodo de Ventana- Ag/AB : 56 días Periodo de Ventana -NAT : 30 días ASSAL, TRANSFUSION 2009; 49 :

22 Riesgo Estimado de Transmitir HBV HBV 1 : ( )

23 Reducción estimada del riesgo de transmisión por transfuciones HBV, por implementación de NAT Ventana estimada Reduccion Riesgo Estimado (Días ) % x 10 6 donations (95% CI) EIA NAT HBV ( )

24 Metodologías disponibles PROCLEIX TIGRIS Novartis Cobas AmpliScreen y Cobas Taq Screen MPX Roche

25 En nuestro laboratorio Se corre la serologia y NAT en forma conjunta NAT : Pooles de 6 bolsas o inferiores El procesamiento dura 8 hs. Se realizan análisis de correlación entre serologia y NAT Repiticiones se realizan al día siguiente

26 Nuestra experiencia... COBAS AMPLISCREEN HCV HIV HBV

27 COBAS Amplicor Autoanalizer Amplificación y Detección Automatizada

resultados negativos son verdaderos AMPERASA Especificamente detecta y

28 Integridad de los Resultados Internal control /Estandart Cuantificado Demuestra que la amplificación ha ocurrido en cada muestra Asegura que los resultados negativos son verdaderos AMPERASA Especificamente detecta y destruye todo acido nucleico amplificado previamente sin afectar el target que uno desea amplificar

29 Resultados

30 Validación Ampliscreen Resultados: Correlación del 100%

31 Sensiblidad Roche : limite de deteccion son 5 UI/ml o 30 copias/ml

32 Sensibilidad Analítica 2 Muestra : 18 UI/ml

33 Repeticiones

34 Correlación

35 Muchas gracias por su atención. hospitalitaliano.org.ar

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